Utilizando as técnicas de imunoistoquímica e densitometria óptica, foi investigada a localização e a expressão da proteína c-Fos no SNC do caracol Megalobulimus abbreviatus. Neurônios imunorreativos foram encontrados nos gânglios cerebrais, pedais, parietal direito e visceral de caracóis submetidos ao estímulo térmico aversivo (50oC), e sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12, 18 e 24 h) após a estimulação. A análise da imunorreatividade à c-Fos através do método de medida da densidade óptica (DO) revelou uma diferença significativa no sentido de apresentar uma maior expressão (p<0,05) na área do lobo pedal do pós-cérebro do gânglio cerebral em relação às outras regiões analisadas no mesmo gânglio (mesocérebro, pró-cérebro e lobo pleural do pós-cérebro). Além disso, também houve expressão significativamente maior (p<0,05) quando comparada a densitometria da região do mesocérebro em relação ao lobo pleural do pós-cérebro nos grupos controle, 3h e 18h. O lobo pleural do pós-cérebro apresentou uma expressão significativamente menor (p<0,05) na imunorreatividade da proteína c-Fos quando comparado ao pró-cérebro em animais sacrificados 12h e 24h após e estímulo aversivo. Em relação ao grupo controle, a DO da proteína c-Fos não variou nos diferentes tempos de sacrifício quando comparada a mesma região do gânglio (cerebral, pedal, parietal direito ou visceral) ao longo do tempo na maioria das regiões. A única diferença estatisticamente significativa (p<0,05) foi encontrada no mesocérebro do gânglio de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, mostrando uma diminuição da imunorreatividade. Nos animais tratados com salina (1ml) ou morfina (20mg/kg) 15 min antes do estímulo térmico aversivo, os mesmos grupos neuronais nos gânglios do SNC de M. abbreviatus mostraram imunomarcação à proteína c-Fos. Em relação ao grupo controle, observou-se uma expressão significativamente menor (p<0,01) na DO da imunorreatividade da proteína c-Fos nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos animais sacrificados 3 h e 6 h após o estímulo térmico aversivo. No momento em que a comparação foi feita entre os grupos salina e morfina de animais sacrificados ao mesmo tempo, na grande maioria dos grupos observou-se uma diminuição na imunorreatividade da proteína c-Fos. Esta diferença, porém, mostrou-se significativa (p<0,01) no mesocérebro de animais do grupo 3h, no lobo pedal do pós cérebro de animais dos grupos 3 h, 6 h e 18 h, nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos grupos 6 h e 12 h, nos neurônios mediais do gânglio pedal do grupo 3 h, nos neurônios posteriores do gânglio pedal do grupo 6 h, nos neurônios da região anterior do gânglio parietal direito no grupo 12 h e nos neurônios do gânglio visceral no grupo experimental 12 h. A diferença na DO da proteína c-Fos apresentou uma diminuição extremamente significativa (p<0,001) nos neurônios mediais do gânglio pedal de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, nos neurônios posteriores do gânglio pedal dos animais sacrificados 12 h após o estímulo e nos neurônios do gânglio visceral dos animais do grupo experimental 6 h. A partir destes dados e da correlação com estudos realizados em M. abbreviatus para detecção de mediadores químicos envolvidos na nocicepção, podemos concluir que as áreas imunorreativas que apresentaram estas variações na densidade óptica da imunorreatividade à proteína c-Fos em diferentes tempos de sacrifício e tratamento com morfina estão envolvidas no processo nociceptivo neste caracol.

Utilizando as técnicas de imunoistoquímica e densitometria óptica, foi investigada a localização e a expressão da proteína c-Fos no SNC do caracol Megalobulimus abbreviatus. Neurônios imunorreativos foram encontrados nos gânglios cerebrais, pedais, parietal direito e visceral de caracóis submetidos ao estímulo térmico aversivo (50oC), e sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12, 18 e 24 h) após a estimulação. A análise da imunorreatividade à c-Fos através do método de medida da densidade óptica (DO) revelou uma diferença significativa no sentido de apresentar uma maior expressão (p<0,05) na área do lobo pedal do pós-cérebro do gânglio cerebral em relação às outras regiões analisadas no mesmo gânglio (mesocérebro, pró-cérebro e lobo pleural do pós-cérebro). Além disso, também houve expressão significativamente maior (p<0,05) quando comparada a densitometria da região do mesocérebro em relação ao lobo pleural do pós-cérebro nos grupos controle, 3h e 18h. O lobo pleural do pós-cérebro apresentou uma expressão significativamente menor (p<0,05) na imunorreatividade da proteína c-Fos quando comparado ao pró-cérebro em animais sacrificados 12h e 24h após e estímulo aversivo. Em relação ao grupo controle, a DO da proteína c-Fos não variou nos diferentes tempos de sacrifício quando comparada a mesma região do gânglio (cerebral, pedal, parietal direito ou visceral) ao longo do tempo na maioria das regiões. A única diferença estatisticamente significativa (p<0,05) foi encontrada no mesocérebro do gânglio de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, mostrando uma diminuição da imunorreatividade. Nos animais tratados com salina (1ml) ou morfina (20mg/kg) 15 min antes do estímulo térmico aversivo, os mesmos grupos neuronais nos gânglios do SNC de M. abbreviatus mostraram imunomarcação à proteína c-Fos. Em relação ao grupo controle, observou-se uma expressão significativamente menor (p<0,01) na DO da imunorreatividade da proteína c-Fos nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos animais sacrificados 3 h e 6 h após o estímulo térmico aversivo. No momento em que a comparação foi feita entre os grupos salina e morfina de animais sacrificados ao mesmo tempo, na grande maioria dos grupos observou-se uma diminuição na imunorreatividade da proteína c-Fos. Esta diferença, porém, mostrou-se significativa (p<0,01) no mesocérebro de animais do grupo 3h, no lobo pedal do pós cérebro de animais dos grupos 3 h, 6 h e 18 h, nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos grupos 6 h e 12 h, nos neurônios mediais do gânglio pedal do grupo 3 h, nos neurônios posteriores do gânglio pedal do grupo 6 h, nos neurônios da região anterior do gânglio parietal direito no grupo 12 h e nos neurônios do gânglio visceral no grupo experimental 12 h. A diferença na DO da proteína c-Fos apresentou uma diminuição extremamente significativa (p<0,001) nos neurônios mediais do gânglio pedal de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, nos neurônios posteriores do gânglio pedal dos animais sacrificados 12 h após o estímulo e nos neurônios do gânglio visceral dos animais do grupo experimental 6 h. A partir destes dados e da correlação com estudos realizados em M. abbreviatus para detecção de mediadores químicos envolvidos na nocicepção, podemos concluir que as áreas imunorreativas que apresentaram estas variações na densidade óptica da imunorreatividade à proteína c-Fos em diferentes tempos de sacrifício e tratamento com morfina estão envolvidas no processo nociceptivo neste caracol.

Utilizando as técnicas de imunoistoquímica e densitometria óptica, foi investigada a localização e a expressão da proteína c-Fos no SNC do caracol Megalobulimus abbreviatus. Neurônios imunorreativos foram encontrados nos gânglios cerebrais, pedais, parietal direito e visceral de caracóis submetidos ao estímulo térmico aversivo (50oC), e sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12, 18 e 24 h) após a estimulação. A análise da imunorreatividade à c-Fos através do método de medida da densidade óptica (DO) revelou uma diferença significativa no sentido de apresentar uma maior expressão (p<0,05) na área do lobo pedal do pós-cérebro do gânglio cerebral em relação às outras regiões analisadas no mesmo gânglio (mesocérebro, pró-cérebro e lobo pleural do pós-cérebro). Além disso, também houve expressão significativamente maior (p<0,05) quando comparada a densitometria da região do mesocérebro em relação ao lobo pleural do pós-cérebro nos grupos controle, 3h e 18h. O lobo pleural do pós-cérebro apresentou uma expressão significativamente menor (p<0,05) na imunorreatividade da proteína c-Fos quando comparado ao pró-cérebro em animais sacrificados 12h e 24h após e estímulo aversivo. Em relação ao grupo controle, a DO da proteína c-Fos não variou nos diferentes tempos de sacrifício quando comparada a mesma região do gânglio (cerebral, pedal, parietal direito ou visceral) ao longo do tempo na maioria das regiões. A única diferença estatisticamente significativa (p<0,05) foi encontrada no mesocérebro do gânglio de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, mostrando uma diminuição da imunorreatividade. Nos animais tratados com salina (1ml) ou morfina (20mg/kg) 15 min antes do estímulo térmico aversivo, os mesmos grupos neuronais nos gânglios do SNC de M. abbreviatus mostraram imunomarcação à proteína c-Fos. Em relação ao grupo controle, observou-se uma expressão significativamente menor (p<0,01) na DO da imunorreatividade da proteína c-Fos nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos animais sacrificados 3 h e 6 h após o estímulo térmico aversivo. No momento em que a comparação foi feita entre os grupos salina e morfina de animais sacrificados ao mesmo tempo, na grande maioria dos grupos observou-se uma diminuição na imunorreatividade da proteína c-Fos. Esta diferença, porém, mostrou-se significativa (p<0,01) no mesocérebro de animais do grupo 3h, no lobo pedal do pós cérebro de animais dos grupos 3 h, 6 h e 18 h, nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos grupos 6 h e 12 h, nos neurônios mediais do gânglio pedal do grupo 3 h, nos neurônios posteriores do gânglio pedal do grupo 6 h, nos neurônios da região anterior do gânglio parietal direito no grupo 12 h e nos neurônios do gânglio visceral no grupo experimental 12 h. A diferença na DO da proteína c-Fos apresentou uma diminuição extremamente significativa (p<0,001) nos neurônios mediais do gânglio pedal de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, nos neurônios posteriores do gânglio pedal dos animais sacrificados 12 h após o estímulo e nos neurônios do gânglio visceral dos animais do grupo experimental 6 h. A partir destes dados e da correlação com estudos realizados em M. abbreviatus para detecção de mediadores químicos envolvidos na nocicepção, podemos concluir que as áreas imunorreativas que apresentaram estas variações na densidade óptica da imunorreatividade à proteína c-Fos em diferentes tempos de sacrifício e tratamento com morfina estão envolvidas no processo nociceptivo neste caracol.

Doctor of Philosophy (PhD) / The investigation into the relationship between neural plasticity in the rat forebrain associated with opiate-induced behaviours yielded two major results. The major finding of the functional neuroanatomy of acute morphine dependence was that doses of naloxone that induced hyperalgesia following a brief exposure to morphine, in previously drug-naïve rats, caused a specific induction of the inducible transcription factor (itf) proteins c-Fos and zif268 in the extended amygdala. Moreover, doses of naloxone that caused a simple reversal in morphine analgesia failed to induce itf proteins in these same brain regions. This increase in itf proteins was specific to regions of the extended amygdala that receive and process nociceptive information relayed via the spino-parabrachio-amygdaloid pathway and was not observed in other regions that are involved in supraspinal pain modulation such as the rostral ventromedial medulla and the periaqueductal gray. We also found that acute morphine increased c-Fos protein in the basolateral amygdala and the major output nucleus of the central amygdala the medial subdivision. Acute morphine also up-regulated c-Fos protein in striatal, midbrain, and hypothalamic nuclei. A unique finding of the current study was that prolonged exposure to morphine was required to induce c-Fos in these brain regions, as the subsequent administration of naloxone 30-minutes after morphine either reversed or blocked this induction. These results indicate the potential role of the amygdala in analgesia following systemic morphine and in pain facilitation during acute morphine abstinence. Investigation into the neurons and circuitry that undergo long-term neuroplasticity in response to repeated morphine exposure revealed that network-level changes in the distribution of Fos protein in the nucleus accumbens and striatum predicted both tolerance to catalepsy and psychomotor sensitisation. Drug-naïve rats became profoundly cataleptic following morphine, an effect that rats with a drug-history became tolerant. Rats with a history of morphine exposure showed an increase in stereotyped behaviours compared to drug-naïve rats. The major finding of this study was that a shift in the induction of c-Fos protein from a matrix predominance in drug-naïve rats toward a patch predominance in drug-sensitised rats in the accumbens core predicted both tolerance to catalepsy and sensitisation of oral stereotyped behaviours. Acute injection of morphine in a drug-naïve rat induced catalepsy and increased the number of c-Fos-positive neurons in matrix striatopallidal projection neurons of the rostral accumbens core. An increase in activity of striatopallidal projection neurons, which give rise to the indirect pathway, could potentially increase inhibitory drive to the pedunculopontine nucleus (PPN). The PPN, long known as a site of termination for basal ganglia output, is thought to direct the outflow of incentive-motivational and sensorimotor information from the nucleus accumbens to pons, medullary, and spinal cord nuclei translating the incentive impact of the stimuli into appropriate motor, autonomic and emotive responses (Winn et al., 1997). Inhibition of this nucleus would cause the animal to be unable to initiate a movement and in effect lock up, which is precisely what cataleptic postures look like. In contrast c-Fos-positive neurons were decreased in the rostral matrix and increased in patch striatonigral projection neurons along the rostro-caudal extent of the accumbens core when morphine was administered to drug-sensitised rats. Striatonigral neurons located in the patch give rise to the direct pathway innervating the dopaminergic neurons in both substantia pars compacta and the dopamine rich islands in the substantia nigra pars reticulata (Berendse et al., 1992; Gerfen, 1992; Furuta et al., 2002). Activity of this pathway is thought to be involved in the initiation of movement (Gerfen, 1992; Gerfen and Wilson, 1996), however, when this pathway is overstimulated as is the case when morphine is injected in drug-sensitised rats this could potentially cause increased activity of PPN neurons leading to repetitive psychomotor behaviours or stereotypy. This data adds to the growing body of evidence that suggests that long-term neuroadaptations induced by drugs of abuse including morphine that lead to behavioural sensitisation involves the circuitry that includes the nucleus accumbens.

Estímuls estressants bàsicament emocionals, com la immobilització en taula (IMO), exerceixen efectes a llarg termini sobre l'activitat de l'eix hipotalàmic-pituïtari-adrenal (HPA) en rates adultes. Aquests efectes es caracteritzen per una desensibilització, primer a nivell perifèric (d'adrenocorticotropina (ACTH) y de corticosterona al cap d'uns dies) i més tard a nivell central (d'mRNA de corticoliberina (CRF) en el nucli paraventricular de l'hipotàlem (PVN) al cap d'unes setmanes), de la resposta d'aquest eix endocrí quan s'exposen els animals per segona vegada al mateix estrès. Aquest fenomen presenta força similituds amb l'anomenada síndrome d'estrès post-traumàtic en humans, i podria emmarcar-se dins del concepte general de plasticitat sinàptica.Les preguntes que es pretengueren respondre amb aquest treball foren les següents: (i) es poden generalitzar aquests efectes a un estrès físic-immune com l'administració de lipopolisacàrid bacterià (LPS)?, (ii) és el fenomen específic de l'estímul aplicat?, (iii) té el fenomen un correlat en l'activitat transcripcional primerenca en el PVN?, i (iv) quines són les àrees cerebrals sensibles a una experiència prèvia amb estrès?.S'utilitzaren rates mascle adultes de la soca Sprague-Dawley, que s'estressaren només dues vegades per IMO o LPS, separades en el temps entre 1 i 4 setmanes. S'analitzaren en plasma ACTH i corticosterona per radioimmunoanàlisi, i factor de necrosi tumoral (TNF)-a per ELISA. Es van mesurar els nivells d'mRNA de c-fos, CRF i receptor de glucocorticoides (GR) i d'hnRNA de CRF i vasopressina (AVP) per hibridació in situ.L'LPS reduí la resposta de l'mRNA de CRF en el PVN al mateix estímul 4, però no 2, setmanes més tard; la resposta perifèrica, així com la del TNF-a, també fou menor, tant 1 com 4 setmanes més tard. L'LPS bloquejà la hipotèrmia per LPS 4 setmanes més tard. No s'observà desensibilització creuada entre IMO i LPS en cap dels paràmetres de l'eix HPA estudiats. La IMO prèvia reduí la resposta de l'mRNA de c-fos a la IMO en el PVN, tant 1 com 4 setmanes més tard, així com la de l'hnRNA de CRF només a les 4 setmanes. S'observaren efectes similars amb LPS a nivell de l'mRNA de c-fos, però no d'hnRNA de CRF, a les 4 setmanes. La IMO o l'LPS previs no van alterar la resposta de l'hnRNA d'AVP al mateix estímul. En general, no s'observaren efectes creuats consistents entre LPS i IMO a nivell d'hnRNA de CRF o de AVP, o d'mRNA de c-fos en el PVN. La IMO o l'LPS no van modificar els nivells basals d'mRNA de GR a la formació hipocampal i al PVN 4 setmanes després.El patró d'activació cerebral de l'mRNA de c-fos per IMO o LPS fou diferent. Les àrees cerebrals sensibles a la IMO prèvia foren la divisió ventral del septum lateral, el PVN, l'amígdala medial, la divisió medial ventral del nucli de l'estria terminal (BST), el locus coeruleus (LC) i el nucli del tracte solitari. En el cas de l'LPS, aquestes àrees foren el PVN, l'amígdala central, la divisió lateral del BST i el LC.Dels resultats obtinguts es desprèn que els efectes a llarg termini de l'estrès es poden generalitzar a estímuls de naturalesa física-immune com l'LPS. A més, el fenomen sembla ser específic de l'estímul aplicat i es detecta també en l'activitat transcripcional primerenca en el PVN. Finalment, postulem que les estructures cerebrals més probablement responsables dels efectes a llarg termini de l'estrès serien àrees del sistema límbic com l'amígdala i el BST. / Estímulos estresantes básicamente emocionales, como la inmovilización en tabla (IMO), ejercen efectos a largo plazo sobre la actividad del eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) en ratas adultas. Estos efectos se caracterizan por una desensibilización, primero a nivel periférico (de adrenocorticotropina (ACTH) y de corticosterona después de unos días) y más tarde a nivel central (de mRNA de corticoliberina (CRF) en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) después de unas semanas), de la respuesta de este eje endocrino cuando se expone a los animales al mismo estrés por segunda vez. Este fenómeno presenta similitudes con el síndrome de estrés post-traumático en humanos, y podría enmarcarse dentro del concepto general de plasticidad sináptica. Las preguntas que se pretendieron responder en este trabajo fueron: (i) ¿se pueden generalizar estos efectos a un estrés físico-inmune como la administración de lipopolisacárido bacteriano?, (ii) ¿es el fenómeno específico del estímulo aplicado?, (iii) ¿se correlaciona el fenómeno con la actividad transcripcional temprana en el PVN?, y (iv) ¿cuáles son las áreas cerebrales sensibles a una experiencia previa con estrés? Se utilizaron ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley, que se estresaron solo en dos ccasiones por IMO o LPS, separadas en el tiempo entre 1 y 4 semanas. Se analizaron en plasma ACTH y corticosterona por radioinmunoanálisis, y factor de necrosis tumoral (TNF)-a mediante ELISA. Se determinaron los niveles de mRNA de c-fos, CRF y receptor de glucocorticoides (GR) y de hnRNA de CRF y vasopresina (AVP) por hibridación in situ. El LPS redujo la respuesta del mRNA de CRF en el PVN al mismo estímulo 4, pero no 2, semanas más tarde; la respuesta periférica y la del TNF-a también fue menor, tanto 1 como 4 semanas más tarde. El LPS bloqueó la hipotermia por LPS 4 semanas más tarde. No se observó desensibilización cruzada entre IMO y LPS en ninguno de los parámetros del eje HPA estudiados. La IMO previa redujo la respuesta del mRNA de c-fos a la IMO en el PVN, tanto 1 como 4 semanas después, y la del hnRNA de CRF a las 4 semanas. Se observaron efectos similares con LPS a nivel del mRNA de c-fos, pero no de hnRNA de CRF, a las 4 semanas. La IMO o el LPS previos no alteraron la respuesta del hnRNA de AVP al mismo estímulo. En general, no se observaron efectos cruzados consistentes entre IMO y LPS a nivel de hnRNA de CRF o de AVP, o de mRNA de c-fos en el PVN. La IMO o el LPS no modificaron los niveles basales de mRNA de GR en la formación hipocampal y en el PVN 4 semanas después. El patrón de activación cerebral del mRNA de c-fos por IMO o LPS fué distinto. Las áreas cerebrales sensibles a la IMO previa fueron la división ventral del septum lateral, el PVN, la amígdala medial, la división medial ventral del núcleo de la estría terminal (BST), el locus coeruleus (LC) y el núcleo del haz solitario. En el caso del LPS, estas áreas fueron el PVN, la amígdala central, la división lateral del BST y el LC. De los resultados obtenidos se desprende que los efectos a largo plazo del estrés se pueden generalizar a estímulos de naturaleza física-inmune como el LPS. Además, el fenómeno parece específico del estímulo aplicado y se detecta también en la actividad transcripcional temprana en el PVN. Finalmente, postulamos que las estructuras cerebrales más probablemente responsables de los efectos a largo plazo del estrés serían áreas del sistema límbico como la amígdala y el BST. / Emotional stressors, such as immobilisation (IMO), can exert long-term effects on the hypothalamic-pituitary-axis (HPA) activity in adult rats. These effects are characterised by a peripheral (adrenocorticotropin (ACTH) and corticosterone, days later) and central (corticotropin-releasing factor (CRF) in the PVN, weeks later) desensitisation of the response of this endocrine axis when the animals are submitted to the same stressor a second time. This phenomenon shares some commonalities with posttraumatic stress disorder in humans, and might fall within the framework of neuroplasticity.The aims of this work attempted to adress the following questions: (i) can this effects be generalised to stressors of physical-immunological nature such as lipopolysaccharide (LPS)?, (ii) is this phenomenon specific for the stressor applied?, (iii) is this phenomenon reflected in the early transcriptional activity in the PVN?, and (iv) which are the brain areas sensitive to a single previous stress exposure?Male Sprague-Dawley adult rats were stressed only two times by IMO or LPS, 1 or 4 weeks ahead. Plasma ACTH and corticosterone were determined by radioinmunoassay, and tumor necorsis factor (TNF)-a by ELISA. C-fos mRNA , CRF and glucocorticoid receptor (GR) and CRF and AVP hnRNA levels were quantifyed by in situ hybridisation.Previous LPS reduced the CRF mRNA response in the PVN to the same stimulus 4, but not 2, weeks later; the peripheral response, and also the response of TNF-a, was also reduced, both 1 and 4 weeks later. Previous LPS abolished the LPS-induced hypothermia 4 weeks later. There was no cross-desensitisation between IMO and LPS in any of the HPA axis parameters studied. Previous IMO reduced the c-fos mRNA response to IMO in the PVN, both 1 and 4 weeks later, and also the CRF hnRNA response only at 4 weeks. Similar effects were observed with LPS on c-fos mRNA, but not CRF hnRNA, at 4 weeks. Previous IMO or LPS did not modify the AVP hnRNA response to the same stimulus. In general, there were no consitent cross-desensitisation effects between IMO and LPS on CRF or AVO hnRNA, or c-fos mRNA in the PVN. IMO or LPS did not modify basal GR mRNA levels in the hippoccampal formation or PVN 4 weeks later.There was a different pattern of c-fos mRNA activation in the brain by IMO or LPS. The areas sensitive to a previous IMO session were the ventral dicision of the lateral septum, PVN, medial amigdala, medial ventral division of the bed nucleus (BST) locus coeruleus (LC) and nucleus of the solitary tract. In the case of LPS, these areas were the PVN, central amigdala, lateral division of the BST and LC.Freom these results we can conclude that long-term effects of stress can be generalised to stressors of physical-immunological nature such as LPS. In addition, this phenomenon seems to be stressor-specific and can be detected on the early transcriptional activity in the PVN. Finally, we suggest that the brain sites that would most probably be responsible of the long-term effects of stress are areas of the lymbic system such as the amigdala and BST.

Adolescence in humans is a vulnerable period for illicit drug use, and teenage onset of drug use is associated with long-term addiction. Adolescent sensitivity to drug reinforcement, relapse, and withdrawal has not been explored thoroughly in animal models, especially considering opiate drugs such as morphine and heroin. The present series of studies profiles adolescent sensitivity to opiates using adolescent and adult male rats to test for age differences in opiate self-administration, reinstatement, withdrawal signs, locomotor sensitization, and even brain activation during drug-seeking. To test for acute sensitivity to the reinforcing effects of morphine or heroin, we compared patterns of self-administration by adolescent vs. adult male rats on various schedules of reinforcement, drug doses, and daily access conditions. Using fixed ratio schedules and short daily access, adolescents self-administered less morphine than adults, an effect commonly interpreted as higher drug sensitivity. In contrast, escalation of morphine intake under long access conditions was similar across ages, as was heroin intake using fixed or progressive ratio schedules of reinforcement. To test for enduring effects of opiates, we compared opiate-seeking in the absence of the drug in tests of extinction responding and cue-induced reinstatement. Regardless of the acute effects of morphine or heroin, all adolescent treatment groups showed attenuated opiate-seeking compared to adults. Next we considered behavioral correlates of reinforcement, drug withdrawal and locomotor sensitization, during and after escalating doses of experimenter-administered heroin. Consistent with attenuated opiate-seeking, adolescents exhibited attenuated somatic and locomotor signs of withdrawal compared with adults, although locomotor sensitization was similar across ages. Finally, the medial prefrontal cortex (mPFC) is a brain region heavily implicated in drug reinforcement, so we used tissue levels of Fos-like immunoreactivity to compare activation of this region by heroin-seeking. Indeed mPFC activation was absent in rats that self-administered heroin as adolescents, but robust in adults. Together these behavioral and neuroanatomical results surprisingly suggest that adolescent male rats are less sensitive than adults to some acute and enduring effects of opiates, and may predict better response profiles among younger human addicts. Through future studies, adolescent rats may provide a new model to help identify treatments for drug abuse.

<p>Adolescence is a critical period for drug addiction in humans. Most lifelong drug addiction is initiated during adolescence and the progression from initial drug use to the expression of addictive behaviors occurs more rapidly during adolescence than in adulthood. The purpose of this work was to examine if the adolescent brain uniquely responds to the addictive stimulant cocaine. This was accomplished by comparing the following measures in adolescent and adult male rats: locomotor responses to cocaine across a range of doses in two acute cocaine binge models, plasma cocaine and brain concentrations, locomotor responses to apomorphine, the relative magnitude of locomotor sensitization induced by a single high dose of cocaine (40 mg/kg), and cocaine-induced c-fos and zif268 expression. We determined that young adolescent (PN 28) rats had greater stereotypy responses to all doses of a repeated dose cocaine binge (15 mg/kg), the highest dose of an escalating dose binge (25 mg/kg), and low dose apomorphine. In addition to showing exaggerated acute locomotor responses to cocaine, young adolescents demonstrated a form of intrabinge sensitization that was absent in adults. Exaggerated adolescent locomotor responses could not be attributed to cocaine metabolism as we did not observe greater cocaine plasma or brain concentrations in adolescents compared to adults. A single high dose of cocaine (40 mg/kg) induced more ambulatory and stereotypy sensitization in young adolescents than adults. Further, the magnitude of the acute locomotor response to cocaine predicted the magnitude of locomotor sensitization in individual adolescents. We also showed that cocaine dose-dependently caused age-specific increases in the expression of the plasticity-associated immediate early genes c-fos and zif268: low dose (10 mg/kg) cocaine caused greater increases in striatal c-fos expression in adolescents whereas high dose (40 mg/kg) cocaine caused greater increases in striatal c-fos and zif268 expression in adults. Both doses of cocaine stimulated bigger increases in cortical zif268 expression in adults compared to adolescents. Finally, we demonstrated that the coordinated expression of striatal c-fos and zif268 develops during adolescence: there was no correlation between striatal c-fos and zif268 expression in individual adolescents but a strong correlation was seen in adults. The results of these experiments demonstrate that adolescents have unique molecular responses to acute cocaine and may help explain how adolescents show unique adaptive changes following continued cocaine use.</p> / Dissertation

名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 医学博士(論文) 学位授与年月日:平成4年9月22日 大野元嗣氏の博士論文として提出された

Doctor of Philosophy (PhD) / The investigation into the relationship between neural plasticity in the rat forebrain associated with opiate-induced behaviours yielded two major results. The major finding of the functional neuroanatomy of acute morphine dependence was that doses of naloxone that induced hyperalgesia following a brief exposure to morphine, in previously drug-naïve rats, caused a specific induction of the inducible transcription factor (itf) proteins c-Fos and zif268 in the extended amygdala. Moreover, doses of naloxone that caused a simple reversal in morphine analgesia failed to induce itf proteins in these same brain regions. This increase in itf proteins was specific to regions of the extended amygdala that receive and process nociceptive information relayed via the spino-parabrachio-amygdaloid pathway and was not observed in other regions that are involved in supraspinal pain modulation such as the rostral ventromedial medulla and the periaqueductal gray. We also found that acute morphine increased c-Fos protein in the basolateral amygdala and the major output nucleus of the central amygdala the medial subdivision. Acute morphine also up-regulated c-Fos protein in striatal, midbrain, and hypothalamic nuclei. A unique finding of the current study was that prolonged exposure to morphine was required to induce c-Fos in these brain regions, as the subsequent administration of naloxone 30-minutes after morphine either reversed or blocked this induction. These results indicate the potential role of the amygdala in analgesia following systemic morphine and in pain facilitation during acute morphine abstinence. Investigation into the neurons and circuitry that undergo long-term neuroplasticity in response to repeated morphine exposure revealed that network-level changes in the distribution of Fos protein in the nucleus accumbens and striatum predicted both tolerance to catalepsy and psychomotor sensitisation. Drug-naïve rats became profoundly cataleptic following morphine, an effect that rats with a drug-history became tolerant. Rats with a history of morphine exposure showed an increase in stereotyped behaviours compared to drug-naïve rats. The major finding of this study was that a shift in the induction of c-Fos protein from a matrix predominance in drug-naïve rats toward a patch predominance in drug-sensitised rats in the accumbens core predicted both tolerance to catalepsy and sensitisation of oral stereotyped behaviours. Acute injection of morphine in a drug-naïve rat induced catalepsy and increased the number of c-Fos-positive neurons in matrix striatopallidal projection neurons of the rostral accumbens core. An increase in activity of striatopallidal projection neurons, which give rise to the indirect pathway, could potentially increase inhibitory drive to the pedunculopontine nucleus (PPN). The PPN, long known as a site of termination for basal ganglia output, is thought to direct the outflow of incentive-motivational and sensorimotor information from the nucleus accumbens to pons, medullary, and spinal cord nuclei translating the incentive impact of the stimuli into appropriate motor, autonomic and emotive responses (Winn et al., 1997). Inhibition of this nucleus would cause the animal to be unable to initiate a movement and in effect lock up, which is precisely what cataleptic postures look like. In contrast c-Fos-positive neurons were decreased in the rostral matrix and increased in patch striatonigral projection neurons along the rostro-caudal extent of the accumbens core when morphine was administered to drug-sensitised rats. Striatonigral neurons located in the patch give rise to the direct pathway innervating the dopaminergic neurons in both substantia pars compacta and the dopamine rich islands in the substantia nigra pars reticulata (Berendse et al., 1992; Gerfen, 1992; Furuta et al., 2002). Activity of this pathway is thought to be involved in the initiation of movement (Gerfen, 1992; Gerfen and Wilson, 1996), however, when this pathway is overstimulated as is the case when morphine is injected in drug-sensitised rats this could potentially cause increased activity of PPN neurons leading to repetitive psychomotor behaviours or stereotypy. This data adds to the growing body of evidence that suggests that long-term neuroadaptations induced by drugs of abuse including morphine that lead to behavioural sensitisation involves the circuitry that includes the nucleus accumbens.

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