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Zugl.: Giessen, University, Diss., 2008.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2007. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 87-91.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2009. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 77-78.

Humanpathogene Sapoviren gehören zur Familie der Caliciviridae und verursachen vor allem bei Klein¬kindern und Senioren Gastroenteritiden. Die Replikationsstrategie von humanpathogenen Sapoviren ist bislang ungeklärt, da weder ein geeignetes Tiermodell noch ein etabliertes Zellkulturmodell zur Verfügung stehen. Aus diesem Grund sollte die Replikation in einem Säugerzellsystem etabliert werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen sollen zu einem besseren Verständnis der Replikationsstrategie der humanpathogenen Sapoviren beitragen und können die Grundlage für weitere Unter¬suchungen der Replikationsstrategie der Caliciviren bilden sowie zur Entwicklung geeigneter antiviraler Maßnahmen und Medikamente beitragen. Für die Untersuchung der Replikationsstrategie des humanpathogenen Sapovirus wurde ein Sapovirus-Volle-Länge-Klon aus Patientenmaterial (Stuhlgang-Probe) generiert. Nach der molekularen Charakterisierung konnte der Stamm Hu/SaV/Dresden/pJG-SapI/2004/DE (GenBank-Zugangsnummer AY694184) der Genogruppe I Genotyp 1 der Sapo¬viren zugeordnet werden. Für die Untersuchung der Translation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen wurden polyklonale Antikörper in Kaninchen gegen die nichtstrukturellen und strukturellen Sapovirus-Proteine generiert. Im zellfreien System konnte die Sensitivität und Spezifität dieser Antikörper validiert werden. Außerdem wurde die Translation im zellfreien System mit bereits bestehenden Ergebnissen verglichen. Die Prozessierung des ORF1-Polyproteins erfolgte in die nichtstrukturellen Proteine NS1, NS2, NS3NTPase, NS4, NS5VPg, die Fusionsproteine NS1-3, NS2-3, NS4-5, NS4-7, NS5-7 und NS6 7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1. Für die Charakterisierung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Länge-cDNA-Klone generiert. Für das Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genom pJG-SapI-T7 konnte eine Translation der Sapovirus-Proteine nach¬gewiesen werden. Die Transfektion von 293T-Zellen erfolgte mit in vitro transkribierter RNA, die ein Cap-Analogon und einen Poly(A)-Schwanz besaß. Durch die dem Sapovirus-Genom vorangestellte Kozak-Sequenz, welche als Ribosomenbindungsstelle dient, konnte auch nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS7Pol (RNA-abhängige RNA-Polymerase) eine Translation des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Somit erwies sich dieses Konstrukt als ungeeignet für die Untersuchung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen. Nach Klonierung des Sapovirus-Volle-Länge-cDNA-Genoms in den pACYC-MCSII-Vektor (pJG-SapI-T7) konnte nach in vitro Transkription ein gekapptes Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genom mit einem Poly(A)-Schwanz generiert werden, welches vermutlich die richtigen 5’- und 3’-Sapovirus-Enden enthält. Nach Transfektion von 293T-Zellen konnten die nichtstrukturellen Fusionsproteine NS2-3, NS4-5, NS4-7 und NS6-7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1 im Western Blot nachgewiesen werden. Nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS6Pro (Protease) wurde die Prozessierung des ORF1-Polyproteins in Säugerzellen unter¬bunden. Die Replikation der generierten Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genome in Säugerzellen konnte mit Hilfe der quantitativen PCR nicht nachgewiesen werden. Eine Passagierung in verschiedenen Säugerzelllinien war ebenfalls nicht möglich. Weiter wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genome direkt aus Patientenmaterial durch RT-PCR generiert und nach in vitro Transkription damit Säugerzellen transfiziert. Bei Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genomen aus drei Patientenproben konnte die Translation und Prozessierung des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Die Replikation konnte mit Hilfe der quantitativen PCR nicht nachgewiesen werden. In einem letzten Schritt wurde aus Patientenmaterial gewonnene RNA direkt für die Transfektion eingesetzt. Hierfür wurden die Patientenproben verwendet, bei denen eine Translation und Prozessierung des Sapovirus-ORF1-Polyproteines nachgewiesen werden konnte. Auch hier konnte keine Replikation mit Hilfe der quantitativen PCR nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die erfolgreiche Translation und Prozessierung des ORF1-Polyproteins des humanpathogenen Sapovirus (Dresdner Stamm pJG-SapI, GenBank-Zugangsnummer AY694184) in Säugerzellen gezeigt werden. Weitergehende Untersuchungen zur Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen könnten mit Hilfe des vorliegenden Dresdner Sapovirus-Stamm pJG-SapI erfolgen, indem weitere rekombinante Systeme etabliert werden. / The human pathogenic sapovirus belongs to the family of the Caliciviridae and is an important agent of gastroenteritis in infants and the elderly. The replication strategy of the human pathogenic sapovirus remains so far unclear, since neither a suitable animal model nor a permissive cell line to cultivate the virus are available. Elucidating the replication strategy of the human pathogenic sapovirus may contribute to a better understanding of its pathogenicity, being also an important pre-requisite for the development of new antiviral strategies against this relevant medical pathogen. In order to investigate the replication strategy of the human pathogenic sapovirus, a cDNA-clone encompassing the entire sapovirus genome was generated from a clinical sample. Based on phylogenetic analysis, the full-length genome of the sapovirus strain Hu/SaV/Dresden/pJG-SapI/2004/DE (GenBank accession number AY694184) was assigned to the Genogruppe I/ Genotype 1. For the investigation of the translation of the human pathogenic sapovirus in mammalian cells, polyclonal antibodies were generated against the nonstructural and structural sapovirus proteins. The sensitivity and specificity of the antibodies were validated using a transcription-translation driven cell free system. Translation of the sapovirus full-length-cDNA clone in the cell free system generated structural and nonstructural sapovirus proteins, in accordance with previously published reports. After translation, the sapovirus ORF1 polyprotein was processed in the nonstructural proteins NS1, NS2, NS3NTPase, NS4, NS5VPg, the fusion proteins NS1-3, NS2-3, NS4-5, NS4-7, NS5-7 and NS6-7Pro-Pol as well as the structural protein VP1. For the characterisation of the replication of the human pathogenic sapovirus in mammalian cells, different sapovirus cDNA-full length clones were generated. Upon transfection in 293-T cells, a translation of the sapovirus proteins was evidenced. However, this translation was not sapovirus-specific, as cDNA clones bearing a mutation in the active site of the sapovirus polymerase NS7Pol were also able to generate viral proteins. In order to further investigate the translation and replication of the sapovirus, the full length cDNA Genome was cloned into the pACYC-MCSII-Vector. Subsequently, a capped sapovirus full length RNA genome with a correct 5’-end and a 3’-end with a poly(A) tail was generated by in vitro transcription. Upon transfection in 293T-cells, the nonstructural fusion proteins NS2-3, NS4-5, NS4-7 and NS6-7Pro-Pol as well as the structural protein VP1 were translated. As a control, mutation of the active site of the nonstructural protein NS6Pro did not lead to processing of the viral enzymes, indicating that the processing of the ORF1-polyprotein in mammalian cells is strictly dependent on the activity of the sapovirus protease NS6Pro. Furthermore, replication of the sapovirus genomic RNA was investigated in mammalian cells. Upon transfection of the sapovirus full-length genomic RNA, replication of the sapovirus full-length RNA genomes was not evidenced in mammalian cells using quantitative real time RT-PCR. In order to exclude a possible flaw in the primary sequence of the viral genome hampering its replication, additional sapovirus full-length genomes were generated by direct amplification of the RNA from stool samples followed by in vitro transcription. Upon transfection in mammalian cells, the translation of sapovirus ORF1-polyprotein was evidenced in three clinical samples. However, replication of the viral genome did not occur. A similar observation was made when the total RNA from the clinical sample was used for transfection of mammalian cells, indicating that the lack of replication of the viral genome may be caused primarily by the cell line used, rather than the viral genome. In conclusion, the present work describes for the first time the successful processing of the ORF1-Polyprotein of the human pathogenic Sapovirus (strain Dresden pJG-SapI, GenBank accession number AY694184) in mammalian cells. This work may be a first step towards understanding the replication strategy of the human pathogenic and non-human pathogenic sapovirus (i.e. the porcine enteric calicivirus), being both important medical pathogens.

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There is a need to develop a range different VLP for use as nanoscale templates and vaccines. The aim of this research was to develop RHDV VLP as a versatile vaccine delivery system easily modified for use against a wide range of different diseases. Production of Rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) capsid protein in a baculovirus system led to the self-assembly of Virus-like Particles (VLP) that could be purified to greater than 99% purity using simple methods. The capsid gene, vp60, can be manipulated genetically to incorporate immunogenic peptide sequences or a functional DNA-binding site. Fusion of these small epitopes to VP60 was well tolerated, forming VLP and greatly enhanced the presentation of peptide to, and activation of CD4+ T helper cell hybridoma. To avoid constraints imposed on chimeric VLP and dramatically increase the versatility of RHDV VLP, rapid conjugation of antigen was carried out, employing the hetero-bifunctional chemical linker, sulpho-SMCC. Incorporation of sulfhydral groups by design or treatment with SATA allowed for great versatility, in turn enabling many diverse peptides and proteins to be conjugated to VLP. RHDV VLP and consequently the conjugated GFP antigen were efficiently taken up by DC with more than 85% of DC positive for GFP by flow cytometry. This was also visualised by confocal microscopy and electron microscopy of both gold- labelled VLP and conjugated antigen. RHDV VLP conjugate was shown to induce the significant up regulation of the activation markers CD40, CD80, CD86 and MHC class II on the surface of dendritic cells (DC). As well, DC pulsed with RHDV VLP/OVA effectively presented OVA to both CD4+ and CD8+ T cells transgenic for respective peptide-specific T cell receptors, eliciting a greater proliferative response in both T cell subsets than antigen delivered alone. The surface accessibility of peptides on VLP was demonstrated, while administration of VLP/Ovalbumin (OVA) conjugate in mice was shown to evoke very high titre antibody responses specific for conjugated antigen. VLP/OVA conjugates were also shown to induce IFN-γ production and OVA-specific cytotoxic killing in vivo, of up to 80% of fluorescently labelled, adoptively transferred target cells. No distinguishable cytotoxicity was detected in unimmunised control mice. This assay was also used to demonstrate the necessity for antigen to be conjugated to VLP, as antigen mixed with VLP induced only sub-optimal killing. To investigate the anti-tumour effects, mice vaccinated with VLP conjugated to OVA protein, CD4+ or CD8+ T cell OVA epitopes were inoculated with B16- OVA tumour cells and monitored for tumour growth. Untreated control mice had to be sacrificed by day 19, while mice immunised with either VLP/OVA or VLP conjugated with both CD4+ and CD8+ OVA epitopes, showed a significant delay in tumour growth (P = 0.0002), with one mouse remaining free of palpable tumour until day 92. These results show that RHDV VLP can be easily produced and purified and demonstrate the versatility of this RHDV capsid. Rapid conjugation techniques allowed the modification of VLP with both peptide and protein rendered these antigens highly immunogenic, stimulating both humoral and cell-mediated immunity targeted against conjugated antigens of choice. The versatility and immune stimulating properties of RHDV VLP provides a molecular tool with almost limitless applications within the fields of nanotechnology and immunology.

Humanpathogene Sapoviren gehören zur Familie der Caliciviridae und verursachen vor allem bei Klein¬kindern und Senioren Gastroenteritiden. Die Replikationsstrategie von humanpathogenen Sapoviren ist bislang ungeklärt, da weder ein geeignetes Tiermodell noch ein etabliertes Zellkulturmodell zur Verfügung stehen. Aus diesem Grund sollte die Replikation in einem Säugerzellsystem etabliert werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen sollen zu einem besseren Verständnis der Replikationsstrategie der humanpathogenen Sapoviren beitragen und können die Grundlage für weitere Unter¬suchungen der Replikationsstrategie der Caliciviren bilden sowie zur Entwicklung geeigneter antiviraler Maßnahmen und Medikamente beitragen. Für die Untersuchung der Replikationsstrategie des humanpathogenen Sapovirus wurde ein Sapovirus-Volle-Länge-Klon aus Patientenmaterial (Stuhlgang-Probe) generiert. Nach der molekularen Charakterisierung konnte der Stamm Hu/SaV/Dresden/pJG-SapI/2004/DE (GenBank-Zugangsnummer AY694184) der Genogruppe I Genotyp 1 der Sapo¬viren zugeordnet werden. Für die Untersuchung der Translation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen wurden polyklonale Antikörper in Kaninchen gegen die nichtstrukturellen und strukturellen Sapovirus-Proteine generiert. Im zellfreien System konnte die Sensitivität und Spezifität dieser Antikörper validiert werden. Außerdem wurde die Translation im zellfreien System mit bereits bestehenden Ergebnissen verglichen. Die Prozessierung des ORF1-Polyproteins erfolgte in die nichtstrukturellen Proteine NS1, NS2, NS3NTPase, NS4, NS5VPg, die Fusionsproteine NS1-3, NS2-3, NS4-5, NS4-7, NS5-7 und NS6 7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1. Für die Charakterisierung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Länge-cDNA-Klone generiert. Für das Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genom pJG-SapI-T7 konnte eine Translation der Sapovirus-Proteine nach¬gewiesen werden. Die Transfektion von 293T-Zellen erfolgte mit in vitro transkribierter RNA, die ein Cap-Analogon und einen Poly(A)-Schwanz besaß. Durch die dem Sapovirus-Genom vorangestellte Kozak-Sequenz, welche als Ribosomenbindungsstelle dient, konnte auch nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS7Pol (RNA-abhängige RNA-Polymerase) eine Translation des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Somit erwies sich dieses Konstrukt als ungeeignet für die Untersuchung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen. Nach Klonierung des Sapovirus-Volle-Länge-cDNA-Genoms in den pACYC-MCSII-Vektor (pJG-SapI-T7) konnte nach in vitro Transkription ein gekapptes Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genom mit einem Poly(A)-Schwanz generiert werden, welches vermutlich die richtigen 5’- und 3’-Sapovirus-Enden enthält. Nach Transfektion von 293T-Zellen konnten die nichtstrukturellen Fusionsproteine NS2-3, NS4-5, NS4-7 und NS6-7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1 im Western Blot nachgewiesen werden. Nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS6Pro (Protease) wurde die Prozessierung des ORF1-Polyproteins in Säugerzellen unter¬bunden. Die Replikation der generierten Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genome in Säugerzellen konnte mit Hilfe der quantitativen PCR nicht nachgewiesen werden. Eine Passagierung in verschiedenen Säugerzelllinien war ebenfalls nicht möglich. Weiter wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genome direkt aus Patientenmaterial durch RT-PCR generiert und nach in vitro Transkription damit Säugerzellen transfiziert. Bei Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genomen aus drei Patientenproben konnte die Translation und Prozessierung des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Die Replikation konnte mit Hilfe der quantitativen PCR nicht nachgewiesen werden. In einem letzten Schritt wurde aus Patientenmaterial gewonnene RNA direkt für die Transfektion eingesetzt. Hierfür wurden die Patientenproben verwendet, bei denen eine Translation und Prozessierung des Sapovirus-ORF1-Polyproteines nachgewiesen werden konnte. Auch hier konnte keine Replikation mit Hilfe der quantitativen PCR nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die erfolgreiche Translation und Prozessierung des ORF1-Polyproteins des humanpathogenen Sapovirus (Dresdner Stamm pJG-SapI, GenBank-Zugangsnummer AY694184) in Säugerzellen gezeigt werden. Weitergehende Untersuchungen zur Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen könnten mit Hilfe des vorliegenden Dresdner Sapovirus-Stamm pJG-SapI erfolgen, indem weitere rekombinante Systeme etabliert werden.

Die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel für die Bereiche Tierhaltung und Lebensmittelhygiene stellt einen wichtigen Beitrag zur Bekämpfung von Tierseuchen sowie lebensmittelgetragener Infektionen beim Menschen dar und wird in Deutschland nach den Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG) durchgeführt. Dabei umfasst die Viruzidieprüfung derzeit nur eine Prüfung im Bereich Tierhaltung. Zudem sind Bestrebungen, wie sie bei der derzeit stattfindenden Erarbeitung einer gesamteuropäischen Richtlinie existieren, die Prüfbedingungen an die Verhältnisse der praktischen Desinfektion anzupassen, in der aktuellen Prüfrichtlinie der DVG noch nicht verwirklicht. Dies betrifft insbesondere eine zusätzliche Versuchsdurchführung bei einer Temperatur von 10 °C. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, mittels Suspensionsversuchen zu prüfen, ob die Prüftemperatur einen signifikanten Einfluss auf den Grad der Virusinaktivierung besitzt oder ob dieser vernachlässigt werden kann. Der Einfluss der Zugabe einer definierten Eiweißmenge zur Simulation einer organischen Belastung, wie in den Prüfrichtlinien bereits enthalten, wurde ebenfalls überprüft und mit dem Einfluss der Prüftemperatur verglichen. Die Untersuchung von fünf Desinfektionsmitteln an acht Viren zeigte, dass der Anteil der Versuche, bei welchen ein Kältefehler auftrat, mit rund 42 % eine ähnlich hohe Dimension annimmt wie der Anteil der Versuche mit signifikantem Eiweißfehler (rund 62 %). Eine Bestrebung, wie sie bei der Entwicklung einer Richtlinie durch das Comité Européen de Normalisation (CEN-Richtlinie) stattfindet, ist also unbedingt zu unterstützen und auch für die DVG-Richtlinie in Betracht zu ziehen. Des Weiteren wurden die in der bestehenden DVG-Richtlinie etablierten Viren Enteric cytopathogenic bovine orphan virus (ECBO-Virus), Respiratoric enteric orphan virus (Reovirus) und Newcastle disease virus (NDV) in Suspensions- und Holzkeimträgerversuchen mit Alternativviren verglichen, welche aufgrund einer höheren Tenazität, einer besseren Handhabung bei der Versuchsdurchführung oder ihrer eventuellen Eignung für eine Prüfung im Bereich Lebensmittelhygiene ausgewählt worden waren. Im Vergleich des ECBO-Virus mit den als Alternativvirus in Frage kommenden Viren Enteric cytopathogenic human orphan virus (ECHO-Virus) bzw. dem Felinen Panleukopenievirus (FPV) konnte das ECHO-Virus als das Virus mit der deutlich höchsten Tenazität gegenüber chemischen Desinfektionsmitteln identifiziert werden. Infolge dessen kann dieses auch aufgrund seiner sehr guten Eigenschaften in der Versuchsdurchführung, uneingeschränkt als Ersatz für das ECBO-Virus empfohlen werden. Von den als Ersatz für NDV in Betracht gezogenen Viren Bovines Virusdiarrhöe-Virus (BVDV) und Felines Herpesvirus (FHV) kann nur BVDV für einen Einsatz in der Desinfektionsmittelprüfung empfohlen werden, da dieses eine mit NDV nahezu identische Tenazität besitzt. BVDV kann so ebenfalls als Ersatz für das in der Versuchsdurchführung relativ schwierig zu handhabende NDV empfohlen werden. Auch für das Feline Calicivirus (FCV), welches als möglicher Ersatz für Reovirus in die Untersuchung einbezogen wurde, konnte eine Ähnlichkeit der Tenazität, abhängig von der Wirkstoffgruppe, bestätigt werden. Auf dieser Grundlage sollte überdacht werden, FCV ebenfalls, möglicherweise als Ersatz für Reovirus, in die Prüfrichtlinien einzubeziehen, da somit ein Surrogat für bedeutende humanpathogene, durch Lebensmittel übertragene Viren eine Grundlage für die Schaffung einer Viruzidieprüfung im Bereich Lebensmittelhygiene darstellen könnte.