A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa que afeta os neurônios motores levando a atrofia muscular e morte por insuficiência respiratória. Esta patologia se manifesta de forma esporádica ou familiar, que são indistinguíveis clinicamente. Mutações na enzima antioxidante superóxido dismutase 1 (hSod1) respondem por aproximadamente 20% dos casos familiares de ELA. Além disso, o caráter autossômico dominante destas mutações revela que a hSod1 adquire propriedades tóxicas aos neurônios motores. Atualmente, duas hipóteses não mutuamente excludentes existem para explicar o caráter tóxico das mutantes da hSod1 relacionadas à ELA. A primeira refere-se à produção de oxidantes pela atividade peroxidásica exacerbada das mutantes contribuindo para o estresse oxidativo observado em ELA. A segunda refere-se à agregação de proteínas como ocorre em outras doenças neurodegenerativas. Digno de nota, o radical carbonato produzido na atividade peroxidásica da hSod1 causa a formação de um dímero covalente da proteína análogo a uma espécie de hSod1 frequentemente detectada em modelos experimentais e pacientes da doença e associada à propriedade tóxica das mutantes. Desta forma, o presente trabalho buscou esclarecer o mecanismo de produção do radical carbonato pela hSod1, bem como caracterizar o dímero covalente da proteína para posterior estudo de sua formação em um modelo de ELA em ratos que superexpressam a mutante G93A da hSod1. Os estudos cinéticos da variação do pH sobre os efeitos de bicarbonato/CO2, nitrito e formato na atividade peroxidásica da hSod1, medidos pelo consumo de peróxido de hidrogênio e produção de radical, permitiram excluir o mecanismo de Fenton para explicar o ciclo peroxidativo da enzima em tampão bicarbonato em favor de outros intermediários reativos. Já, os experimentos de 13C RMN, modelagem molecular e cinética de fluxo interrompido com mistura assimétrica demonstraram que o ânion peroxomonocarbonato constitui o precursor do radical carbonato produzido pela hSod1. A caracterização do dímero covalente da hSod1 por proteólise com tripsina seguida de análise por HPLC/UV-vis e HPLC/ESI-MS identificou um peptídeo característico do dímero covalente da hSod1. A digestão enzimática em H2 18O demonstrou de forma inequívoca a natureza dímerica deste peptídeo pela marcação da extremidade C-terminal. Ainda, o sequenciamento do peptídeo dimérico por MS/MS revelou a estrutura primária ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK, na qual as cadeias polipeptídicas estão ligadas através de um aduto de ditriptofano composto por resíduos Trp32 da proteína. Por fim, este peptídeo dimérico pode ser empregado como marcador bioquímico específico para o estudo do dímero covalente da hSod1 in vivo. A análise do extrato de proteínas das medulas dos ratos modelo de ELA identificou quinze candidatos a dímero covalente da hSod1 por Western-blot, sendo que dois deles foram excluídos por espectrometria de massa, pois tiveram o resíduo Trp32 identificado. O peptídeo ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK não foi observado, porém as treze espécies restantes permanecem candidatas e deverão ser reexaminadas em trabalhos que darão sequência a esta tese de doutorado. Em suma, o peroxomonocarbonato constitui o intermediário na produção do radical carbonato pela hSod1 e o peptídeo ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK uma ferramenta importante no estudo da agregação covalente da hSod1 em ELA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease of motors neurons that causes muscle atrophy, weakness, and death by respiratory failure. This pathology occurs in both sporadic and familiar forms that are clinically indistinguishable. Mutations in the antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (hSod1) respond to about 20% of the familiar cases of ALS. Besides, the autosomal dominant nature of these hSod1-associated ALS suggests that the mutants gain toxic properties to motor neurons. Currently, two hypotheses exist to explain the toxicity of hSod1 mutants but they do not exclude each other. The first one is related to the production of oxidants by the increased peroxidase activity of the ALS-linked mutants that could contribute to the oxidative stress reported in ALS. The second refers to protein aggregation as proposed in other neurodegenerative diseases. Noteworthy, the carbonate radical produced during hSod1 peroxidase activity leads to the formation of a covalent dimer of the protein similar to a hSod1 species often detected in experimental models and patients of the disease and implicated in the toxic properties of hSod1 mutants. Thus, the present work aimed to determine the mechanism of carbonate radical production by hSod1 and to characterize the covalent dimer of the protein in vitro followed by the study of covalent aggregates of hSod1 in a rat model of ALS that overexpresses the G93A mutant of the protein. The kinetic studies of the effect of bicarbonate/CO2, nitrite and formate in the peroxidase activity of hSod1 at various pH, measured by hydrogen peroxide consumption and radical production, permitted to exclude the Fenton mechanism to explain the enzyme peroxidative cycle in bicarbonate buffer in favor of other reactive intermediates. Furthermore, 13C NMR, molecular docking and stopped-flow experiments with asymmetric mixing demonstrated that the anion peroxomonocarbonate is the precursor of the carbonate radical produced by hSod1. The characterization of hSod1 covalent dimer by proteolysis with trypsin followed by HPLC/UV-vis and HPLC/ESI-MS analysis identified a peptide characteristic of the covalent dimer of the protein. The enzymatic digestion in H2 18 O irrefutably demonstrated the dimeric nature of this peptide because of the C-terminal labeling with oxygen-18 isotopes. In addition, sequencing of the dimeric peptide by MS/MS determined the primary structure ESNGPVKVW(ESNGPVKVWGSIK)GSIK, in which the polipeptide chains are crosslinked through a ditryptophan adduct formed by a covalent bond between the Trp32 residues of each subunit. So, this dimeric peptide can be employed as a biochemical marker for studying the hSod1 covalent dimer in vivo. The analysis of protein extracts from the spinal cord of the rat model of ALS by Western-blot identified fifteen candidates to hSod1 covalent dimer, but two of them were excluded by mass spectrometry analysis that identified unmodified Trp32 residues. Moreover, neither the dimeric peptide nor the Trp32 residue were observed in the remaining species. Therefore, these thirteen candidates must be reexamined in subsequent studies. In conclusion, the anion peroxomonocarbonate is the key intermediate in the production of the carbonate radical by hSod1 and the dimeric peptide constitutes a specific tool to study hSod1 covalent aggregation in ALS

[EN] The main subject of this work is consolidation of wall paintings with inorganic materials under the point of view of the "Scuola Fiorentina", of restoration. Only through the exam of the historical evolution of the "Scuola Fiorentina" of restoration and the study of the socio-cultural context where such evolution took place, it is possible to completely understand how an activity that had a vertiginous growth, would have later converted, the "Scuola Fiorentina" in an international reference and in an undisputed pioneer in the field of restoration. The existence of an official organized agency "Gabinetto di resaturi della Sopraintendenza di Firenze", the catastrophic events that suffered the Florentine territory during the Second World War, and during the flood of 1966, caused a fundamental change in the culture of restoration that drove to put together science and restoration, forever. One of the most important outcomes of such merger was finding of the method Ammonium/Barium ("Dini-Ferroni"). The method was invented thanks to the genius and intuition of the chemist Enzo Ferroni, and due to the talent of the restorer Dino Dini who understood the importance of the joint between a scientific method with the practical hand-action of the restorer. From that moment, it will be clear the preference of the "Scuola Fiorentina" in the use of inorganic material for treatments on surface of mineral matrix. The method of Ammonium-Barium, is a desulphating procedure with a consolidation effect based on two phases with the application of two reagents. The main goal is the transformation of the sulphur ion of the disjointed surface into a compound, crystal and tip-chemically compatible with the carbonated surface, and the re-cohesion of the substrate by means of the compounds that come from the treatment. Since XXI century, due to an even stronger effort to apply science to restoration, also nanotechnologies bounced into restoration. They have been contributing to satisfy the effectiveness and compatibility of the pre-consolidation interventions, that are essential in case of severe disaggregation of paint layer. Pre-consolidation interventions with nanoparticles before the cleaning of the wall surfaces, are clearly related to the method of Ammonium/Barium, because they represent the preliminary interventions necessary to carry out the method with success. The Opificio delle Pietre Dure (OPD), is a governmental agency thank to which I have been able to learn techniques carried out through said methodologies. OPD is the main referent of the current "Scuola Fiorentina" of restoration and it has been characterized for its clear preference in the use of inorganic materials for the treatments on paint layers in carbonated matrix. / [ES] La consolidación de las pinturas murales con materiales inorgánicos, bajo la visión de la escuela fiorentina de la restauración, es el tema principal de este trabajo. A través del estudio del recorrido histórico de la scuola fiorentina de la restauración y del análisis del contexto socio-cultural, se puede entender cómo se pudo desarrollar vertiginosamente, una actividad que convirtió en pocos años a la scuola fiorentina, en ejemplo internacional e indiscutible pionera en el campo de la restauración. La existencia de un centro oficial organizado, "Gabinetto di restauri della Soprintendenza di Firenze", junto a los acontecimientos catastróficos que sufrió el territorio florentino en la IIªGuerra Mundial, y las inundaciones de Florencia de 1966, marcaron un cambio radical en la cultura de la restauración que unió para siempre la ciencia y la restauración. Unión que culminará con el descubrimiento del método "Ammonio-Bario" ("Dini-Ferroni"), gracias al ingenio y la intuición, del químico Enzo Ferroni; y al restaurador Dino Dini, que supo valorar la importancia de la unión del pensamiento científico a la acción práctica-manual del restaurador. A partir de ese momento se configurará la clara preferencia de la scuola fiorentina, en la elección de materiales inorgánicos para las intervenciones sobre sustratos de matriz mineral. El método Ammonio-Bario, es un tratamiento desulfatante con efecto consolidante articulado en dos fases en base a la aplicación de dos reactivos, cuyo objetivo principal, es la trasformación del ión del azufre de la superficie disgregada en un compuesto cristalo-químicamente compatible con la matriz carbonatada, y la recoesión de dicho sustrato a través de los compuestos resultantes del tratamiento. En un esfuerzo aún mayor de la ciencia aplicada a la restauración, las nanotecnologias irrumpen en el campo de la restauración a partir del siglo XXI y estan contribuyendo a satisfacer la eficacia y compatibilidad de las operaciones pre-consolidantes; imprescindibles en situaciones de fuerte disgregación del sustrato pictórico. Las intervenciones de consolidación preventiva (pre-consolidación), realizadas a través de tratamientos de nanoparticulas; en fase propedéutica a la limpieza de las superficies murales; tiene un claro nexo de unión con el método de Ammonio-Bario, ya que completa las intervenciones preliminares necesarias para poder llevar a cabo con éxito dicho método. El Opificio delle Pietre Dure (OPD), institución ministerial gracias a la cual, he podido aprender las técnicas realizadas a través de dichas metodologías es referente principal de la actual scuola fiorentina de la restauración, y se caracteriza por su clara preferencia en el uso de materiales inorgánicos en las intervenciones que realizan sobre sustratos pictóricos en matriz carbonatada. / [CA] La consolidació de les pintures murals amb materials inorgànics, sota el punt de vista de scuola fiorentina de la restauració, és el tema principal del present treball. Mitjançant l'estudi del recorregut històric de la scuola fiorentina de la restauració i de l'anàlisi del context socio-cultural, es comprèn com es va desenvolupar, vertiginosament, una activitat que va convertir en pocs anys la scuola fiorentina, en un exemple internacional i en una indiscutible pionera al camp de la restauració. La existència d'un centre oficial organitzat, "Gabinetto di restauri della Soprintendenza di Firenze", conjuntament amb els episodis catastròfics que va patir el territori florentí a la II Gerra Mundial, així com les inundacions de Florència de 1966, van marcar un canvi radical a la cultura de la restauració que va unir per sempre la ciència amb la restauració. Unió, que va culminar amb els descobriment del mètode "Ammonio-Bario" ("Dini-Ferroni"); gràcies a l'ingeni i la intuïció del químic Enzo Ferroni i del restaurador Dino Dini, que va saber valorar la importància de la unió del pensament científic amb l'acció pràctica-manual del restaurador. A partir d'aquest moment es configurarà la clara preferència de la scuola fiorentina, en l'elecció de materials inorgànics per a les intervencions sobre substrats de matrius minerals. El mètode Ammonio-Bario, és un tractament desulfatant amb efecte consolidant, que s'articula en dos fases en base a l'aplicació de dos reactius, amb l'objectiu principal de transformar el ió del sofre de la superfície disgregada en un compost cristalo-químicament comptatible amb la matriu carbonatada, i la recoesió de l'esmentat substrat mitjançant els compostos resultants del tractament. Amb un esforç encara més gran de la ciència aplicada a la restauració, les nanotecnologies irrompen en el camp de la restauració a partir del Segle XXI i contribueixen a satisfer l'eficàcia i compatibilitat de les operacions pre-consolidants; imprescindibles en situacions de forta disgregació del substrat pictòric. Les intervencions de consolidació preventiva (pre-consolidació), realitzades mitjançant tractament de nanopartícules; en fase propedèutica a la neteja de les superfícies murals; te un nexe d'unió evident amb el mètode de Ammonio-Bario, ja que complerta les intervencions preliminars necessàries per poder dur a terme amb èxit el referit mètode. L'Opificio delle Pietre Dure (OPD), institució ministerial gràcies a la qual he pogut aprendre les tècniques realitzades mitjançant aquestes metodologies, és referent principal de l'actual scuola fiorentina de la restauració, i es caracteritza per una clara preferència en l'ús de materials inorgànics en les intervencions que realitzen sobre substrats pictòrics en matriu carbonatada. / Yagüe Gómez-Reino, S. (2016). CONSOLIDACIÓN CON MATERIALES INORGÁNICOS EN RESTAURACIÓN DE PINTURA MURAL. LA VISIÓN DE LA "SCUOLA FIORENTINA" [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61776 / TESIS

Se realizó el estudio de las propiedades térmicas y mecánicas de mezclas de Poli(Etilén Tereftalato) (PET) con resinas poliméricas basadas enl Bisfenol-A: Poli(Carbonato de Bisfenol-A) (PC) y Poli(Hidroxi-Éter de Bisfenil-A) (PHEB), en contenidos no superiores a un 30% en peso de estos polímeros y preparadas por extrusión doble-husillo.Una evaluación físico-química (ft-IR, densidad y MVR) de ambos sistemas indicó que pueden ocurrir reacciones de transesterificación, principalmente entre el PET y el PC y verificado vía DSC y DMTA, mientras que dichas reacciones tienen una baja extensión en el caso del PHEB, principalmente evidenciado en la pérdida de la capacidad de cristalización del PET (sin mayores cambios en su transición vítrea) en presencia de PC y casi invariabilidad al adicionar PHEB. Con el apoyo de SEM se verificó la presencia de fases ricas de ambos componentes en las mezclas en todo el rango de composiciones, verificándose el carácter inmiscible de ambos sistemas.A través de un fraccionamiento térmico por Autonucleaciones y Recocidos Sucesivos (SSA) y medidas del MVR, ensayos que favorecieron la transesterificación, se estableció que ésta promueve un aumento de la masa molecular en ambos sistemas, donde en las mezclas PET/PC esto se da por reacciones de extensión de cadena y que en las mezclas PET/PHEB conducen a la formación de ramificaciones largas y entrecruzamientos.Las propiedades mecánicas a tracción y flexión indicaron un aumento de la resistencia mecánica y deformabilidad a mayor contenido de fase bisfenólica, al observarse un aumento de los parámetros característicos de estos ensayos, donde módulos elásticos y tensiones siguieron generalmente una desviación positiva de la "Ley Aditiva de Mezcla" (LAM). Tales tendencias indicaron un efecto rigidizante de la fase bisfenólica combinado con interacciones fuertes entre los componentes que favoreció la transmisión de tensiones y la deformabilidad de la mezcla, existiendo una compatibilidad mecánica aceptable al menos a bajas velocidades de deformación, principalmente en las mezclas PET/PC en donde hay evidencias de un aumento en la tenacidad. Se verificó que hay mejoras en la Resistencia al Impacto tanto caída de dardo como pendular al menos hasta un 20% de PC, superando a las mezclas PET/PHEB las cuales manifestaron una fuerte sensibilidad a la entalla.En el análisis de la fractura a través de la Mecánica de la Fractura Elástico Lineal (LEFM) a altas velocidades y el Trabajo Esencial de Fractura (EWF) a bajas velocidades de solicitación, para contenido no superiores a 10% de fase PC y PHEB donde la morfología de fases fue comparable (partículas), se tiene que los parámetros de fractura fueron siempre superiores para las mezclas PET/PC, con una tendencia general de que el PC aporta mejoras a estos parámetros respecto al PET, mientras que el PHEB no los afecta o tiende a disminuirlos. Esto sugiere que que la adhesión interfacial es un factor determinante que favorece la transmisión de tensiones, particularmente favorable en las mezclas PET/PC por su mayor reactividad.A mayores contenidos de fase bisfenólica, el comportamiento es más complejo como consecuencia del particular balance entre tamaño, geometría y orientación de la fase dispersa que tiende a dominar sobre la adhesión interfacial, detectándose procesos de cavitación en la mayoría de las condiciones de ensayos que promovieron pocas mejoras o decaimiento en los parámetros de fractura respecto al PET. Cabe destacar que los parámetros de fractura LEFM indicaron que todos los materiales presentaron una fractura en condiciones mixtas con una componente importante de tensión plana, con excepción de las mezclas PET/PHEB que corresponderían a condiciones de deformación plana, todo lo cual fue corroborado a través del análisis fractográfico.