Spelling suggestions: "subject:"cartílago"" "subject:"cartilage""
1 |
A new experimental model to study bone and cartilage formation using a bioengineering approachQuintana Frigola, Lluís 19 June 2009 (has links)
La medicina regenerativa és una disciplina que ha guanyat reconeixement en les últimes dècades pel fet que moltes malalties no són tractables amb fàrmacs convencionals. Molts grups de recerca i empreses inverteixen temps i diners en la producció de nous paradigmes per curar malalties com el Parkinson, l'artrosi o la regeneració de medul·la espinal. Aquestes propostes es basen en l'ús de teixits biomimètics per reparar òrgans danyats. En aquesta tesi es presenta un nou model experimental per estudiar la formació d'os i cartílag i eventualment la reparació d'aquests teixits. Hem utilitzat Fibroblasts Embriònics de Ratolí (MEFs) combinats amb diferents materials biomimètics per estudiar os i cartílag in vitro i in vivo. Aquests MEFs es van cultivar in vitro i in vivo en RAD16-I, un pèptid auto-ensamblable amb estructura similar a matrius extracel·lulars genèriques, amb l'objectiu d'estudiar l'evolució dels fibroblasts en aquestes dues condicions. També s'han recobert superficialment micropartícules de hidroxiapatita obtenint càrregues inorgàniques similars a l'os i biològicament actives per a utilitzar-les com a substituts d'os o cartílag. Amb la idea de millorar els recobriments superficials, hem desenvolupat una plataforma que permet dur a terme proves combinatòries amb factors de creixement i altres compostos biològicament actius. Cultius in vitro de MEFs han mostrat que quan fibroblasts embrionaris primaris de ratolí es cultiven en RAD16-I, estableixen una xarxa intercel·lular que causa una contracció cel·lular organitzada, proliferació i migració cel·lulars i culmina amb la formació d'una estructura bilateral i simètrica amb un eix central distingible. Durant aquest procés morfològic, augmenta l'expressió d'un grup de gens mesodèrmics (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). L'expressió de brachyury està localitzada primer en l'eix de simetria central i després s'extén als dos costats de l'estructura. Per acabar, la formació espontània d'un teixit similar al del cartílag acompanya l'expressió de Sox9 i Runx2.L'estudi in vivo de MEFs es va fer gràcies a la tècnica de presa d'imatges no invasiva basada en bioluminiscència (BLI) que ha desenvolupat en el grup de recerca del dr. Jerónimo Blanco. Aquests experiments han mostrat que el RAD16-I és una matriu molt permissiva per a la supervivència i proliferació cel·lulars in vivo. A més, sembla que les pobres propietats mecàniques que té el RAD16-I no li suposen cap desavantatge en termes de creixement cel·lular in vivo. Finalment, hem desenvolupat diferents tipus de micropartícules de hidroxiapatita (HA) no recobertes, i recobertes mitjançant polimerització assistida per plasma. Els recobriments permeten afinar les propietats de la HA i produir partícules que satisfacin les necessitats de diferents aplicacions mèdiques en reparació d'os i cartílag. També hem desenvolupat un mètode per produir plataformes basades en plaques de 96 pous que permetin fer proves combinatòries amb compostos biològicament actius per vàries aplicacions en medicina regenerativa. En conclusió, hem aportat noves idees i eines que permetran trobar teixits regeneratius basats en l'ús de fibroblasts i materials biomimètics. / La medicina regenerativa es una disciplina que ha ganado reconocimiento en las últimas décadas porque muchas enfermedades no son tratables con fármacos convencionales. Muchos grupos de investigación y empresas invierten tiempo y dinero en la producción de nuevos paradigmas para curar enfermedades como el Parkinson, la artrosis o la regeneración de médula espinal. Estas propuestas se basan en el uso de tejidos biomiméticos para reparar órganos dañados. En esta tesis se presenta un nuevo modelo experimental para estudiar la formación de hueso y cartílago y tal vez la reparación de estos tejidos. Hemos utilizado Fibroblastos Embrionarios de Ratón (MEFs) combinados con diferentes materiales biomiméticos para estudiar hueso y cartílago in vitro e in vivo. Estos MEFs se cultivaron in vitro e in vivo en RAD16-I, un péptido auto-ensamblable con estructura similar a matrices extracelulares genéricas, con el objetivo de estudiar la evolución de los fibroblastos en estas dos condiciones. También se han recubierto superficialmente micropartículas de hidroxiapatita obteniendo cargas inorgánicas similares al hueso y biológicamente activas para utilizarlas como sustitutos de hueso o cartílago. Con la idea de mejorar los recubrimientos superficiales, hemos desarrollado una plataforma que permite llevar a cabo pruebas combinatorias con factores de crecimiento y otros compuestos biológicamente activos. Cultivos in vitro de MEFs han mostrado que cuando fibroblastos embrionarios primarios de ratón se cultivan en RAD16-I, establecen una red intercelular que causa una contracción celular organizada, proliferación y migración celulares y culmina con la formación de una estructura bilateral y simétrica con un eje central distinguible. Durante este proceso morfológico, aumenta la expresión de un grupo de genes mesodérmicos (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). La expresión de brachyury está localizada primero en el eje de simetría central y después se extiende a los dos lados de la estructura. Para terminar, la formación espontánea de un tejido similar al del cartílago acompaña a la expresión de Sox9 y Runx2.El estudio in vivo de MEFs se hizo gracias a la técnica de toma de imágenes no invasiva basada en bioluminiscencia (BLI) que han desarrollado en el grupo de investigación del dr. Jerónimo Blanco. Estos experimentos han mostrado que el RAD16-I es una matriz muy permisiva para a la supervivencia y proliferación celulares in vivo. Además, parece que las pobres propiedades mecánicas que tiene el RAD16-I no le suponen ninguna desventaja en términos de crecimiento celular in vivo. Finalmente, hemos desarrollado diferentes tipos de micropartículas de hidroxiapatita (HA) no recubiertas, y recubiertas mediante polimerización asistida por plasma. Los recubrimientos permiten afinar las propiedades de la HA y producir partículas que satisfagan las necesidades de diferentes aplicaciones médicas en reparación de hueso y cartílago. También hemos desarrollado un método para producir plataformas basadas en placas de 96 pozos que permitan hacer pruebas combinatorias con compuestos biológicamente activos para varias aplicaciones en medicina regenerativa. En conclusión, hemos aportado nuevas ideas y herramientas que permitirán hallar tejidos regenerativos basados en el uso de fibroblastos y materiales biomiméticos. / Regenerative medicine is a discipline that has gained recognition in the last decades because many diseases are not treatable with traditional drugs. Many research groups and companies invest time and money in the production of new paradigms to cure conditions such as Parkinson's, arthrosis or spinal cord injuries. These approaches are based in the use of biomimetic tissues to replace damaged organs. In this work we present a new experimental model to study the formation of bone and cartilage and eventually to repair these tissues. We have used Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) combined with different biomimetic materials to study bone and cartilage formation in vitro and in vivo. MEFs have been cultured in vitro and in vivo in RAD16-I, a synthetic self-assembling peptide with structure similar to generic extracellular matrix milieu, to study the evolution of these fibroblasts in both conditions. Also, hydroxyapatite microparticles have been surface coated to produce biologically active bone-like inorganic charges for use in cartilage or bone substitutes. In order to improve the particles' coatings, we have developed a platform that allows us to perform combinatorial testing of growth factors and other biologically active compounds. In vitro cultures of MEFs has shown that when primary mouse embryonic fibroblasts are cultured in a soft nanofiber scaffold, they establish a cellular network that causes an organized cell contraction, proliferation, and migration that ends in the formation of a symmetrically bilateral structure with a distinct central axis. A subset of mesodermal genes (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2) is upregulated during this morphogenetic process. The expression of brachyury was localized first at the central axis, extending then to both sides of the structure. The spontaneous formation of cartilage-like tissue mainly at the paraxial zone followed the expression of Sox9 and Runx2.In vivo study of MEFs was facilitated by a non-invasive bioluminescence imaging (BLI) technique to detect luciferase-expressing cells, developed by Dr. Blanco's research group. These experiments showed that RAD16-I is a very permissive scaffold for cell survival and proliferation in vivo. Furthermore, it seems that the poor mechanical properties of RAD16-I are no disadvantage in terms of cell growth in vivo.Finally, we have developed different types of coated and uncoated hydroxyapatite (HA) microparticles by plasma polymerization. The coatings permit to tune the properties of HA and produce particles that suit the needs of different medical applications in bone and cartilage repair. Moreover, we have developed a method to produce platforms based on 96-well plates that allow the combinatorial testing of biologically active compounds for various applications in regenerative medicine. In conclusion, we have supplied new insights and tools that will enhance the finding of new regenerative tissues based on fibroblasts and biomimetic materials.
|
2 |
Design and development of biomimetic surfaces and three-dimensional environments to study cell behaviorMarí Buyé, Núria 11 May 2012 (has links)
La biomimètica o biomimetisme són termes que simbolitzen el concepte “aprendre de la naturalesa”, és a dir, aprendre dels seus sistemes, processos i models, a fi d’utilitzar la natura com a font d’inspiració per solucionar problemes de l’home. El biomimetisme és actualment un concepte recurrent en l’àrea d’enginyeria de teixits i d’ell en sorgeixen idees per obtenir plataformes més elegants i sofisticades que puguin imitar millor les interacciones entre les cèl•lules i el seu ambient. Aquesta tesi pretén desenvolupar models, en dues i en tres dimensions, mitjançant la recreació d’un o més factors característics de l’ambient natural de la cèl•lula i que juguen un paper important en el comportament cel•lular.
Se sap que tant les propietats químiques com les mecàniques de la matriu extracel•lular influeixen sobre les funcions cel•lulars. És per això que es va dissenyar un nou film polimèric que pogués combinar un hidrogel, amb propietats mecàniques variables, amb un monòmer reactiu capaç d’immobilitzar biomolècules. Degut a la complexitat del polímer dissenyat, va ser necessari recórrer a una tècnica de polimerització superficial molt versàtil com és la deposició química iniciada en fase vapor (més coneguda pel seu acrònim en anglès iCVD). Els polímers varen ser àmpliament caracteritzats i es va corroborar que podien ser modificats amb petites biomolècules com ara pèptids senyalitzadors. Les superfícies resultants són bioactives i permeten l’adhesió de cèl•lules endotelials.
Unes altres superfícies biomimètiques, rellevants en l’àmbit de l’enginyeria de teixits d’os, es varen obtenir a partir d’una hidroxiapatita sintetitzada pel mètode de sol-gel submergint-la en diferents medis fisiològics. La dissolució i posterior reprecipitació dels ions proporcionen una capa d’apatita amb una composició similar a la que es troba in vivo. Els experiments evidencien la importància de partir d’un material relativament soluble. És per això que la hidroxiapatita pura no és capaç d’induir la precipitació d’aquesta apatita biomimètica in vitro. Diversos investigadors han relacionat la capacitat de formar apatita amb la bioactivitat del material, entenent bioactivitat com l’habilitat d’aquests materials de promoure la unió amb l’os.
Per a l’enginyeria de teixits, però, és necessari un ambient tridimensional per tal de generar un teixit artificial. S’ha desenvolupat un nou model basat en l’ús d’un gel molt tou per tal d’obtenir un teixit dur com el de l’os. Malgrat que aquests dos conceptes poden semblar contradictoris, les cèl•lules adquireixen l’habilitat d’allargar-se ràpidament i crear una densa xarxa cel•lular dins d’aquest ambient poc restrictiu des d’un punt de vista mecànic. La consegüent contracció del sistema acaba formant un constructe més petit i resistent. Aquest és un sistema biomimètic ja que promou una gran interacció cel•lular i també la condensació de les cèl•lules, esdeveniments que tenen lloc també durant el desenvolupament de l’os i el cartílag. El model es va caracteritzar extensament amb cèl•lules ostoprogenitores MC3T3-E1 que es diferenciaren amb inducció química. A més a més, es va demostrar que l’ambient tridimensional podia promoure l’expressió espontània de marcadors osteogènics. Degut a les interessants propietats del sistema, el mateix model es va utilitzar per induir la diferenciació condrogènica de fibroblastos dermals humans. Aquests tipus cel•lular no ha estat gaire explorat en l’àmbit de l’enginyeria de teixits, malgrat que ofereix un gran potencial en teràpia regenerativa. Aquest treball proporciona proves de la capacitat condrogènica d’aquestes cèl•lules en el sistema tridimensional prèviament desenvolupat. / La biomimètica o biomimetismo son términos que simbolizan el concepto “aprender de la naturaleza”, es decir, aprender de sus sistemas, procesos y modelos, y utilizarlos como fuente de inspiración para solucionar problemas del hombre. El biomimetismo es actualmente un concepto recurrente en el área de ingeniería de tejidos y de este surgen ideas para obtener plataformas más elegantes y sofisticadas que puedan mimetizar mejor las interacciones entre las células y su ambiente. La presente tesis se centra en desarrollar modelos, tanto en dos como en tres dimensiones, mediante la recreación de uno o más factores que caracterizan el ambiente natural de la célula y que tienen su rol importante en el comportamiento celular.
Se conoce que tanto las propiedades químicas como mecánicas de la matriz extracelular influyen en las funciones celulares. Debido a esto, se diseñó un nuevo film polimérico que pudiera combinar un hidrogel, con propiedades mecánicas variables, con un monómero reactivo, capaz de inmovilizar biomoléculas. Debido a la complejidad del polímero diseñado, fue necesario recurrir a una técnica de polimerización superficial muy versátil como es la deposición química iniciada en fase vapor (más conocida por su acrónimo en inglés iCVD). Los polímeros fueron ampliamente caracterizados y se corroboró que podían ser modificados con pequeñas biomoléculas como péptidos señalizadores. Las superficies resultantes son bioactivas y permiten la adhesión de células endoteliales.
Se obtuvieron otro tipo de superficies biomiméticas relevantes en el ámbito de la ingeniería de tejidos de hueso, a partir de una hidroxiapatita sintetizada por el método sol-gel sumergiéndolas en diferentes medios fisiológicos. La disolución y posterior reprecipitación de los iones proporcionan una capa de apatita con una composición similar a la que se encuentra in vivo. Los experimentos evidencian la importancia de partir de un material relativamente soluble. Precisamente debido a esto la hidroxiapatita pura no es capaz de inducir la precipitación de esta apatita biomimética in vitro. Varios investigadores han relacionado la capacidad de formar apatita con la bioactividad del material, entendiendo bioactividad como la habilidad de estos materiales de promover la unión con el hueso.
De todos modos, en ingeniería de tejidos, es necesario un ambiente tridimensional para generar un tejido artificial. Se ha desarrollado un nuevo modelo basado en el uso de un gel blando para obtener tejido duro como el del hueso. Aunque estos conceptos pueden parecer contradictorios, las células adquieren la habilidad de estirarse rápidamente y de formar una densa red celular dentro de este gel tan poco restrictivo desde un punto de vista mecánico. La consiguiente contracción del sistema acaba formando un constructo mucho más pequeño y resistente. Este es un sistema biomimético ya que promueve una gran interacción celular y también la condensación de las células, eventos que también ocurren durante el desarrollo de hueso y cartílago. El modelo se caracterizó extensamente con células osteoprogenitoras MC3T3-E1 que se diferenciaron bajo inducción química. Además, se demostró que el microambiente tridimensional podía promover la expresión espontánea de marcadores osteogénicos. Debido a las interesantes propiedades del sistema, el mismo modelo se usó para inducir la diferenciación condrogénica de fibroblastos dermales humanos. Este tipo celular no ha sido demasiado explorado en ingeniería de tejidos, a pesar de que puede tener un gran potencial en terapia regenerativa. Este trabajo proporciona pruebas de la capacidad condrogénica de estas células en el sistema tridimensional previamente desarrollado. / Biomimetics or biomimicry are terms that imply “learning from nature”, from its systems, processes and models, in order to use nature as inspiration to solve human problems. In tissue engineering, biomimetics is nowadays a recurrent term and a source of ideas to obtain more elegant and sophisticated platforms that could better mimic the interactions between cells and their environment. This thesis is focused on developing models both in two- and three-dimensions by recreation of one or more factors of the cell natural environment that are known to play an important role in cell behavior.
Since both the chemical and mechanical properties of the extracellular matrix are known to effectively influence cell function, an innovative polymeric thin film was designed combining a hydrogel with tunable mechanical properties and a reactive molecule, capable to immobilize biomolecules. Due to the complexity of the polymers, a versatile technique such as initiated chemical vapor deposition (iCVD) was required for the synthesis. Extensive characterization revealed that nanostructured hydrogels were obtained and that small biomolecules, such as signaling peptides, could be attached on the surface. The final surfaces are bioactive and support endothelial cell attachment.
Relevant biomimetic surfaces for bone tissue engineering could also be obtained from a sol-gel synthesized hydroxyapatite after immersion in different physiological media. The dissolution and posterior reprecipitation of the ions rendered a final apatite layer with a composition similar to that found in vivo. The experiments evidenced the importance of starting from a rather soluble material and, thus, pure hydroxyapatite was not able to promote apatite precipitation in vitro. This capacity has been related to the material bioactivity by many researchers in terms of its ability to bond to bone in tissue engineering applications.
However, for tissue engineering a three-dimensional environment is required to build tissue-like constructs. A new model was developed based on the use of a very soft gel to obtain hard tissue. Although the concepts might seem to work in opposite directions, cells gain the ability to rapidly elongate and form a dense cellular network within this unrestrictive environment. Subsequent contraction of the whole system rendered a smaller and stronger final tissue-like construct. This system was considered biomimetic as it promotes high cell-cell interaction and cellular condensation, which are events that occur in bone and cartilage development. This system was extensively characterized with osteoprogenitor MC3T3-E1 cells that could undergo full osteogenic differentiation under chemical induction. More interestingly, the three-dimensional microenvironment was also able to promote by itself spontaneous expression of bone-related markers. Due to the interesting properties of this system, the same model was used to induce chondrogenic differentiation of human dermal fibroblasts. This cell type has been poorly explored for tissue engineering applications, but it might have great potential in future therapeutic platforms. This work provides proof of concept of chondrogenic potential of these cells in this three-dimensional system.
|
Page generated in 0.034 seconds