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Estudio mecánico, histológico e histomorfométrico del regenerado de cartílago a partir de injertos de periostio invertidoMartín Hernández, Carlos 17 April 2002 (has links)
Introducción:Basándose en la capacidad condrogénica de su capa profunda, el periostio ha sido empleado para el recubrimiento y reparación de lesiones condrales y osteocondrales.Los objetivos de este trabajo son:1. Analizar las propiedades viscoelásticas del tejido de reparación obtenido a partir de injertos libres de periostio invertido sobre defectos osteocondrales de espesor completo.2. Determinar si la similitud de las características histológicas del tejido de reparación a partir de los mencionados injertos con el cartílago sano se corresponde con una semejanza en el comportamiento biomecánico. 3. Determinar la influencia de la movilización continua pasiva sobre la naturaleza y propiedades mecánicas del tejido de reparación.4. Evaluar la durabilidad del tejido de reparación a largo plazo.Material y método:Se realizaron defectos de 4x4 mm en el surco patelar de la rodilla derecha de 57 conejos New Zealand adolescentes de tres meses de edad que fueron recubiertos con un autoinjerto libre de periostio invertido. De los 50 conejos aptos 24 fueron sometidos a movilización contínua pasiva durante 2 semanas 8 horas diarias y 26 a movilidad libre. Las patas izquierdas fueron utilizadas como control. El sacrificio se realizó a las 8 semanas en 43 conejos y a las 36 semanas en otros 7. Se realizó estudio histológico (aplicando una modificación de la escala de O´Driscoll), histomorfométrico y mecánico empleando un sistema de indentacion para calcular la rigidez elástica del tejido de reparación.Resultados:Los resultados macroscópicos fueron 65.1% buenos, 27.9% regulares y 6.9% malos a las 8 semanas. A las 36, 14.2%, 71.4% y 14.2%. En el 69.7% de los casos el tejido fue considerado hialino. No hubo diferencias según movilidad a las 8 semanas. A las 36, el porcentaje de tejido hialino disminuyó, pero en un grado mucho mayor en el grupo de MAI.A las 8 semanas, el tejido regenerado era más grueso que el control, sin observarse influencia de la movilización sobre los parámetros histomorfométricos. A las 36 semanas el tejido mostraba características estructurales peores y menor grosor, apareciendo fenómenos degenerativos. El coeficiente de rigidez elástica mostró una relación inversamente proporcional al grosor del tejido en estudioConclusiones:1. El tejido de reparación cuando presenta características hialinas, tiene un comportamiento viscoelástico similar al del cartílago hialino. 2. La rigidez elástica es menor en el tejido regenerado que en el cartílago normalprobablemente por un mayor grosor del primero.3. La MCP no influye en la aparición de uno u otro tipo de tejido ni en los parámetros histológicos, histomorfométricos ni mecánicos a las 8 semanas, Sin embargo, a largo plazo parece ejercer un efecto protector sobre el tejido de reparación.4. A las 36 semanas aparecieron fenómenos degenerativos y un aumento de la rigidez elástica, datos que confirman la escasa durabilidad del tejido de reparación. / Introduction:Periosteum has been used to resurface chondral defects based on its capability to regenerate cartilage.The objectives of this study are:1. To analyse the viscoelastic properties of the regenerated tissue obtained from periosteal grafts in full-thickness defects. 2. To correlate the histological and histomorphometrical characteristics with the mechanical properties of the tissue. 3. To find the influence of continuous passive motion on the histological and mechanical properties.4. To evaluate the durability of the regenerated tissue.Material and method:Full thickness 4mm defects were performed in the patellar groove of the right knee of 57 young New Zealand white rabbits. All of them were resurfaced with free periosteal autografts with the deep aspect facing the joint. 50 rabbits underwent histologic, hystomorphometric and mechanical study. 24 were placed on a continuous passive motion machine 8 hours a day during 2 weekse and 26 returned to cage activity.Left limbs were used as control. 43 animals were sacrifized at 8 weeks and 7 at 36 weeks postoperatively. Results:Macroscopic results were good in 65.1% of the cases, fair in 27.9% and poor in 6.9% at 8 weeks. At 36 weeks results were 14.2%, 71.4% and 14.2% respectively. Regenerated tissue was considered to be hyaline in 69.7% of the cases. There were no differences induced by motion at 8 weeks. Hyaline tissue decreased at 36 weeks, more significantly in the IAM group.At 8 weeks regenerated tissue was thicker than control independently of the motion protocol. Tissue was thinner at 36 weeks, and showed worse structural characteristics with degeneative changes.Elas tic stiffness was inversely proportional to the thikness of the tissue. Conclusions:1. Regenerated hyaline tissue shows viscoelastic properties similar to those of the normal cartilage. 2. Elastic stifness is lower in the regenerated tissue than in control cartilage , probably due to its higher thickness.3. There is no influence of the CPM on the histological, histomorphometrical and mechanical parametres at 8 weeks, but at 36 weeks there is a protective effect of the CPM over the regenerated tissue. 4. Regenerated tissue showed degenerative changes at 36 weeks with an increase in elastic stiffness. These data confirm the scarce durability of the regenerated tissue.
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Cultivo primario de condrocitos a partir de cartílago hialino articular de Equus Caballus post-mortemVegas Albino, Diana Pamela January 2011 (has links)
El objetivo de esta tesis fue obtener un cultivo primario de condrocitos de Equus caballus post-mortem, aislados de cartílago hialino articular esternocostal.
Se colectaron un total de 24 de cajas torácicas de caballos beneficiados para consumo humano y animal, obtenidos del Camal de Equinos Casablanca ubicado en el distrito de Pachacamac, Lima; de cada una de ellas se obtuvieron 4 muestras de cartílago de forma semiovalada irregular de 0.8 cm de ancho, 0.6 cm de largo y 0.2 cm de alto aproximadamente. El aislamiento de condrocitos se realizó de forma mecánica, con la técnica de cuchillas cruzadas de Freshney (2005), y de forma enzimática con solución de tripsina 0.05 % con 0.5 g de EDTA, solución de colagenasa 0.2% y 0.04 %. Luego las células fueron cultivados en Basal Medium Eagle (BME) + 10% Suero Bovino Fetal (SBF), BME + 5%SBF, Tissue Culture Medium-199 (TCM-199) + 10%SBF y TCM-199 + 5%SBF; por un periodo de 10 días a 37 °C, 5% de CO 2 y 5% de humedad. Posteriormente, las células fueron resuspendidas de las placas en solución de tripsina (tripsina 0.05%, EDTA 0.2 g.), para contarlas en una cámara de Neubauer y así determinar la tasa de proliferación y la tasa de supervivencia.
Se observó un incremento en la proliferación celular tanto en BME como en TCM-199 con 10% de SBF, siendo la tasa de proliferación obtenida para BME+10%SBF de 4,550+/-1,366, para TCM-199+10%SBF de 3,709+/-1,183, para BME+5%SBF de 0,438+/-0,095 y para TCM-199+5%SBF de 0,388+/-0,093; por tanto, el medio de cultivo que obtuvo la mejor tasa de proliferación fue BME + 10%SBF. La tasa de supervivencia no superó el valor de 1 en todos los medios; sin embargo, la que se acercó más a este valor fue la obtenida con BME + 10%SBF (0.987+/-0.025).
En conclusión, se logró obtener un cultivo primario de condrocitos a partir de cartílago hialino articular esternocostal de Equus caballus post-mortem, siendo BME + 10% SBF el medio que presentó los mejores resultados. / --- The objective of this thesis was to obtain a primary culture of chondrocytes from postmortem Equus caballus, isolated from hyaline articular sternocostal cartilage.
We collected a total of 24 rib cages of benefit horses for human and animal consumption, obtained from Casablanca Equine Camal located in the district of Pachacamac, Lima; from each one we obtained 4 irregular semi-oval samples of 0.8 cm width, 0.6 cm long and 0.2 cm tall. The isolation of chondrocytes was performed mechanically, with the technique of cross blades from Freshney (2005), and so enzymatically with 0.05% trypsin solution with 0.5 g of EDTA, 0.2% and 0.04% collagenase solution. Then they were grown in Basal Medium Eagle (BME) + 10% Fetal Bovine Serum (FBS), BME + 5% FBS, Tissue Culture Medium-199 (TCM-199) + 10% FCS and TCM-199 + 5% FBS; for a period of 10 days at 37 ° C, 5% CO2 and 5% humidity. Subsequently, cells were resuspended from the plates in trypsin solution (trypsin 0.05%, EDTA 0.2 g.), to count them in a Neubauer chamber and to determine the proliferation rate and survival rate, respectively.
We observed an increase in cell proliferation in both BME and in TCM-199 with 10% FBS, the proliferation rate obtained for BME +10% FBS was 4.550 + / -1.366, for TCM-199 +10% FBS was 3.709 + / -1.183, for BME +5% FBS was 0.438 + / -0.095 and for TCM-199 + 5 % SBF was 0.388 + / -0.093, therefore the culture medium that obtained the best proliferation rate was BME + 10% FBS. The survival rate did not exceed the value of 1 in all media, but the one closer to this value was the obtained with BME + 10% FBS (0987 + / -0025).
In conclusion, it was possible to obtain a primary culture of chondrocytes from hyaline articular sternocostal cartilage of Equus caballus post-mortem, being BME + 10% FBS the medium which had the best results.
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Determinación de nitrito en suero sanguíneo y líquido sinovial de articulación carpal equina con inflamación aguda y con patología carpal crónica reagudizadaQuezada Catalán, Mauricio Andrés January 2006 (has links)
Memoria para optar al Título
Profesional de Médico Veterinario / El óxido nítrico ( NO), producido en grandes cantidades por los ˙ condrocitos y células
inflamatorias en una articulación dañada puede generar activación de enzimas degradativas de
la matriz del cartílago, disminución en la síntesis de sus biomoléculas y apoptosis de
condrocitos. Parte del ˙NO producido se transforma en nitrito, el cual se puede medir por la
reacción de Griess. El objetivo de este estudio fue comparar el promedio de nitrito en líquido
sinovial y suero sanguíneo entre grupos de equinos Fina Sangre de Carrera con cuadros
articulares inflamatorios agudos y crónicos con reagudización, para establecer si la menor
cantidad de cartílago articular en el caso de los cuadros crónicos se traduce en una menor
concentración de nitrito tanto en LS como en suero sanguíneo.
Se tomaron muestras de líquido sinovial y suero sanguíneo de equinos que cursaran con
un cuadro inflamatorio agudo de la articulación carpal (n=10), principalmente fractura en chip
o sinovitis diagnosticadas clínica y/o radiológicamente al momento de la toma de muestra, se
incluyen equinos con diagnóstico de cuadro crónico al momento de la toma de muestra (n=15),
desde la misma articulación. Además se obtuvo muestras de suero sanguíneo desde equinos
normales para usarlos como control (n=10). En todas las muestras se determinó la
concentración de nitrito por reacción de Griess y además se midió la concentración de proteínas
como indicador del estado del animal por el método colorimétrico de Lowry et al.
No se encontraron diferencias significativas en la concentración de proteínas en LS
entre los grupos agudos (26,1 ± 6,2 mg/mL) y crónicos con reagudización (25,2 ± 8,1 mg/mL).
Tampoco se encontraron diferencias significativas en la concentración de nitrito tanto en el LS
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entre los grupos agudo (95,1 ± 41,4 μmol/L) y crónico con reagudización (75,8 ± 21,2 μmol/L)
como en el suero con valores de 471,4 ± 115,4 μmol/L para los cuadros agudos en comparación
con los cuadros crónicos con reagudización (427,9 ± 101,9 μmol/L) y con los cuadros normales
(455,9 ± 91,1 μmol/L). Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) en los valores de
proteínas séricas entre los grupos agudo y normal, pero a favor del grupo normal, obteniendo el
grupo agudo un promedio de 56,5 ± 11,2 mg/mL, los normales 67,0 ± 3,1 mg/mL, y finalmente
el grupo de los crónicos reagudizados con 60,7 ± 7,5 mg/mL.
La concentración de nitrito en el líquido sinovial en los grupos agudo y crónico
reagudizado no muestra diferencia significativa, lo que podría deberse a que ambos grupos
están cursando un cuadro inflamatorio, que genera infiltración con células que también
producen ˙NO.
La ausencia de diferencia en la concentración de nitrito en el suero sanguíneo entre los
grupos agudo, crónico reagudizado y normal, sugiriere que la concentración de nitrito en el
suero sanguíneo no es un buen reflejo de la producción de ˙NO a nivel articular.
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Células troncales mesenquimáticas en presencia de ácido hialurónico y dexametasona regeneran cartílago articularNazal Lama, Nicolás Ignacio January 2006 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Las estrategias clínicamente usadas para el tratamiento de lesiones articulares se enfocan en aliviar el dolor y la inflamación, porque el cartílago adulto tiene una mínima capacidad regenerativa. Así, frente a un daño severo el cartílago hialino es remplazado por cartílago fibroso, que se distingue del primero en la composición de su MEC y en consecuencia, en sus propiedades biomecánicas.
El objetivo del presente trabajo es desarrollar una estrategia de terapia celular que permita regenerar el cartílago articular. La hipótesis de trabajo es que células troncales mesenquimáticas (MSC) autólogas, embebidas en ácido hialurónico (HA) e implantadas en una lesión condral grave, en presencia de dexametasona como anti-inflamatorio e inductor de diferenciación, regeneran in vivo cartílago hialino y no fibrocartílago.
Para evaluar dicha hipótesis, se produjo quirúrgicamente una lesión de 20,25 mm2 x 1,5 mm de profundidad (aproximadamente 30 mm3) en el cartílago patelar de conejos New Zealand. Dos semanas después, en dicha lesión se implantaron 1x106 cMSC, previamente aisladas de la médula ósea del mismo animal, embebidas en HA. A partir de ese momento, se inyectó intra-articularmente 0,25 mg/Kg de dexametasona una vez a la semana. A las 6 semanas post-implante, los conejos fueron sometidos a eutanasia, se disectaron sus cartílagos articulares y se analizaron molecularmente en función de la expresión de col1, col2, vers, agg y gapdh, para discriminar entre cartílago hialino y fibroso.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que es factible obtener MSC a partir de aspirados de médula ósea de conejo, dado que las células adherentes aisladas proliferan en presencia de un medio definido suplementado con suero fetal bovino (SFB) y se diferencian in vitro a adipocitos, osteocitos y condrocitos.
Por su parte y como era de esperar, se observó que las lesiones condrales de espesor completo cicatrizan a expensas de tejido fibroso, que expresa altos niveles de col1 y vers y bajos niveles de col2 y agg. En cambio, si a 2 semanas post-lesión, en ella se implantan cMSC embebidas en HA y luego se inyecta intra-articular y post-operatoriamente dexametasona, 6 semanas post-implante se genera un cartílago que expresa altos niveles de col2 y agg y bajos niveles de col1 y vers. Estos resultados sugieren que es posible regenerar cartílago hialino utilizando MSC en presencia de HA y dexametasona en un plazo de 6 semanas. Lo cual debe corroborarse con estudios histológicos y funcionales, para poder afirmar que se dispone de una estrategia terapéutica que garantiza la regeneración del cartílago hialino
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Modificaciones histológicas del cartílago hialino a nivel de la articulación maleolar en ratas artríticas tratadas con Zea mays L (variedad morada)Villalobos Pacheco, Eduardo Jesús January 2017 (has links)
Demuestra que el extracto de Zea mays L reduce las modificaciones histológicas en el cartílago hialino a nivel de la articulación maleolar en términos de la estructura, células y estado de integridad del cartílago, en ratas artríticas inducidas por pristane. Realiza un modelo de artritis en ratas Sprague Dawley inducido por pristane vía subdérmica (0.2 ml). Se distribuyeron en control positivo (n=10) vehículo (1ml/100g), Metotrexato (n=10) 0,1mg/Kg, Indometacina (n=10) 0.6 mg/kg, Zea mays 1% (n=10) 100mg/Kg, Zea mays 10% (n=10) 1000mg/Kg, Metotrexato +Zea mays 10% (n=10) 1000mg/Kg + 0,1mg/Kg, control negativo (n=5) VO (21 días), evaluándose la estructura, modificaciones celulares y estado de integridad del cartílago histológicamente a nivel de la articulación maleolar. Encuentra que Zea mays 1%, 10% y Metotrexato + Zea mays 10% presentaron diferencias al control positivo en estructura del cartílago. Las modificaciones celulares evidenciaron diferencias sólo en control positivo y en Metotrexato con Zea mays 10%. Hay diferencias en relación a la integridad del cartílago entre Zea mays 10% y Metotrexato + Zea mays 10% en comparación al control positivo. En el control positivo el 70% desarrolló artritis moderada y en Zea mays 1% fue 60%. El grupo Zea mays 10% desarrolló artritis moderada (40%), y otro 40% no desarrolló la enfermedad. El grupo Metotrexato +Zea mays 10%, el 70% no desarrolló la enfermedad, y ninguno hizo artritis moderada. Demuestra que la reducción de las modificaciones histológicas en el cartílago hialino a nivel de la articulación maleolar en términos de la estructura, células y estado de integridad del cartílago, tratadas Zea mays L en ratas son significativas. / Tesis
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A new experimental model to study bone and cartilage formation using a bioengineering approachQuintana Frigola, Lluís 19 June 2009 (has links)
La medicina regenerativa és una disciplina que ha guanyat reconeixement en les últimes dècades pel fet que moltes malalties no són tractables amb fàrmacs convencionals. Molts grups de recerca i empreses inverteixen temps i diners en la producció de nous paradigmes per curar malalties com el Parkinson, l'artrosi o la regeneració de medul·la espinal. Aquestes propostes es basen en l'ús de teixits biomimètics per reparar òrgans danyats. En aquesta tesi es presenta un nou model experimental per estudiar la formació d'os i cartílag i eventualment la reparació d'aquests teixits. Hem utilitzat Fibroblasts Embriònics de Ratolí (MEFs) combinats amb diferents materials biomimètics per estudiar os i cartílag in vitro i in vivo. Aquests MEFs es van cultivar in vitro i in vivo en RAD16-I, un pèptid auto-ensamblable amb estructura similar a matrius extracel·lulars genèriques, amb l'objectiu d'estudiar l'evolució dels fibroblasts en aquestes dues condicions. També s'han recobert superficialment micropartícules de hidroxiapatita obtenint càrregues inorgàniques similars a l'os i biològicament actives per a utilitzar-les com a substituts d'os o cartílag. Amb la idea de millorar els recobriments superficials, hem desenvolupat una plataforma que permet dur a terme proves combinatòries amb factors de creixement i altres compostos biològicament actius. Cultius in vitro de MEFs han mostrat que quan fibroblasts embrionaris primaris de ratolí es cultiven en RAD16-I, estableixen una xarxa intercel·lular que causa una contracció cel·lular organitzada, proliferació i migració cel·lulars i culmina amb la formació d'una estructura bilateral i simètrica amb un eix central distingible. Durant aquest procés morfològic, augmenta l'expressió d'un grup de gens mesodèrmics (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). L'expressió de brachyury està localitzada primer en l'eix de simetria central i després s'extén als dos costats de l'estructura. Per acabar, la formació espontània d'un teixit similar al del cartílag acompanya l'expressió de Sox9 i Runx2.L'estudi in vivo de MEFs es va fer gràcies a la tècnica de presa d'imatges no invasiva basada en bioluminiscència (BLI) que ha desenvolupat en el grup de recerca del dr. Jerónimo Blanco. Aquests experiments han mostrat que el RAD16-I és una matriu molt permissiva per a la supervivència i proliferació cel·lulars in vivo. A més, sembla que les pobres propietats mecàniques que té el RAD16-I no li suposen cap desavantatge en termes de creixement cel·lular in vivo. Finalment, hem desenvolupat diferents tipus de micropartícules de hidroxiapatita (HA) no recobertes, i recobertes mitjançant polimerització assistida per plasma. Els recobriments permeten afinar les propietats de la HA i produir partícules que satisfacin les necessitats de diferents aplicacions mèdiques en reparació d'os i cartílag. També hem desenvolupat un mètode per produir plataformes basades en plaques de 96 pous que permetin fer proves combinatòries amb compostos biològicament actius per vàries aplicacions en medicina regenerativa. En conclusió, hem aportat noves idees i eines que permetran trobar teixits regeneratius basats en l'ús de fibroblasts i materials biomimètics. / La medicina regenerativa es una disciplina que ha ganado reconocimiento en las últimas décadas porque muchas enfermedades no son tratables con fármacos convencionales. Muchos grupos de investigación y empresas invierten tiempo y dinero en la producción de nuevos paradigmas para curar enfermedades como el Parkinson, la artrosis o la regeneración de médula espinal. Estas propuestas se basan en el uso de tejidos biomiméticos para reparar órganos dañados. En esta tesis se presenta un nuevo modelo experimental para estudiar la formación de hueso y cartílago y tal vez la reparación de estos tejidos. Hemos utilizado Fibroblastos Embrionarios de Ratón (MEFs) combinados con diferentes materiales biomiméticos para estudiar hueso y cartílago in vitro e in vivo. Estos MEFs se cultivaron in vitro e in vivo en RAD16-I, un péptido auto-ensamblable con estructura similar a matrices extracelulares genéricas, con el objetivo de estudiar la evolución de los fibroblastos en estas dos condiciones. También se han recubierto superficialmente micropartículas de hidroxiapatita obteniendo cargas inorgánicas similares al hueso y biológicamente activas para utilizarlas como sustitutos de hueso o cartílago. Con la idea de mejorar los recubrimientos superficiales, hemos desarrollado una plataforma que permite llevar a cabo pruebas combinatorias con factores de crecimiento y otros compuestos biológicamente activos. Cultivos in vitro de MEFs han mostrado que cuando fibroblastos embrionarios primarios de ratón se cultivan en RAD16-I, establecen una red intercelular que causa una contracción celular organizada, proliferación y migración celulares y culmina con la formación de una estructura bilateral y simétrica con un eje central distinguible. Durante este proceso morfológico, aumenta la expresión de un grupo de genes mesodérmicos (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). La expresión de brachyury está localizada primero en el eje de simetría central y después se extiende a los dos lados de la estructura. Para terminar, la formación espontánea de un tejido similar al del cartílago acompaña a la expresión de Sox9 y Runx2.El estudio in vivo de MEFs se hizo gracias a la técnica de toma de imágenes no invasiva basada en bioluminiscencia (BLI) que han desarrollado en el grupo de investigación del dr. Jerónimo Blanco. Estos experimentos han mostrado que el RAD16-I es una matriz muy permisiva para a la supervivencia y proliferación celulares in vivo. Además, parece que las pobres propiedades mecánicas que tiene el RAD16-I no le suponen ninguna desventaja en términos de crecimiento celular in vivo. Finalmente, hemos desarrollado diferentes tipos de micropartículas de hidroxiapatita (HA) no recubiertas, y recubiertas mediante polimerización asistida por plasma. Los recubrimientos permiten afinar las propiedades de la HA y producir partículas que satisfagan las necesidades de diferentes aplicaciones médicas en reparación de hueso y cartílago. También hemos desarrollado un método para producir plataformas basadas en placas de 96 pozos que permitan hacer pruebas combinatorias con compuestos biológicamente activos para varias aplicaciones en medicina regenerativa. En conclusión, hemos aportado nuevas ideas y herramientas que permitirán hallar tejidos regenerativos basados en el uso de fibroblastos y materiales biomiméticos. / Regenerative medicine is a discipline that has gained recognition in the last decades because many diseases are not treatable with traditional drugs. Many research groups and companies invest time and money in the production of new paradigms to cure conditions such as Parkinson's, arthrosis or spinal cord injuries. These approaches are based in the use of biomimetic tissues to replace damaged organs. In this work we present a new experimental model to study the formation of bone and cartilage and eventually to repair these tissues. We have used Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) combined with different biomimetic materials to study bone and cartilage formation in vitro and in vivo. MEFs have been cultured in vitro and in vivo in RAD16-I, a synthetic self-assembling peptide with structure similar to generic extracellular matrix milieu, to study the evolution of these fibroblasts in both conditions. Also, hydroxyapatite microparticles have been surface coated to produce biologically active bone-like inorganic charges for use in cartilage or bone substitutes. In order to improve the particles' coatings, we have developed a platform that allows us to perform combinatorial testing of growth factors and other biologically active compounds. In vitro cultures of MEFs has shown that when primary mouse embryonic fibroblasts are cultured in a soft nanofiber scaffold, they establish a cellular network that causes an organized cell contraction, proliferation, and migration that ends in the formation of a symmetrically bilateral structure with a distinct central axis. A subset of mesodermal genes (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2) is upregulated during this morphogenetic process. The expression of brachyury was localized first at the central axis, extending then to both sides of the structure. The spontaneous formation of cartilage-like tissue mainly at the paraxial zone followed the expression of Sox9 and Runx2.In vivo study of MEFs was facilitated by a non-invasive bioluminescence imaging (BLI) technique to detect luciferase-expressing cells, developed by Dr. Blanco's research group. These experiments showed that RAD16-I is a very permissive scaffold for cell survival and proliferation in vivo. Furthermore, it seems that the poor mechanical properties of RAD16-I are no disadvantage in terms of cell growth in vivo.Finally, we have developed different types of coated and uncoated hydroxyapatite (HA) microparticles by plasma polymerization. The coatings permit to tune the properties of HA and produce particles that suit the needs of different medical applications in bone and cartilage repair. Moreover, we have developed a method to produce platforms based on 96-well plates that allow the combinatorial testing of biologically active compounds for various applications in regenerative medicine. In conclusion, we have supplied new insights and tools that will enhance the finding of new regenerative tissues based on fibroblasts and biomimetic materials.
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Design and development of biomimetic surfaces and three-dimensional environments to study cell behaviorMarí Buyé, Núria 11 May 2012 (has links)
La biomimètica o biomimetisme són termes que simbolitzen el concepte “aprendre de la naturalesa”, és a dir, aprendre dels seus sistemes, processos i models, a fi d’utilitzar la natura com a font d’inspiració per solucionar problemes de l’home. El biomimetisme és actualment un concepte recurrent en l’àrea d’enginyeria de teixits i d’ell en sorgeixen idees per obtenir plataformes més elegants i sofisticades que puguin imitar millor les interacciones entre les cèl•lules i el seu ambient. Aquesta tesi pretén desenvolupar models, en dues i en tres dimensions, mitjançant la recreació d’un o més factors característics de l’ambient natural de la cèl•lula i que juguen un paper important en el comportament cel•lular.
Se sap que tant les propietats químiques com les mecàniques de la matriu extracel•lular influeixen sobre les funcions cel•lulars. És per això que es va dissenyar un nou film polimèric que pogués combinar un hidrogel, amb propietats mecàniques variables, amb un monòmer reactiu capaç d’immobilitzar biomolècules. Degut a la complexitat del polímer dissenyat, va ser necessari recórrer a una tècnica de polimerització superficial molt versàtil com és la deposició química iniciada en fase vapor (més coneguda pel seu acrònim en anglès iCVD). Els polímers varen ser àmpliament caracteritzats i es va corroborar que podien ser modificats amb petites biomolècules com ara pèptids senyalitzadors. Les superfícies resultants són bioactives i permeten l’adhesió de cèl•lules endotelials.
Unes altres superfícies biomimètiques, rellevants en l’àmbit de l’enginyeria de teixits d’os, es varen obtenir a partir d’una hidroxiapatita sintetitzada pel mètode de sol-gel submergint-la en diferents medis fisiològics. La dissolució i posterior reprecipitació dels ions proporcionen una capa d’apatita amb una composició similar a la que es troba in vivo. Els experiments evidencien la importància de partir d’un material relativament soluble. És per això que la hidroxiapatita pura no és capaç d’induir la precipitació d’aquesta apatita biomimètica in vitro. Diversos investigadors han relacionat la capacitat de formar apatita amb la bioactivitat del material, entenent bioactivitat com l’habilitat d’aquests materials de promoure la unió amb l’os.
Per a l’enginyeria de teixits, però, és necessari un ambient tridimensional per tal de generar un teixit artificial. S’ha desenvolupat un nou model basat en l’ús d’un gel molt tou per tal d’obtenir un teixit dur com el de l’os. Malgrat que aquests dos conceptes poden semblar contradictoris, les cèl•lules adquireixen l’habilitat d’allargar-se ràpidament i crear una densa xarxa cel•lular dins d’aquest ambient poc restrictiu des d’un punt de vista mecànic. La consegüent contracció del sistema acaba formant un constructe més petit i resistent. Aquest és un sistema biomimètic ja que promou una gran interacció cel•lular i també la condensació de les cèl•lules, esdeveniments que tenen lloc també durant el desenvolupament de l’os i el cartílag. El model es va caracteritzar extensament amb cèl•lules ostoprogenitores MC3T3-E1 que es diferenciaren amb inducció química. A més a més, es va demostrar que l’ambient tridimensional podia promoure l’expressió espontània de marcadors osteogènics. Degut a les interessants propietats del sistema, el mateix model es va utilitzar per induir la diferenciació condrogènica de fibroblastos dermals humans. Aquests tipus cel•lular no ha estat gaire explorat en l’àmbit de l’enginyeria de teixits, malgrat que ofereix un gran potencial en teràpia regenerativa. Aquest treball proporciona proves de la capacitat condrogènica d’aquestes cèl•lules en el sistema tridimensional prèviament desenvolupat. / La biomimètica o biomimetismo son términos que simbolizan el concepto “aprender de la naturaleza”, es decir, aprender de sus sistemas, procesos y modelos, y utilizarlos como fuente de inspiración para solucionar problemas del hombre. El biomimetismo es actualmente un concepto recurrente en el área de ingeniería de tejidos y de este surgen ideas para obtener plataformas más elegantes y sofisticadas que puedan mimetizar mejor las interacciones entre las células y su ambiente. La presente tesis se centra en desarrollar modelos, tanto en dos como en tres dimensiones, mediante la recreación de uno o más factores que caracterizan el ambiente natural de la célula y que tienen su rol importante en el comportamiento celular.
Se conoce que tanto las propiedades químicas como mecánicas de la matriz extracelular influyen en las funciones celulares. Debido a esto, se diseñó un nuevo film polimérico que pudiera combinar un hidrogel, con propiedades mecánicas variables, con un monómero reactivo, capaz de inmovilizar biomoléculas. Debido a la complejidad del polímero diseñado, fue necesario recurrir a una técnica de polimerización superficial muy versátil como es la deposición química iniciada en fase vapor (más conocida por su acrónimo en inglés iCVD). Los polímeros fueron ampliamente caracterizados y se corroboró que podían ser modificados con pequeñas biomoléculas como péptidos señalizadores. Las superficies resultantes son bioactivas y permiten la adhesión de células endoteliales.
Se obtuvieron otro tipo de superficies biomiméticas relevantes en el ámbito de la ingeniería de tejidos de hueso, a partir de una hidroxiapatita sintetizada por el método sol-gel sumergiéndolas en diferentes medios fisiológicos. La disolución y posterior reprecipitación de los iones proporcionan una capa de apatita con una composición similar a la que se encuentra in vivo. Los experimentos evidencian la importancia de partir de un material relativamente soluble. Precisamente debido a esto la hidroxiapatita pura no es capaz de inducir la precipitación de esta apatita biomimética in vitro. Varios investigadores han relacionado la capacidad de formar apatita con la bioactividad del material, entendiendo bioactividad como la habilidad de estos materiales de promover la unión con el hueso.
De todos modos, en ingeniería de tejidos, es necesario un ambiente tridimensional para generar un tejido artificial. Se ha desarrollado un nuevo modelo basado en el uso de un gel blando para obtener tejido duro como el del hueso. Aunque estos conceptos pueden parecer contradictorios, las células adquieren la habilidad de estirarse rápidamente y de formar una densa red celular dentro de este gel tan poco restrictivo desde un punto de vista mecánico. La consiguiente contracción del sistema acaba formando un constructo mucho más pequeño y resistente. Este es un sistema biomimético ya que promueve una gran interacción celular y también la condensación de las células, eventos que también ocurren durante el desarrollo de hueso y cartílago. El modelo se caracterizó extensamente con células osteoprogenitoras MC3T3-E1 que se diferenciaron bajo inducción química. Además, se demostró que el microambiente tridimensional podía promover la expresión espontánea de marcadores osteogénicos. Debido a las interesantes propiedades del sistema, el mismo modelo se usó para inducir la diferenciación condrogénica de fibroblastos dermales humanos. Este tipo celular no ha sido demasiado explorado en ingeniería de tejidos, a pesar de que puede tener un gran potencial en terapia regenerativa. Este trabajo proporciona pruebas de la capacidad condrogénica de estas células en el sistema tridimensional previamente desarrollado. / Biomimetics or biomimicry are terms that imply “learning from nature”, from its systems, processes and models, in order to use nature as inspiration to solve human problems. In tissue engineering, biomimetics is nowadays a recurrent term and a source of ideas to obtain more elegant and sophisticated platforms that could better mimic the interactions between cells and their environment. This thesis is focused on developing models both in two- and three-dimensions by recreation of one or more factors of the cell natural environment that are known to play an important role in cell behavior.
Since both the chemical and mechanical properties of the extracellular matrix are known to effectively influence cell function, an innovative polymeric thin film was designed combining a hydrogel with tunable mechanical properties and a reactive molecule, capable to immobilize biomolecules. Due to the complexity of the polymers, a versatile technique such as initiated chemical vapor deposition (iCVD) was required for the synthesis. Extensive characterization revealed that nanostructured hydrogels were obtained and that small biomolecules, such as signaling peptides, could be attached on the surface. The final surfaces are bioactive and support endothelial cell attachment.
Relevant biomimetic surfaces for bone tissue engineering could also be obtained from a sol-gel synthesized hydroxyapatite after immersion in different physiological media. The dissolution and posterior reprecipitation of the ions rendered a final apatite layer with a composition similar to that found in vivo. The experiments evidenced the importance of starting from a rather soluble material and, thus, pure hydroxyapatite was not able to promote apatite precipitation in vitro. This capacity has been related to the material bioactivity by many researchers in terms of its ability to bond to bone in tissue engineering applications.
However, for tissue engineering a three-dimensional environment is required to build tissue-like constructs. A new model was developed based on the use of a very soft gel to obtain hard tissue. Although the concepts might seem to work in opposite directions, cells gain the ability to rapidly elongate and form a dense cellular network within this unrestrictive environment. Subsequent contraction of the whole system rendered a smaller and stronger final tissue-like construct. This system was considered biomimetic as it promotes high cell-cell interaction and cellular condensation, which are events that occur in bone and cartilage development. This system was extensively characterized with osteoprogenitor MC3T3-E1 cells that could undergo full osteogenic differentiation under chemical induction. More interestingly, the three-dimensional microenvironment was also able to promote by itself spontaneous expression of bone-related markers. Due to the interesting properties of this system, the same model was used to induce chondrogenic differentiation of human dermal fibroblasts. This cell type has been poorly explored for tissue engineering applications, but it might have great potential in future therapeutic platforms. This work provides proof of concept of chondrogenic potential of these cells in this three-dimensional system.
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