Esta dissertação de mestrado apresenta um estudo da aplicação da biotecnologia na fabricação de resinas alquídicas, através do uso de catálise enzimática na transesterificação de diversos óleos (principalmente óleo de soja) com glicerol. O objetivo principal foi estudar a viabilidade técnica da substituição do processo de alcóolise alcalina atualmente utilizado em uma das etapas do processo de síntese/fabricação de resinas alquídicas por um processo enzimático com hidrolases tipo EC 3.1.1.3, mais comumente chamadas de lipases, alcançando menor consumo de energia e sustentabilidade ambiental no processo. Os melhores resultados foram obtidos com as enzimas dos organismos Pseudomonas sp e Candida antarctica. A temperatura de processo utilizada foi de 40ºC, em comparação aos 220ºC utilizados no processo alcalino. Alta conversão do óleo e alto teor de monoacilgliceróis foram alcançados. Em razão disso, a resina obtida apresentou menor tempo de processamento na etapa da policondensação, devido à maior funcionalidade na polimerização, levando a uma diminuição do consumo global de energia. Algumas propriedades da resina foram melhoradas, como dureza e resistência química do filme. A reutilização das enzimas sem perda de atividade foi demonstrada, o que viabiliza seu uso comercialmente, além de gerar menos resíduo. Um processo produtivo contínuo foi proposto e avaliado. A condição mais amena de reação garantiu um maior controle do produto gerado, devido a uma diminuição de reações paralelas, além de maior versatilidade da formulação, abrindo novas possibilidades no design destas resinas. Portanto, através da catálise enzimática, melhor desempenho e adequação aos padrões internacionais podem ser alcançados para as resinas alquídicas, agregando valor para esta classe de polímeros, favorecendo o uso de óleos vegetais e maximizando a utilização de recursos renováveis (eco eficiência). / This work presents a biotechnology application in the manufacturing of alkyd resin, through the use of enzymatic catalysis in the transesterification reaction of some oils (mainly soybean oil) with glycerol. The main objective was to study the technical feasibility to substitute the current alkaline process that has been used in a step of the resin synthesis by a enzymatic process with hydrolases class EC 3.1.1.3, most called lipases, achieving lower energy consumption and environmental process sustainability. The best results were obtained with the enzymes Pseudomonas sp and Candida antarctica. The process temperature was 40ºC, lower than the current temperature (220ºC). It was found higher oil conversion and higher monoacylglycerol amounts. For that reason, the resin synthesis showed lower polymerization time in the polycondensation step, leading to lower overall energy consumption. Some resin properties were improved, as hardness and chemical resistance. The reuse of the enzymes without high activity loss was demonstrated, which enable its use commercially, and generate less waste. A continuous process has been proposed and evaluated. The mild reaction conditions ensured greater control of the generated product due to a decrease in parallel reactions, thus it resulted in greater formulation versatility, opening new possibilities in the design of these resins. Therefore, by enzymatic catalysis, better performance and suitability to international standards can be achieve for alkyd resins, adding value to this class of polymers, favoring the use of vegetable oils and maximizing use of renewable resources (eco-efficiency).

Estudos vem mostrando resultados promissores na utilização da tecnologia de ultrassom para a produção enzimática de biodiesel. Estes são atribuídos ao fenômeno de cavitação gerado pelo equipamento de ultrassom, o qual promove um aumento da miscibilidade entre os reagentes, melhorando a transferência de massa e a taxa da reação, proporcionando reações mais rápidas, bem como um menor consumo de reagentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar as condições da reação de transesterificação do óleo de soja para a produção de biodiesel, utilizando o conceito de combi-lipase em um reator enzimático assistido por ultrassom. Foram otimizadas as condições do sistema de ultrassom: amplitude (30-70 %), pulso (30-70 %) e tempo de pulso (5-15 s), através de um delineamento composto central rotacional (DCCR). Os parâmetros reacionais: concentração de biocatalisador (5, 15 e 25 % em relação a massa de óleo) e razão molar do substrato (3:1, 6:1 e 9:1) foram estudados, assim como a influência do uso do solvente terc-butanol e de um sistema de agitação combinado ao ultrassom, na conversão de ésteres etílicos. Avaliou-se também a eficiência do combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM) frente ao uso dos biocatalisadores individualmente. Obteve-se como condições ótimas para o sistema de ultrassom: 30 % de amplitude, 50 % de pulso e 15 s de tempo de pulso, 15 % de enzima em relação a massa de óleo e uma razão molar de 3:1 etanol:óleo de soja Os rendimentos de conversão de ésteres etílicos na ausência do solvente terc-butanol foram similares aos resultados obtidos na presença deste reagente, sugerindo que a tecnologia de ultrassom é capaz de eliminar a necessidade do uso de solventes em reações de transesterificação enzimática. Entretanto, o uso combinado de um sistema de agitação com o ultrassom, reduziu o rendimento da reação. Em relação às enzimas, o combi-lipase mostrou melhores resultados para a síntese enzimática de ésteres etílicos, do que o uso das enzimas individualmente. Utilizando as condições ótimas avaliadas neste estudo e o conceito de combi-lipase em um reator assistido por ultrassom, obteve-se uma conversão de ésteres etílicos de aproximadamente 75 % em 5 horas de reação. / Studies have been showing promising results for the use of ultrasonic technology in enzymatic production of biodiesel, which are attributed to the cavitation phenomenon generated by the ultrasound equipment, that promotes increased miscibility between the reactants, improving mass transfer and reaction rate, providing faster reactions as well as a lower consumption of reagents. The aim of this work was to optimize ultrasonic (amplitude, pulse and time pulse) and reaction (molar ratio and enzyme concentration) parameters, as well as the influence of solvent (tert-butanol) and ultrasound combined with mechanical stirring, on the transesterification of soybean oil catalyzed by combi-lipase biocatalyst. It was also evaluated the efficiency of the combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM), compared to individual lipases. The optimum conditions for transesterification reaction, were observed being: enzyme concentration, 15 % (by oil mass); ethanol:oil molar ratio, 3:1; ultrasonic amplitude 30 %, pulse, 30 % and time pulse, 15 s. The yields of conversion of ethyl esters with and without solvent were very similar, indicating that ultrasonic technology is able to supply the need of solvents in enzymatic transesterification reactions. The combined use of a mechanical stirring system with ultrasound, reduced the yields of conversion of this reaction, while the combi-lipase showed better results than the use of individual lipases for soybean oil transesterification. Using the optimum conditions evaluated in this study and the concept of combi-lipase in an ultrasonic-assisted batch reactor, led to conversions of ethyl esters of about 75% in 5 hours.

Esta dissertação de mestrado apresenta um estudo da aplicação da biotecnologia na fabricação de resinas alquídicas, através do uso de catálise enzimática na transesterificação de diversos óleos (principalmente óleo de soja) com glicerol. O objetivo principal foi estudar a viabilidade técnica da substituição do processo de alcóolise alcalina atualmente utilizado em uma das etapas do processo de síntese/fabricação de resinas alquídicas por um processo enzimático com hidrolases tipo EC 3.1.1.3, mais comumente chamadas de lipases, alcançando menor consumo de energia e sustentabilidade ambiental no processo. Os melhores resultados foram obtidos com as enzimas dos organismos Pseudomonas sp e Candida antarctica. A temperatura de processo utilizada foi de 40ºC, em comparação aos 220ºC utilizados no processo alcalino. Alta conversão do óleo e alto teor de monoacilgliceróis foram alcançados. Em razão disso, a resina obtida apresentou menor tempo de processamento na etapa da policondensação, devido à maior funcionalidade na polimerização, levando a uma diminuição do consumo global de energia. Algumas propriedades da resina foram melhoradas, como dureza e resistência química do filme. A reutilização das enzimas sem perda de atividade foi demonstrada, o que viabiliza seu uso comercialmente, além de gerar menos resíduo. Um processo produtivo contínuo foi proposto e avaliado. A condição mais amena de reação garantiu um maior controle do produto gerado, devido a uma diminuição de reações paralelas, além de maior versatilidade da formulação, abrindo novas possibilidades no design destas resinas. Portanto, através da catálise enzimática, melhor desempenho e adequação aos padrões internacionais podem ser alcançados para as resinas alquídicas, agregando valor para esta classe de polímeros, favorecendo o uso de óleos vegetais e maximizando a utilização de recursos renováveis (eco eficiência). / This work presents a biotechnology application in the manufacturing of alkyd resin, through the use of enzymatic catalysis in the transesterification reaction of some oils (mainly soybean oil) with glycerol. The main objective was to study the technical feasibility to substitute the current alkaline process that has been used in a step of the resin synthesis by a enzymatic process with hydrolases class EC 3.1.1.3, most called lipases, achieving lower energy consumption and environmental process sustainability. The best results were obtained with the enzymes Pseudomonas sp and Candida antarctica. The process temperature was 40ºC, lower than the current temperature (220ºC). It was found higher oil conversion and higher monoacylglycerol amounts. For that reason, the resin synthesis showed lower polymerization time in the polycondensation step, leading to lower overall energy consumption. Some resin properties were improved, as hardness and chemical resistance. The reuse of the enzymes without high activity loss was demonstrated, which enable its use commercially, and generate less waste. A continuous process has been proposed and evaluated. The mild reaction conditions ensured greater control of the generated product due to a decrease in parallel reactions, thus it resulted in greater formulation versatility, opening new possibilities in the design of these resins. Therefore, by enzymatic catalysis, better performance and suitability to international standards can be achieve for alkyd resins, adding value to this class of polymers, favoring the use of vegetable oils and maximizing use of renewable resources (eco-efficiency).

Estudos vem mostrando resultados promissores na utilização da tecnologia de ultrassom para a produção enzimática de biodiesel. Estes são atribuídos ao fenômeno de cavitação gerado pelo equipamento de ultrassom, o qual promove um aumento da miscibilidade entre os reagentes, melhorando a transferência de massa e a taxa da reação, proporcionando reações mais rápidas, bem como um menor consumo de reagentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar as condições da reação de transesterificação do óleo de soja para a produção de biodiesel, utilizando o conceito de combi-lipase em um reator enzimático assistido por ultrassom. Foram otimizadas as condições do sistema de ultrassom: amplitude (30-70 %), pulso (30-70 %) e tempo de pulso (5-15 s), através de um delineamento composto central rotacional (DCCR). Os parâmetros reacionais: concentração de biocatalisador (5, 15 e 25 % em relação a massa de óleo) e razão molar do substrato (3:1, 6:1 e 9:1) foram estudados, assim como a influência do uso do solvente terc-butanol e de um sistema de agitação combinado ao ultrassom, na conversão de ésteres etílicos. Avaliou-se também a eficiência do combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM) frente ao uso dos biocatalisadores individualmente. Obteve-se como condições ótimas para o sistema de ultrassom: 30 % de amplitude, 50 % de pulso e 15 s de tempo de pulso, 15 % de enzima em relação a massa de óleo e uma razão molar de 3:1 etanol:óleo de soja Os rendimentos de conversão de ésteres etílicos na ausência do solvente terc-butanol foram similares aos resultados obtidos na presença deste reagente, sugerindo que a tecnologia de ultrassom é capaz de eliminar a necessidade do uso de solventes em reações de transesterificação enzimática. Entretanto, o uso combinado de um sistema de agitação com o ultrassom, reduziu o rendimento da reação. Em relação às enzimas, o combi-lipase mostrou melhores resultados para a síntese enzimática de ésteres etílicos, do que o uso das enzimas individualmente. Utilizando as condições ótimas avaliadas neste estudo e o conceito de combi-lipase em um reator assistido por ultrassom, obteve-se uma conversão de ésteres etílicos de aproximadamente 75 % em 5 horas de reação. / Studies have been showing promising results for the use of ultrasonic technology in enzymatic production of biodiesel, which are attributed to the cavitation phenomenon generated by the ultrasound equipment, that promotes increased miscibility between the reactants, improving mass transfer and reaction rate, providing faster reactions as well as a lower consumption of reagents. The aim of this work was to optimize ultrasonic (amplitude, pulse and time pulse) and reaction (molar ratio and enzyme concentration) parameters, as well as the influence of solvent (tert-butanol) and ultrasound combined with mechanical stirring, on the transesterification of soybean oil catalyzed by combi-lipase biocatalyst. It was also evaluated the efficiency of the combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM), compared to individual lipases. The optimum conditions for transesterification reaction, were observed being: enzyme concentration, 15 % (by oil mass); ethanol:oil molar ratio, 3:1; ultrasonic amplitude 30 %, pulse, 30 % and time pulse, 15 s. The yields of conversion of ethyl esters with and without solvent were very similar, indicating that ultrasonic technology is able to supply the need of solvents in enzymatic transesterification reactions. The combined use of a mechanical stirring system with ultrasound, reduced the yields of conversion of this reaction, while the combi-lipase showed better results than the use of individual lipases for soybean oil transesterification. Using the optimum conditions evaluated in this study and the concept of combi-lipase in an ultrasonic-assisted batch reactor, led to conversions of ethyl esters of about 75% in 5 hours.

Esta dissertação de mestrado apresenta um estudo da aplicação da biotecnologia na fabricação de resinas alquídicas, através do uso de catálise enzimática na transesterificação de diversos óleos (principalmente óleo de soja) com glicerol. O objetivo principal foi estudar a viabilidade técnica da substituição do processo de alcóolise alcalina atualmente utilizado em uma das etapas do processo de síntese/fabricação de resinas alquídicas por um processo enzimático com hidrolases tipo EC 3.1.1.3, mais comumente chamadas de lipases, alcançando menor consumo de energia e sustentabilidade ambiental no processo. Os melhores resultados foram obtidos com as enzimas dos organismos Pseudomonas sp e Candida antarctica. A temperatura de processo utilizada foi de 40ºC, em comparação aos 220ºC utilizados no processo alcalino. Alta conversão do óleo e alto teor de monoacilgliceróis foram alcançados. Em razão disso, a resina obtida apresentou menor tempo de processamento na etapa da policondensação, devido à maior funcionalidade na polimerização, levando a uma diminuição do consumo global de energia. Algumas propriedades da resina foram melhoradas, como dureza e resistência química do filme. A reutilização das enzimas sem perda de atividade foi demonstrada, o que viabiliza seu uso comercialmente, além de gerar menos resíduo. Um processo produtivo contínuo foi proposto e avaliado. A condição mais amena de reação garantiu um maior controle do produto gerado, devido a uma diminuição de reações paralelas, além de maior versatilidade da formulação, abrindo novas possibilidades no design destas resinas. Portanto, através da catálise enzimática, melhor desempenho e adequação aos padrões internacionais podem ser alcançados para as resinas alquídicas, agregando valor para esta classe de polímeros, favorecendo o uso de óleos vegetais e maximizando a utilização de recursos renováveis (eco eficiência). / This work presents a biotechnology application in the manufacturing of alkyd resin, through the use of enzymatic catalysis in the transesterification reaction of some oils (mainly soybean oil) with glycerol. The main objective was to study the technical feasibility to substitute the current alkaline process that has been used in a step of the resin synthesis by a enzymatic process with hydrolases class EC 3.1.1.3, most called lipases, achieving lower energy consumption and environmental process sustainability. The best results were obtained with the enzymes Pseudomonas sp and Candida antarctica. The process temperature was 40ºC, lower than the current temperature (220ºC). It was found higher oil conversion and higher monoacylglycerol amounts. For that reason, the resin synthesis showed lower polymerization time in the polycondensation step, leading to lower overall energy consumption. Some resin properties were improved, as hardness and chemical resistance. The reuse of the enzymes without high activity loss was demonstrated, which enable its use commercially, and generate less waste. A continuous process has been proposed and evaluated. The mild reaction conditions ensured greater control of the generated product due to a decrease in parallel reactions, thus it resulted in greater formulation versatility, opening new possibilities in the design of these resins. Therefore, by enzymatic catalysis, better performance and suitability to international standards can be achieve for alkyd resins, adding value to this class of polymers, favoring the use of vegetable oils and maximizing use of renewable resources (eco-efficiency).

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T23:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_DanielleBranta_M.pdf: 1927712 bytes, checksum: 4c84529dc29400d6dfb671ad68c0abc8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O aumento da demanda por esteres obtidos naturalmente ou por processos biotecnologicos, para aplicacoes como aditivos em alimentos, cosmeticos, industrias farmaceuticas e de lubrificantes, faz necessario o desenvolvimento de catalisadores altamente especificos. Por esta razao, o uso de enzimas como catalisadores para a sintese de esteres de alto valor agregado vem sofrendo um rapido desenvolvimento, por proporcionar a possibilidade de obtencao de um produto atraves de um processo biologico. Embora destinada pela natureza para realizar a hidrolise de lipideos, lipases (E.C. 3.1.1.3) podem, sob condicoes apropriadas de reacao, promover a formacao de esteres atraves de reacoes de acidos e álcoois (esterificacao). Comparadas com processos quimicos ja realizados em uma escala industrial, reacoes enzimaticas ocorrem sob condicoes brandas (e ecologicamente mais favoraveis) apesar de poderem ser mais lentas. A grande vantagem e a especificidade apresentada pelas enzimas, que permite a formacao de derivados lipidicos, os quais nao sao facilmente preparados por processos laboratoriais convencionais. Neste trabalho, foi avaliado o desempenho de lipases microbianas e vegetais, nao-comerciais, e comparadas a uma lipase comercial, na síntese de esteres com possiveis propriedades emulsificantes, bem como a influencia das condicoes de reacao (concentracao de enzima, quantidade de agua, relacao molar dos substratos, tipos de meios reacionais, e cinetica) no processo de esterificacao. A etapa seguinte do estudo foi constituida de um planejamento experimental fatorial completo com o proposito de otimizar a producao do ester oleato de oleila, em meio livre de solvente organico, com a lipase de Rhizopus sp. selecionada por apresentar melhor desempenho catalitico. O mesmo estudo foi realizado tambem com a lipase comercial Lipozyme TL IMR, com finalidade comparativa. Os parametros reacionais estudados foram: razao molar entre os substratos (acido:alcool) e concentracao de enzima (% m/m em relacao a massa de reagentes). Destes ensaios, verificou-se melhor habilidade catalitica da lipase de Rhizopus sp. utilizando maior proporcao de alcool (2:1) e maior quantidade de enzima (9,8%). O mesmo foi observado com a enzima comercial Lipozyme TL IMR, a qual tambem apresentou maior producao de ester quando se fez uso de uma maior proporcao de alcool (3:1) e maior quantidade de enzima (7,0%). A porcentagem de esterificacao obtida pela lipase de Rhizopus sp. (93,1%) foi muito proxima a porcentagem obtida pela lipase comercial Lipozyme TL IMR (94,2%), evidenciando o grande potencial desta enzima nao-comercial na sintese do oleato de oleila. Por fim, foi realizada a caracterizacao parcial do ester quanto as atividades emulsificante e antimicrobiana. Resultados indicaram que o ester produzido neste trabalho demonstrou atividade emulsificante, porem esta nao foi tao alta quando comparada aos emulsificantes comerciais: Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) e Tween 80. Observou-se tambem que o oleato de oleila nao foi capaz de inibir o crescimento microbiano de Bacillus subtilis, sendo assim, ate o presente momento, nao foi detectada atividade antimicrobiana para este ester / Abstract: The increasing demand for esters obtained either through natural or biotechnological processes for use as food additives, cosmetics, pharmaceuticals and lubricants requires the development of highly specific catalysts for ester production. For this reason, the use of enzymes as catalysts for the synthesis of esters with high added value is undergoing rapid development. Although the main function of lipases in nature is to catalyze the hydrolysis of lipids, it can also be made to promote ester formation through the reaction of acids and alcohols (esterification) under specific reaction conditions. Although on an industrial scale enzymatic reactions may be longer when under milder and ¿greener¿ conditions compared to chemical processes. The great advantage of working with enzymes is their great specificity, which often allows for the preparation of lipid derivatives not easily obtained using conventional laboratory procedures. This work first evaluated a few variables affecting the synthesis of esters and the esterification process, namely the influence of: the use of commercial and non-commercial lipases of vegetable and fungi origin, reaction conditions, enzyme concentration, amount of water, molar ratio of substrates, types of organic solvents and reaction kinetics. In a second step, a complete factorial design was considered in order to optimize ester production in solvent-free systems using Rhizopus sp. lipase and Lipozyme TL IMR which were chosen because of their good performance. The reaction parameters chosen were molar ratio of substrates (acid:alcohol) and enzyme concentration. Lipase from Rhizopus sp. displayed the best catalytic activity at a molar ratio of 1:2 (acid:alcohol) and an enzyme concentration of 9.8%, whereas Lipozyme TL IMR had the best catalytic activity at a molar ratio of 1:3 and enzyme concentration of 7.0%. The rate of the sterification reaction yielded 93.1% using lipase from Rhizopus sp., very close to what it is obtained using commercial Lipozyme TL IMR that is 94.2%. This result shows a high potential for this non-commercial enzyme to be used as a catalyst for the oleyl oleate synthesis. The characterization of the ester included evaluation of emulsifier and antimicrobial activities. Oleyl oleate synthesized in this study proved to have lower emulsifier activity compared to commercial emulsifiers like sodium dodecyl sulfate (SDS) and Tween 80. Also, oleyl oleate did not inhibit the growth of Bacillus subtilis, thus no antimicrobial activity was observed for this substance / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Ulf F. Schuchardt / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T20:28:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sales_HenriqueJorgeSousa_D.pdf: 2216336 bytes, checksum: 8961d924bfe31e720b51411a6194bd10 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Neste trabalho, estudamos a esterificação seletiva química e enzimática para a separação dos esteróis, ácidos resínicos e ácidos graxos do resíduo oleoso de madeira, o Crude Tall Oil (CTO). A reação de esterificação enzimática (Candida antartica, lípase do tipo B) foi otimizada utilizando-se um planejamento fatorial 2. Os fatores estudados foram o tempo de reação (h), a temperatura da reação (°C), o teor de catalisador (%), o teor de metanol (%) e o teor de água (%). Com o aumento da temperatura de 24 para 60 °C observamos uma redução média na taxa de conversão de 26,6 %. O aumento da percentagem de metanol de 5 para 15 % também apresentou um efeito negativo na taxa de conversão de 13,1 %; isso indica uma inativação térmica (com a aumento da temperatura) e uma inativação do sítio ativo da enzima pelo metanol. O aumento da porcentagem de água de 0 para 15 % e do tempo de reação de 6 para 24 h apresentou um aumento de 31,2 e de 8,1 %, respectivamente, para a conversão. A interação entre a água e o metanol apresentou um efeito positivo de 22,5 % sobre a conversão, sendo que a melhor condição foi a de efetuar a reação à baixa temperatura (24 °C) com altos teores de água (10-15%) e metanol (10-15%). A adição do metanol em duas etapas também favoreceu a reação, devido ao efeito de desativação que o metanol tem sobre a enzima. O processo foi implementado em produção, onde 13,7 tons de CTO foram esterificadas em um tanque de 25 m e, após 166 h de reação, o índice de acidez caiu de 153,5 para 57,4 mgKOH/g. Através das análises do teor de ácidos resínicos livres, constatamos a total esterificação dos ácidos graxos presentes no CTO. O catalisador enzimático foi adsorvido em polipropileno e foram produzidos dois catalisadores heterogêneos com 0,2 g/g e 0,5 g/g; a relação 0,2 g/g foi a que apresentou a melhor relação custo-benefício para as reações em batelada. O catalisador heterogêneo foi empacotado em uma coluna, e essa foi utilizada para os experimentos de esterificação contínua. O catalisador se mostrou estável por mais de 50 dias. Comparando a performance do processo enzimático x processo químico, o catalisador enzimático apresentou melhor produtividade e seletividade. O resíduo obtido pelo fracionamento em um evaporador thin film apresentou um alto teor de esteróis livres (1,83%) e esteróis esterificados (22,31%). A fração leve do CTO esterificado foi fracionada em uma coluna de destilação piloto. Com este novo processo, obtivemos ésteres metílicos com alto grau de pureza e isento de contaminação por ácidos resínicos. No processo de purificação por destilação, obtivemos ácidos resínicos com 72,3% de pureza. O processo de esterificação seletiva e de fracionamento do CTO foi patenteado pela Cognis do Brasil. / Abstract: A process for obtaining fatty acid alkyl esters, rosin acids an sterols from Crude Tall Oil was developed. As first process step, a chemical or enzymatic esterification has been proposed. It has been shown that the enzymatic esterification of crude tall oil is technically and economically feasible. A 2 experimental design, to optimize the enzymatic process, was done. The factors studied were; reaction time (h), temperature (°C), catalyst (%), methanol (%) and water (%). Increasing the temperature to 60 °C, the conversion decreased 26.6%. The use of high amount of methanol resulted on a conversion of 13.1%. The increase of reaction time and amount of water improved the conversion in 8.1 % and 31.2 %. The best conditions found were reaction time (24 h), temperature (25 °C), water (10-15 %) and methanol (10-15 %). Dosage of methanol must be used because with higher amount of alcohol occurs deactivation of the enzyme. The laboratorial scale experiments were successfully, transferred to a 25 m pumped reactor in the industrial plant. An acid value reduction from 153.5 to 57.4 in 166 hrs could be achieved. Using an immobilized biocatalyst, 0.2 g/g and 0.5 g/g, experiments in a stirred reactor have been performed. The best results were obtained with the 0.2 g/g catalyst system. The biocatalyst was used for successive batches. A continuous process in a column was successfully performed in laboratorial scale. The column was stable for more then 50 days in continuous operation. We compared the performance of enzymatic and chemical esterification. The enzymatic process has better productivity than the chemical process. The separation of the methyl esters and rosin acids from the sterol borates by thin film distillation produced a pitch with (1.83 %) of free sterols and (22.31 %) of total sterols. The separation of the methyl esters from the rosinic acids by distillation produced a high purity methyl ester free of resinic acids and a resinic acid with 72.3 % of purity. The process consists of five steps: 1- Enzymatic and chemical esterification of the tall oil fatty acids with methanol to convert the TOFA in methyl esters; 2- Stripping of water/methanol; 3- Esterification of the free sterols with boric acid. 4- Separation of the methyl esters and rosinic acids from the sterol borates by distillation and 5- Separation of the methyl esters from the rosinic acids by distillation. The process was patented by Cognis Brasil. / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

A dinâmica estrutural fundamentando a função das xilanases GH11 ainda não está clara. Novo conhecimento sobre a dinâmica catalítica dessas enzimas é crucial para a engenharia de novas enzimas melhoradas beneficiando, assim, diversas indústrias biotecnológicas e de química verde. Com base nesse fato, esse trabalho teve por objetivo obter novas informações acerca da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11, através do uso de um conjunto de diversas técnicas avançadas de biofísica molecular em nível bulk e em nível de molécula única (inglês single molecule ou sm). Para isso, foram projetadas xilanases GH11 de Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) com mutações únicas de cisteína para a marcação dos resíduos D119 e R122 no domínio polegar, do resíduo N54 no domínio dedos, e do resíduo N151 na alfa-hélice, seguidas pela sua construção e produção por métodos de biologia molecular. Esses mutantes foram marcados em seus respectivos grupos tióis com a sonda fluorescente sensível à polaridade Acrylodan, com a sonda de spin MTSSL, e com a sonda fluorescente fotoestável AttoOxa11. A xilanase tipo selvagem for marcada em seu N-terminal com a sonda fotoestável Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Foram utilizados ensaios de espectrofotometria de fluorescência em nível bulk e de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica para investigar como a dinâmica do domínio polegar da xilanase GH11, temperatura, e ligação ao substrato se correlacionam um com o outro. Os resultados atestaram que um estado do domínio polegar controlado por temperatura, aberto, dinâmico e flexível tem mais chances de se ligar efetivamente ao substrato de uma maneira produtiva, o que está em completo acordo com estudos anteriores de simulação de dinâmica molecular, cristalografia, desnaturação térmica, e análise funcional por desenho racional de mutantes de domínio polegar de xilanases GH11. Com base nas evidências adquiridas e em estudos anteriores, nós propomos um conjunto de hipóteses e modelos para a dinâmica catalítica da xilanase, focando no papel do domínio polegar nesse processo. No intuito de determinar a constante de afinidade da xilanase por seu substrato e os tempos de relaxamento e constantes de velocidade dos movimentos do domínio polegar, foram feitas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência simples e combinada com transferência eletrônica fotoinduzida, usando as xilanases marcadas com as sondas fluorescentes fotoestáveis, na presença e na ausência de substrato. Os resultados mostraram tempos de difusão muito maiores para as xilanases na presença de substrato, como efeito da afinidade da enzima pelo mesmo. Entretanto, não foi verificada nenhuma curva de decaimento como efeito de supressão dinâmica da sonda por PET. Esses mesmos conjugados foram aplicados com sucesso em microscopia por imagem de tempo de vida de fluorescência, no intuito de analisar sistematicamente a afinidade da xilanase por partículas insolúveis e filmes de substrato, e por fragmentos insolúveis de frações de processos de deslignificação e desestruturação de bagaço de cana-de-açúcar, assim como para a análise da composição, estrutura e topologia desses materiais. Foi possível verificar a presença de xilano na maioria das frações desse bagaço tratado, mas em quantidades variáveis / The structural dynamics underlying the function of GH11 xylanases is still unclear. New insights into the catalytic dynamics of these enzymes are crucial for engineering novel improved enzymes benefiting biotechnological and green chemistry industries. The objective of this work was to obtain new information concerning the catalytic dynamics of a GH11 xylanase, by using a combination of advanced molecular biophysics techniques, both at the bulk level and at the single molecule level (sm). Mutant GH11 xylanases from Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) were designed with single point cysteine mutations for labeling the residues D119 and R122 on the thumb domain, N54 on the fingers domain, and N151 on the alpha helix, followed by their construction and production by molecular biology methods. These mutants were labeled at their respective thiol groups by the polarity sensitive fluorescent probe Acrylodan, by the electron spin probe MTSSL, and by the photostable fluorescent probe AttoOxa11. The wild-type xylanase was labeled at its N-terminus by the photostable fluorescent probe Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Bulk fluorescence spectrophotometry and electron paramagnetic resonance assays were used to investigate how the thumb domain dynamics of the GH11 xylanase, temperature and substrate binding were correlated. These results demonstrated that a temperature controlled, open, dynamical and flexible thumb domain state is more likely to effectively bind the substrate in a productive way, which is in complete agreement with previous studies from molecular dynamics simulations, crystallography, thermal denaturation, and function analysis by the rational design of thumb mutants for GH11 xylanases. Based on this evidence and previous studies, we proposed a hypothesis for the xylanase catalytic dynamics, focusing on the role of the thumb domain. In order to determine the xylanase affinity constant for its substrate and the relaxation times and rate constants of the thumb domain movements, fluorescence correlation spectroscopy measurements were performed. Both simple and combined measurements with photoinduced electron transfer were performed, using the xylanases labeled with photostable fluorescent probes, in the presence and absence of substrate. The results have shown longer diffusion times for the xylanases in the presence of substrate, as an effect of the enzyme affinity for it. However, it was not verified any decay curve as an effect of the dynamic suppression of the probe via PET. The same conjugates were successfully applied to fluorescence-lifetime imaging microscopy, aiming to systematically analyze the affinity for xylanase of substrates in the form of insoluble particles and films, and for water insoluble fractions from sugarcane bagasse delignification processes. In addition, the composition, structure and topology of these materials was examined. It was possible to verify the presence of xylan in most fractions of this treated bagasse, although in variable quantities

Orientadores: Fernando José Von Zuben, Goran Neshich / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-27T03:11:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salim_JoseAugusto_M.pdf: 12514135 bytes, checksum: e429e34406344ef77064e5f5e46194be (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As enzimas têm sua função determinada essencialmente por alguns resíduos específicos, denominados resíduos de aminoácidos catalíticos. A função de uma determinada proteína é mantida por milhares de anos de pressão seletiva que ocasionam a preservação de uma estrutura composta por padrões físicos, químicos e estruturais necessários para mantê-la. É frequente observar que enzimas quaisquer presentes em organismos distantemente relacionados exerçam exatamente a mesma função biológica e possuam o mesmo conjunto de resíduos de aminoácidos catalíticos, apesar de possuírem sequências proteicas muito dissimilares. Estes padrões que se conservaram por anos de evolução para manter a função das enzimas têm sido bastante estudados na literatura. Assim, o presente trabalho buscou identificar, dentre os descritores estruturais de proteínas (disponíveis na base de dados da plataforma Blue Star STING) aqueles de maior relevância para discriminar os resíduos de aminoácidos catalíticos dos não catalíticos, por meio do nanoambiente no qual estes se inserem. Buscou-se por modelos classificadores capazes de favorecerem uma interpretação de suas escolhas através de regras na forma SE-ENTÃO, compostas por descritores e seus respectivos valores. Regras foram extraídas para conjuntos de enzimas responsáveis pela catálise da mesma reação enzimática (mesma sub-subclasse EC), de forma a caracterizar o nanoambiente comum aos seus resíduos de aminoácidos catalíticos. Primeiramente, foram considerados apenas descritores estruturais de proteínas, ou seja, excluem-se descritores de conservação de estrutura primária. Esta opção foi feita com base no fato de a conservação de um determinado resíduo em uma determinada posição ser uma consequência (e não causa) de sua crucial função para a atividade de uma enzima. Buscou-se, portanto, compreender a fundo o "por que" de um resíduo ser conservado, utilizando uma "linguagem" puramente estrutural. As doze mais representativas sub-subclasses EC foram escolhidas e regras foram extraídas de forma a caracterizar os resíduos de aminoácido catalíticos de seus membros. Os resultados obtidos variam de acordo com o número de amostras catalíticas disponíveis, sendo as classes com maior número de amostras as que resultaram em regras com maior capacidade de generalização. Ainda que a caracterização dos resíduos de aminoácidos catalíticos possa ser feita apenas com os dados disponíveis, a predição de novas amostras introduz diversos desafios discutidos neste trabalho. Diferentes técnicas de amostragem e seleção de atributos foram estudadas e o impacto de tais técnicas no treinamento é também discutido. Novos descritores estruturais de proteína foram adicionados ao Blue Star STING, assim como foi feito o desenvolvimento de uma biblioteca de programação para facilitar e agilizar a extensão do conjunto de descritores do Blue Star STING / Abstract: The function of enzymes are determined by specific residues, called catalytic amino acids residues. The protein function is maintained for thousands of years of selective pressure which preserves in its structure many physical-chemical and structural patterns. Frequently, enzymes from distinct organisms exert exactly the same biological function due to similar catalytic amino acid residues, even with low sequence similarities. The majority of catalytic amino acid residues prediction methods use sequence conservation features to provide classification. Seeking to understand these conserved patterns in enzyme structures, that even after years of evolution perform the same biological function, the present work searches to identify which protein structural descriptors (available in Blue Star STING platform) are capable of discriminating the amino acid catalytic residues from non-catalytic residues by means of their nanoenvironments properties. Therefore, we studied the use of classification methods available in the literature and STING structural protein descriptors to predict amino acid catalytic residues with no dependency of homologous enzymes. Considering methods capable of extracting IF-THEN rules composed of descriptors and their respective values, sets of rules were built to characterize the amino acid catalytic residues of enzymes catalyzing the same chemical reaction (same EC sub-subclass). Furthermore, it was considered only structural protein descriptors, i.e. no sequence conservation descriptor were considered. The conservation of certain amino acid in a given position is a consequence (not cause) of its crucial function for the enzyme activity. Therefore, the main purpose was to understand in depth the reason why a residue is preserved, employing a purely structural language. Twelve most representative EC sub-subclasses were considered and rules were extracted to characterize the amino acid catalytic residues of their members. The results vary as the number of available structures for each sub-subclass increases. Once it is possible to characterize the amino acid residues of a set of enzymes catalyzing the same chemical reaction, the prediction of amino acid residues in new enzymes faces several challenges discussed in this work, been the major problem the lack of data for amino acid catalytic residues in available databases. Many different techniques as sampling and feature selection methods are employed to alleviate the imbalance of data, and their impact on training are discussed. As a result, we also incorporate new structural protein descriptors to Blue Star STING and developed a new programming library to allow faster and easier extension of the Blue Star STING descriptors set / Mestrado / Engenharia de Computação / Mestre em Engenharia Elétrica

O processo de transesterificação de óleos vegetais para a síntese de biodiesel por catálise básica tem sido utilizado largamente em escala industrial e altas conversões são obtidas. Entretanto, uma grande quantidade de água é necessária para a purificação dos ésteres, gerando altos volumes de rejeitos aquosos inadequados para descarte, e dessa forma, a utilização de síntese enzimática catalisada por lipases imobilizadas destaca-se como uma alternativa ao método alcalino. Este trabalho teve como objetivo aperfeiçoar a produção de biodiesel a partir de diferentes fontes de óleos vegetais por diferentes lipases imobilizadas comercialmente. Na primeira fase do trabalho foi realizada uma análise dos principais fatores envolvidos na síntese enzimática de biodiesel, com foco nos parâmetros envolvidos na escolha e na configuração dos reatores. Uma extensa discussão foi apresentada sobre as vantagens e desvantagens de cada tipo de reator e seu modo de funcionamento. O cenário atual do mercado de síntese enzimática de biodiesel e algumas perspectivas futuras também foram apresentadas. Na segunda etapa desta pesquisa foi testado o conceito “combi-lipase”, que se baseia no uso de misturas de lipases com diferentes especificidades para a cadeia molecular de um óleo em particular (o substrato). Neste caso, foram utilizadas as lipases comerciais imobilizadas Novozym 435 (CALB), Lipozyme TL-IM (TLL), e Lipozyme RM-IM (RML) como biocatalisadoras na síntese de biodiesel via transesterificação enzimática dos óleos de oliva e palma, com etanol como aceptor acila. Repetidas reações em batelada foram realizadas para testar a estabilidade operacional do sistema combi-lipase, em que elas puderam ser usadas em pelo menos sete ciclos, mantendo em torno de 80 % da sua atividade inicial. Dando sequencia ao conceito de combi-lipase, na terceira etapa dessa pesquisa, foi avaliada a utilização de substratos alternativos, como os provenientes de fritura doméstica e comercial, comparada ao óleo de soja. As reações foram conduzidas em banho de ultrassom, com a otimização dos parâmetros razão molar etanol:óleo, quantidade de água adicionada na reação e quantidade de biocatalisador (previamente à definição da composição do combi-lipase). O uso de tecnologia de ultrassom, concomitante com a aplicação de misturas de enzimas com diferentes preços de aquisição e uso de óleos residuais apresentou excelentes rendimentos, com 90 % (com óleo de soja) e 70 % (com óleo residual) de conversão de biodiesel. Na última etapa deste trabalho, foi conduzida a síntese contínua de biodiesel em um reator de leito empacotado (PBR) com o uso de etanol e dos substratos óleos de soja e óleo residual, utilizando combi-lipase com biocatalisador. Após a otimização de alguns parâmetros de reação, foram definidas as seguintes condições: utilização de pérolas de vidro misturada ao combi-lipase para compor o leito enzimático; uso de terc-butanol como solvente de reação e velocidade de fluxo de 0,08 mL min-1. O combi-lipase apresentou excelente estabilidade operacional, e o reator manteve-se operando continuamente por 30 dias em estado estacionário. Independente do tipo de substrato empregado, o rendimento de conversão manteve-se em torno de 50 %, com produtividade de 1,94 gbiodiesel gsubstrato-1 h-1. / The process of transesterification of vegetable oils for biodiesel synthesis catalyzed by alkalis has been widely used on an industrial scale and high conversions are obtained. However, a large amount of water is required for the purification of esters, generating large amounts of aqueous wastes, unsuitable for disposal. Therefore, the enzymatic synthesis of biodiesel using immobilized lipases as biocatalysts stands as an alternative to the alkaline method. This work aimed at enhancing the production of biodiesel from different sources of vegetable oils using different immobilized commercially available lipases. In the first step of the work, an analysis of the main factors involved in enzymatic synthesis of biodiesel was carried out, focusing on choices of immobilization protocol and parameters involved in the selection and configuration of the reactors. An extensive discussion is presented on the advantages and disadvantages of each type of reactor and its operation. The current scenario of the enzymatic synthesis of biodiesel market and some future prospects are also presented. In the second stage of this study it was tested the concept "combi-lipase", which is based on the use of lipase mixtures with different specificities for a particular oil, the substrate. The immobilized commercial lipases Novozym 435 (CALB), Lipozyme TL-IM (TLL), and Lipozyme RM-IM (RML) were used as biocatalysts in enzymatic transesterification of biodiesel from olive and palm oils, with ethanol as acyl acceptor. Repeated batches of reaction were carried out in order to test the operational stability of the combi-lipase systems, with results showing that they could be used for at least seven cycles keeping higher than 80 % of their initial activities. Following the concept of combi-lipase, in the third stage of this research, it was evaluated the use of alternative substrates, such as waste frying oils, compared to soybean oil. The reactions were conducted in an ultrasonic bath, with the optimization of the molar ratio of ethanol: oil, amount of water added in the reaction and amount of biocatalyst (prior to the definition of the combi-lipase composition). The use of ultrasonic technology, concomitant with the application of mixtures of enzymes with different acquisition and use prices of residual oils presented excellent yields, with 90 % (with soybean oil) and 70 % (with residual oil) of biodiesel conversion. Finally, in the last stage of this work, the combi-lipase concept was applied in the continuous ethanolysis of biodiesel in a packed bed reactor (PBR) with the use of soybean and waste oils as substrates. After optimization of some reaction parameters, the following conditions were defined: use of glass beads mixed with lipases to compose the enzymatic bed; Use of tert-butanol as reaction solvents and flow rate of 0.08 mL min-1. The combi-lipase presented excellent operational stability, and the reactor was continuously operated for 30 days at steady state. Regardless of the type of substrate used, the conversion yield remained around 50 %, with productivity of 1.94 gbiodiesel gsubstrate-1 h-1.