Thesis--Göteborg. / Extra t.p. with thesis statement inserted. Includes bibliographical references (p. 27-34).

Thesis--Göteborg. / Extra t.p. with thesis statement inserted. Includes bibliographical references (p. 27-34).

Proefschrift Maastricht. / Lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La Cathepsine D (CathD) est une protéase lysosomale surexprimée et sécrétée par de nombreuses tumeurs solides. Cette enzyme favorise la prolifération tumorale et le processus métastatique, faisant d’elle une cible intéressante pour la thérapie anticancéreuse. Il existe un très bon inhibiteur de la CathD, la pepstatine, mais celui-ci traverse trop difficilement la membrane cellulaire pour être actif. C’est pourquoi des vecteurs de pénétration cellulaire, basés sur l’oligomérisation de mimes contraints de dipeptide, ont été développés au laboratoire. De ce travail, un bioconjugué, le JMV4463, a été développé. Composé d’un vecteur AMPA4 (tétramère de l’acide 2-(aminométhyl)phénylacétique), de la pepstatine, et d’une partie hydrophile aidant à la solubilisation du conjugué, ce bioconjugué est capable d’entrer dans les cellules et possède une activité antiproliférative sur différentes lignées de cellules cancéreuses. Partant de ce travail, la synthèse de nouveaux vecteurs potentiels de pénétration cellulaire, oligomères de mimes contraints de dipeptide, a été réalisée. Leur capacité d’internalisation a été établie sous la forme de conjugués avec la pepstatine. Les monomères envisagés étaient des analogues des motifs AMPA et acide (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acétique (DBT), motif ayant également montré une importante capacité d’internalisation. Ainsi, des analogues de l’AMPA en série indole, pyrrole et cyclohexane ont été préparés. De plus, la synthèse d’analogues de l’AMPA possédant différentes substitutions a été réalisée, tels que les méta- et para-AMPA, un homologue inférieur ou les 4,5-diméthoxy-, 4,5-dihydroxy- et 4-bromo-AMPA. Un analogue en série benzodiazépine du DBT a également été étudié. Tous les vecteurs correspondants sont capables d’internaliser la pepstatine dans les cellules mais, de façon surprenante, aucun des conjugués n’a montré d’activité anti-proliférative, indiquant un rôle essentiel du vecteur AMPA4. Une étude des relations structure / activité du JMV4463 a confirmé que le vecteur AMPA4 possédait un mode d’action unique mais celui-ci n’a pu être identifié à ce jour. Dans cette étude, il a également été montré qu’il était possible de simplifier la structure de la pepstatine, en remplaçant un de ses motifs statine par un motif gamma-alanine, permettant un coût de production réduit. Enfin, une étude in vivo sur un modèle xénogreffé de souris a montré un fort potentiel anti-tumoral du conjugué JMV4463. / Cathepsin D (CathD) is an overexpressed lysosomal protease secreted by several solid tumors. This enzyme is involved in tumor proliferation and metastasis, which makes it a promising target for cancer therapy. There exists a potent CathD inhibitor called Pepstatin, but it presents a too poor ability to cross the plasmic membrane in order to be active. To overcome this drawback, the development of cell penetrating vectors based on the oligomerization of constrained dipeptide mimetics has been undertaken in our lab. From this work, the bioconjugate JMV4463 has been developed. This bioconjugate is made of an AMPA4 (2-(aminomethyl)phenylacetic acid) vector, the pepstatin and a hydrophilic part which increases its solubility. This bioconjugate is able to penetrate the cells and has an antiproliferative effect on different cancer cell lines. Based on this work, synthesis of new potential cell penetrating vectors, oligomers of constrained dipeptide mimetics, was performed. Their internalization ability was established as their conjugate with pepstatin. We developed analogues of AMPA scaffold and (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acetic acid (DBT), which showed an important internalization ability. Thus, AMPA derivatives in indole, pyrrole and cyclohexane series were prepared. Furthermore, the synthesis of AMPA analogues having different substitutions on its aromatic part was performed, such as meta- and para- AMPA, an inferior homologue or 4,5-dimethoxy-, 4,5-dihydroxy- and 4-bromo-AMPA. An analogue of DBT in the benzodiazepin series has also been studied. All the corresponding vectors were able to internalize the pepstatin into the cells. Surprisingly, none of the conjugates showed an anti-proliferative activity, indicating the essential role of the AMPA vector. A structure/activity relationships study was performed for JMV4463. The obtained results confirmed that the AMPA vector has a unique mode of action that has not been identified yet. Furthermore, it has been demonstrated that it was possible to simplify the pepstatin structure by replacing one of its statin residues by a gamma alanine, which allows decreasing the production cost. Finally, an in vivo study on a xenografted mouse model showed a high anti-tumour potential for the JMV4463 conjugate.

Le cancer du sein triple-négatif est un sous-type représentant environ 15 % des cancers du sein, qui est caractérisé par l'absence de récepteurs hormonaux aux œstrogènes et à la progestérone et l'absence d'expression du facteur de croissance HER-2. Le cancer du sein triple-négatif est également associé à un profil clinique défavorable avec un haut risque de rechute métastatique précoce. Actuellement, de nombreuses molécules sont testées comme cible thérapeutique dans ce type de cancer. La cathepsine D, une aspartyl protéase lysosome, est un marqueur de mauvais pronostic du cancer du sein associé au risque métastatique. Cette protéase est surexprimée par les cellules cancéreuses mammaires et hypersécrétée dans le microenvironnement tumoral. Notre équipe a apporté des contributions importantes pour élucider le rôle de la cath-D dans le cancer du sein. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance et l'angiogenèse tumorales ainsi que la formation des métastases. Au niveau moléculaire, le proenzyme sécrété par la cellule tumorale stimule la croissance invasive du fibroblaste mammaire via le récepteur LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1). De plus, au pH extracellulaire acide des tumeurs, la pro-cathepsine D secrétée dégrade un des plus puissants inhibiteurs des cystéines cathepsines, la cystatine C, stimulant ainsi leurs activités protéolytiques.Mon travail a consisté à développer des anticorps anti-cath-D, présentant un effet thérapeutique dans le cancer du sein triple-négatif. Nous avons utilisé deux approches l'une par la technologie des hybridomes qui a permis d'isoler 50 anticorps, qui se sont avérés être des IgM. L'autre, par phage display, où 8 anticorps fragments scFv anti-cath-D ont été sélectionnés par ELISA. Ces 8 scFv ont été criblés pour leur capacité à bloquer l'activité biologique de la cathepsine D : inhibition de l'interaction avec LRP1 et inhibition du clivage d'un substrat fluorescent. Les anticorps E2 et F1 reformatés en IgG1 inhibent in vitro le phénomène de cicatrisation, la clonogénéicité, la croissance tridimensionnelle dans le matrigel et in vivo la croissance tumorale des cellules de cancer du sein triple-négatif MDA-MB-231. Cette étude est une première étape vers le développement de thérapie anti-cath-D dans le cancer du sein. / Cancer is the leading cause of death in the developed world. This project focuses t on the high incidence triple-negative breast cancers (ER- and PR-negative, HER2-non amplified) who present unsatisfactory treatments. Tumor progression is known to be due to cross-talk between cancer cells and their surrounding supporting tissue, the tumor stroma. The lysosomal aspartic protease cathepsin D is over-produced and abnormally hypersecreted by epithelial breast cancer cells. This protease is an independent marker of poor prognosis in breast cancer correlated with the incidence of clinical metastasis. Cathepsin D stimulates tumor progression by both proteolytic and non-proteolytic molecular mechanisms. Our team has shown that secreted pro-cathepsin D can alter the tumor microenvironment by interacting with partners such as the LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1) receptor, and/or by cleaving endogenous substrates like cystatin C. My pHD project aimed to target extracellular procathepsin D released in breast cancer by developing specific therapeutic antibodies to block its catalytic and binding capacities. We have isolated 50 hybridomas, that secreted IgM, a pentameric antibody format with high avidity but low affinity, and 8 anti-cath-D scFv by phage display. The anti-human cath-D scFv were selected by functional screenings for their ability to inhibit both the proteolytic activity of Cath-D and its binding to the fibroblastic LRP1 receptor. Two scFv cloned under IgG1 format (F1 and E2) inhibited wound healing, colony formation and three-dimensional outgrowth in Matrigel of MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells, and their tumor growth in athymic nude mice. Our findings strongly suggest that antibody-based targeting of Cath-D within the breast tumor microenvironment may have therapeutic efficacy for breast cancer treatment.

L’aspartyl protéase cathepsine D, surexprimée et hyper-sécrétée par les cellules épithéliales cancéreuses mammaires est un facteur de mauvais pronostic des cancers du sein et stimule la prolifération des cellules cancéreuses et la formation des métastases. Elle affecte également le micro-environnement tumoral en induisant la croissance invasive des fibroblastes. Les travaux de l’équipe ont montré que le LDL-receptor related protein 1, LRP1, est le récepteur fibroblastique de la cathepsine D. LRP1 est fortement exprimé par les adipocytes. Les études cliniques indiquent que l’obésité est un facteur de risque dans de nombreux cancers, dont le cancer du sein chez la femme ménopausée.Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la cathepsine D et du LRP1 dans les adipocytes, type cellulaire prédominant du micro-environnement tumoral mammaire. Nos résultats indiquent une surexpression de la cathepsine D et du LRP1 dans le tissu adipeux humain et murin obèse. De plus, l’expression de la cathepsine D est augmentée pendant la différenciation adipocytaire. Finalement, l’extinction de l’expression de la cathepsine D et du LRP1 inhibe l’adipogenèse indiquant leurs rôles clefs dans ce processus.L’ensemble de ces résultats suggère que la cathepsine D et son récepteur LRP1 pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de l’obésité. / The aspartyl protease cathepsin D, overexpressed and hyper-secreted by epithelial breast cancer cells is a poor prognosis factor in breast cancers and stimulates cancer cell growth and metastasis formation. It also affects the tumor microenvironment, inducing the fibroblasts invasive outgrowth. Our works have shown that the LDL receptor-related protein1, LRP1, is the fibroblastic receptor for cathepsin D. LRP1 is highly expressed in adipocytes. Clinical studies indicate that obesity is a risk factor in many cancers, including breast cancer in postmenopausal women.During this thesis, we studied the role of cathepsin D and LRP1 in adipocytes, which are the prominent cell type in the tumor microenvironment of breast cancers. Our results indicate that cathepsin D and LRP1 are overexpressed in human and mouse obese adipose tissue. Furthermore, the expression of cathepsin D is increased during adipocyte differentiation. Finally, the inhibition of the cathepsin D and LRP1 expression inhibits adipogenesis indicating their key role in this process.All these results suggest that cathepsin D and its receptor LRP1 could be potential therapeutic targets in the treatment of obesity.

Les bisphosphonates (BPs) sont des outils thérapeutiques de choix pour le traitement de l'ostéolyse maligne. Toutefois, ils n'ont pas d'effet anti-tumoral et n'améliorent pas la survie des patients. C'est pourquoi nous avons testé leur efficacité en association avec de nouveaux agents pharmacologiques ciblant les cellules responsables de la résorption osseuse, les ostéoclastes.<br />Nous avons ainsi démontré qu'un inhibiteur de cathepsine K (CKI) réduit l'activité des ostéoclastes in vitro, et de ce fait, le développement des métastases osseuses in vivo en agissant indirectement sur les cellules tumorales. De plus, un inhibiteur de tyrosine kinase (Imatinib) ralentit la formation et la progression des métastases osseuses in vivo, en ayant une activité anti-ostéoclastique et anti-tumorale. Toutefois, bien qu'une polythérapie puisse favoriser une synergie d'action entre les médicaments, nos résultats montrent que dans nos conditions d'utilisation, aucune synergie significative entre le CKI, l'Imatinib et le BP zolédronate n'a lieu.