Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-10-02Bitstream added on 2014-06-13T19:17:38Z : No. of bitstreams: 1 lima_pf_me_botfmvz.pdf: 431092 bytes, checksum: 3cea30aa873b1916f3293f49265588ad (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O desenvolvimento da competência oocitária ocorre de forma gradual durante a foliculogênese e é dependente da interação do oócito com as células do cumulus via fatores parácrinos. O KL é expresso pelas células do cumulus e estimula a maturação nuclear do oócito em roedores, mas suas funções no complexo cumulus-oócito (CCO) bovino não são conhecidas. Neste trabalho, avaliou-se o padrão de expressão do KL, os efeitos do KL sobre a progressão da meiose e a expansão do cumulus, bem como a regulação da expressão do KL por fatores secretados pelo oócito (FSOs; BMP15, FGF8, FGF10, FGF16 e FGF17) durante a maturação in vitro (MIV) de CCOs bovinos. Adicionalmente, os efeitos do KL sobre a expressão de BMP15, GDF9, FGF16 e c-KIT foi avaliada. As isoformas do KL (KL1 e KL2) apresentaram padrões de expressão semelhantes nas células do cumulus ao longo da MIV, com pico de expressão às 12 horas do cultivo. A adição de KL ao cultivo aumentou a porcentagem de oócitos em meiose II e diminuiu a de oócitos em meiose I ao final da MIV, mas não afetou a expansão do cumulus. O FGF8 aumentou a expressão dos RNAm do KL1 e do KL2, enquanto a BMP15 estimulou apenas a expressão do RNAm do KL1. Distintamente, a dose máxima do FGF10 diminuiu a expressão do KL2 às 22 horas do cultivo em estudo dose-resposta, embora o mesmo não tenha sido observado quando uma dose menor, porém efetiva em estimular a expansão do cumulus, foi testada ao longo da MIV (4, 12 e 22 horas). O tratamento com FGF10 e BMP15 associados aumentou a expressão do KL1 às 12 horas do cultivo em relação ao controle e aos fatores de crescimento sozinhos, sugerindo cooperação entre eles na regulação da expressão do KL. A adição de KL ao meio de cultivo não alterou a expressão dos FSOs. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem o... / The development of oocyte competence occurs gradually during folliculogenesis and is dependent on the interaction of the oocyte with cumulus cells via paracrine factors. The KL is expressed by cumulus cells and stimulates oocyte nuclear maturation in rodents, but its functions in cumulus-oocyte complex (COC) cattle are unknown. In this study, we evaluated the expression pattern of KL, the effects of KL on the progression of meiosis and cumulus expansion and regulation of KL expression by factors secreted by the oocyte (OSF; BMP15, FGF8, FGF10, FGF16 and FGF17) during in vitro maturation (IVM) of bovine COCs. Additionally, the effect of KL on the expression of BMP15, GDF9, FGF16 and c-KIT was evaluated. Isoforms of KL (KL1 and KL2) showed similar expression patterns in cumulus cells along the MIV, with higher expression at 12 hours of cultivation. The addition of KL increased the percentage of oocytes in meiosis II and decreased oocyte meiosis I in the end of IVM, but did not affect cumulus expansion. The FGF8 increased expression of KL1 and KL2 mRNA, while only BMP15 stimulated mRNA expression KL1. Distinctly, the maximum dose of FGF10 decreased expression of KL2 at 22 hours of cultivation in dose-response study, although the same was not observed when a lower dose, but effective to stimulate cumulus expansion was tested along MIV (4, 12 and 22 hours). Treatment with FGF10 and BMP15 associated with increased expression of KL1 at 12 hours of culture in relation to the control and growth factors alone, suggesting cooperation between them in the regulation of expression of the KL. The addition of KL to the culture medium did not alter the expression of the FSOs. Taken together, our results suggest the involvement of KL in controlling bovine oocyte nuclear maturation and expression of KL in bovine cumulus cells is... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Valquíria Hippólito Barnabé / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Marcelo George Mungai Chacur / Resumo: Este estudo foi dividido em dois experimentos. No exp. 1, investigou-se a influência do sêmen congelado heterospérmico e homospérmico de touros Nelore sobre o movimento de espermatozóides (ME), integridade da membrana plasmática (IMP) e produção de embriões in vitro (PIV). No exp. 2, a substituição de plasma seminal (PS) de touros com sêmen de média congelabilidade (grupo homospérmico, HoM) por PS heterólogo de touros de alta congelabilidade (grupo homospérmico, HoA), foram avaliados através do ME, IMP, PIV, proteína total (PT), concentração de testosterona plasmática (TP) e padrão eletroforético das proteínas do plasma seminal (PE). O plasma seminal heterólogo (grupo PSH) foi composto pela mistura de PS de touros HoA com espermatozóides de touros HoM. As amostras seminais de oito touros foram classificadas, com base em avaliações anteriores. Para o exp. 1, não foi observada diferença significativa para o ME, IMP e PIV entre os grupos, mas, foi observada entre os touros, independentemente do grupo. No exp. 2, não houve diferença, para o ME, PT, TP e embriões produzidos entre os grupos, entretanto, maior número de membranas plasmáticas intactas (P<0,05) foi encontrado no grupo HoA, bem como para a taxa de clivagem (P<0,05) no grupo PSH. Sete padrões de proteínas (20 a 25 frações) foram detectados no PS. A concentração de PT e TP variou pouco, quando comparada com o PE. Concluindo, o sêmen heterospérmico não melhorou nenhuma característica espermática nem aumentou a produção de embriões in vitro, no entanto, o PSH somente mostrou efeito benéfico sobre a taxa de clivagem. Agradecimentos: Central VR e frigorífico Frig, Araçatuba, SP, Brasil / Abstract: This study was divided into two experiments. In exp.1, the influence of frozen heterospermic and homospermic bull semen on sperm motion (SM), plasma membrane integrity (PMI) and in vitro embryo production (IVP) were investigated. In exp.2, the replacement of seminal plasma (SP) of bulls with medium semen freezability (homospermic group, MH) by heterologous SP of bulls with high freezability (homospermic group, HH), as evaluated for SM, PMI, IVP, total protein (TP), plasma testosterone level (PT), and electrophoretic profile of plasma seminal protein (EP). The heterologous seminal plasma (HSP) group consisted of a mixture of SP of bull HH with spermatozoa of bull MH. Sperm samples from 8 Nellore bulls were classified based on previous evaluations. In exp. 1, no significant difference was observed for SM, PMI, and IVP among groups, but it was observed among bulls, regardless of group. In exp.2, there was no difference for SM, TP, PT, and yielded embryos among groups, but more intact plasma membranes (P<0.05) were found in group HH as well as for cleavage rate (P<0.05) in group HSP. Seven protein profiles (20 to 25 protein fractions) were detected in SP. Level of TP and PT varied little when compared to the seminal protein profile. In conclusion, heterospermic semen did not improve any sperm characteristic nor enhanced in vitro embryo production, however, HSP only showed beneficial effect on cleavage rate. Acknowledgement: VR Insemination Station and FRIG slaughterhouse, Araçatuba, SP, Brazil / Doutor

Orientador: José Buratini Junior / Banca: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Banca: Marcelo Nogueira / Banca: Cláudia Lima Verde Leal / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: Fatores de crescimento fibroblástico (FGFs) regulam o desenvolvimento folicular e a maturação oocitária através de ligação aos seus receptores (FGFRs). Os RNAm que codificam o FGFR2c e o FGFR3c foram detectados em folículos antrais bovinos. Com o objetivo de identificar FGFs que poderiam regular a foliculogênese por meios desses, investigou-se os padrões de expressão do FGF16 e FGF20 em folículos antrais bovinos, bem como os níveis de RNAm desses FGFs e seus receptores (FGFR2c e FGFR3c) durante a maturação in vitro de complexos cumulus-oócito (COCs). Além disso, dados preliminares do nosso laboratório indicativos de que a expressão do FGF17 em oócitos é regulada ao longo da maturação oocitária motivaram a investigação da função dessa proteína na maturação de COCs in vitro. Sendo assim, avaliou-se o efeito do FGF17 na expansão do cumulus e no controle da transcrição de fatores EGF-like [ampiregulina (AREG), epiregulina (EREG) e betacelulina (BTC)] e outros genes reguladores da expansão [cicloxigenase 2 (COX2), hialurona sintase 2 (HAS 2), pentraxina 3 (PTX3), proteína indutora do fator de necrose tumoral 6 (TSG6)]. Os RNAm dos FGF16 e FGF20 e as respectivas proteínas foram detectados no ovário bovino. A abundância de RNAm de FGF16 e FGF20 foi maior em células da granulosa e da teca de folículos atrésicos comparados a folículos saudáveis ou transicionais. O tratamento com FSH diminuiu a abundância de RNAm para FGF16 e FGF20 e o IGF1 inibiu FGF16 em células da granulosa cultivadas in vitro. Ao longo da maturação a expressão do FGF16 e do FGF20 foi estável no oócito, enquanto que a expressão dos receptores FGFR2c e FGFR3c foi estimulada nas células do cumulus pelo FSH. A proteína FGF16 foi localizada no oócito, células do cumulus e da teca e o FGF20 em oócitos, células do cumulus, da granulosa e da teca. O FGF17 aumentou a proporção... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fibroblast growth factors (FGFs) regulate follicular development and oocyte maturation. Messenger RNA encoding receptors FGFR3c and FGFR2c have been detected in bovine antral follicles. Aiming to identify FGFs that can potentially regulate folliculogenesis through these receptors, the expression patterns of FGF16 and FGF20 were assessed in bovine antral follicles. Messenger RNA expression of these FGFs and their receptors (FGFR2c and FGFR3c) was also assessed in oocytes and cumulus cells, respectively, during in vitro maturation. In addition, previous data suggesting that FGF17 mRNA expression is regulated in the oocyte led us to investigate the effects of FGF17 on cumulus expansion and on the expression of EGF-like factors [amphiregulin (AREG), epiregulin (EREG) and betacelullin (BTC)] and other genes that regulate expansion [cyclooxygenase 2 (COX2), hyaluronan synthase 2 (HAS 2), pentraxin 3 (PTX3), protein-inducing tumor necrosis factor 6 (TSG6)]. FGF16 and FGF20 mRNA and proteins were detected in the bovine ovary. Messenger RNA abundance of FGF16 and FGF20 was higher in granulosa and theca cells from atretic follicles compared with healthy or transitional follicles. Treatment with FSH decreased mRNA expression of FGF16 and FGF20 and IGF1 inhibited FGF16 mRNA abundance in cultured granulosa cells. During maturation, mRNA expression of FGF16 and FGF20 was stable in the oocyte, while FGFR2c and FGFR3c were stimulated in cumulus cells by FSH. FGF16 protein was localized to the oocyte, cumulus and theca cells, and FGF20 was detected in the oocyte, cumulus, granulosa and theca cells. Supplementation of maturation medium with FGF17 increased the proportion of fully expanded COCs, but did not alter mRNA expression of COX2, HAS2, PTX3, TSG6, AREG, EREG and BTC in cumulus cells during in vitro maturation. In conclusion, FGF17 enhances bovine cumulus expansion... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: José Buratini Júnior / Banca: Ciro Morais Barros / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: O desenvolvimento da competência oocitária ocorre de forma gradual durante a foliculogênese e é dependente da interação do oócito com as células do cumulus via fatores parácrinos. O KL é expresso pelas células do cumulus e estimula a maturação nuclear do oócito em roedores, mas suas funções no complexo cumulus-oócito (CCO) bovino não são conhecidas. Neste trabalho, avaliou-se o padrão de expressão do KL, os efeitos do KL sobre a progressão da meiose e a expansão do cumulus, bem como a regulação da expressão do KL por fatores secretados pelo oócito (FSOs; BMP15, FGF8, FGF10, FGF16 e FGF17) durante a maturação in vitro (MIV) de CCOs bovinos. Adicionalmente, os efeitos do KL sobre a expressão de BMP15, GDF9, FGF16 e c-KIT foi avaliada. As isoformas do KL (KL1 e KL2) apresentaram padrões de expressão semelhantes nas células do cumulus ao longo da MIV, com pico de expressão às 12 horas do cultivo. A adição de KL ao cultivo aumentou a porcentagem de oócitos em meiose II e diminuiu a de oócitos em meiose I ao final da MIV, mas não afetou a expansão do cumulus. O FGF8 aumentou a expressão dos RNAm do KL1 e do KL2, enquanto a BMP15 estimulou apenas a expressão do RNAm do KL1. Distintamente, a dose máxima do FGF10 diminuiu a expressão do KL2 às 22 horas do cultivo em estudo dose-resposta, embora o mesmo não tenha sido observado quando uma dose menor, porém efetiva em estimular a expansão do cumulus, foi testada ao longo da MIV (4, 12 e 22 horas). O tratamento com FGF10 e BMP15 associados aumentou a expressão do KL1 às 12 horas do cultivo em relação ao controle e aos fatores de crescimento sozinhos, sugerindo cooperação entre eles na regulação da expressão do KL. A adição de KL ao meio de cultivo não alterou a expressão dos FSOs. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The development of oocyte competence occurs gradually during folliculogenesis and is dependent on the interaction of the oocyte with cumulus cells via paracrine factors. The KL is expressed by cumulus cells and stimulates oocyte nuclear maturation in rodents, but its functions in cumulus-oocyte complex (COC) cattle are unknown. In this study, we evaluated the expression pattern of KL, the effects of KL on the progression of meiosis and cumulus expansion and regulation of KL expression by factors secreted by the oocyte (OSF; BMP15, FGF8, FGF10, FGF16 and FGF17) during in vitro maturation (IVM) of bovine COCs. Additionally, the effect of KL on the expression of BMP15, GDF9, FGF16 and c-KIT was evaluated. Isoforms of KL (KL1 and KL2) showed similar expression patterns in cumulus cells along the MIV, with higher expression at 12 hours of cultivation. The addition of KL increased the percentage of oocytes in meiosis II and decreased oocyte meiosis I in the end of IVM, but did not affect cumulus expansion. The FGF8 increased expression of KL1 and KL2 mRNA, while only BMP15 stimulated mRNA expression KL1. Distinctly, the maximum dose of FGF10 decreased expression of KL2 at 22 hours of cultivation in dose-response study, although the same was not observed when a lower dose, but effective to stimulate cumulus expansion was tested along MIV (4, 12 and 22 hours). Treatment with FGF10 and BMP15 associated with increased expression of KL1 at 12 hours of culture in relation to the control and growth factors alone, suggesting cooperation between them in the regulation of expression of the KL. The addition of KL to the culture medium did not alter the expression of the FSOs. Taken together, our results suggest the involvement of KL in controlling bovine oocyte nuclear maturation and expression of KL in bovine cumulus cells is... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca:Carlos Antônio de Carvalho Fernandes / Banca: Luís Sérgio de Almeida Camargo / Banca: Luis Souza Lima Souza Reis / Resumo: Este estudo foi dividido em três experimentos. No experimento 1, objetivou-se avaliar e comparar o efeito da administração de análogo sintético de prostaglandina em diferentes períodos do puerpério de bubalinos. 45 búfalas pluríparas foram distribuídas aleatoriamente em três grupos: CON (controle) - soro fisiológico na primeira e terceira semanas pós-parto; CLO1 - cloprostenol sódico na primeira semana e; CLO3 - cloprostenol sódico na terceira semana. Os animais foram avaliados nos dias 7, 14, 21, 28 e 35 após o parto quanto ao grau de involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino, concentração de progesterona plasmática, período de serviços e intervalo entre partos. Não houve diferença entre os grupos quanto ao grau de involução uterina e concentração de progesterona plasmática. Os animais dos grupos CLO1 e CLO3 apresentaram menor acúmulo de fluido intrauterino, período de serviços e intervalo entre partos em relação ao grupo controle. O protocolo com aplicação de cloprostenol na primeira semana apresentou os melhores resultados sobre a eficiência reprodutiva de búfalas pós-parto. No experimento 2, o objetivo do estudo foi verificar se a aplicação de cloprostenol, no puerpério precoce ou intermediário, induz mudanças nas concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol de búfalas pós-parto, além de efeitos sobre a involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino e retorno da atividade ovariana cíclica. 30 búfalas Murrah foram distribuídas aleatoriamente em três grupos: CONT (solução salina); CLO2 (cloprostenol nos dias 2 e 5 pós-parto) e; CLO15 (cloprostenol nos dias 15 e 20 pós-parto). Exames ginecológicos foram realizados nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós-parto, onde foram avaliados o grau de involução uterina, o acúmulo de fluido intrauterino e a atividade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study was divided into three experiments. In experiment 1, the aim was to evaluate and compare the effect of prostaglandin synthetic analogue administration at different periods of buffalo puerperium. 50 pluriparous buffaloes were randomly divided into three groups: CON (control) - saline at first and third weeks postpartum; CLO1 - chloprostenol at first week and; CLO3 - chloprostenol at third week. Animals were evaluated at days 7, 14, 21, 28 and 35 after parturition about uterine involution degree, uterine fluid accumulation, progesterone plasmatic level, service period and parturition interval. There was no difference between groups on uterine involution degree and progesterone plasmatic level. Groups CLO1 and CLO3 animals presented lower uterine fluid accumulation, service period and parturition interval in relation to control group. The protocol of chloprostenol administration in the first week presented best results on postpartum buffalo reproductive efficiency. In experiment 2, the objective of the study was to verify if chloprostenol administration, at early or intermediary puerperium, can induces changes on progesterone, PGFM and oestradiol plasma concentrations of postpartum buffaloes, beyond effects on uterine involution, intrauterine fluid accumulation and ovarian activity return. 30 Murrah buffaloes were randomly divided into three groups: CONT (saline); CLO2 (chloprostenol at days 2 and 5 postpartum) and; CLO15 (chloprostenol at days 15 and 20 postpartum). Gynecological examinations were performed at days 2, 7, 14, 21 and 28 postpartum, when were evaluated uterine involution degree, intrauterine fluid accumulation and ovarian activity. After exams, were collected blood samples to dosage of progesterone, PGFM and oestradiol plasma concentrations. Group CLO2 showed more uterine involution, faster ovarian activity return and.. (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ciro Moraes Barros / Banca: José Buratini Junior / Banca: Gisele Zocardi Mingotti / Resumo: O fator de crescimento fibroblástico (FGF10) atua de forma parácrina no complexo cumulus-oócito, aumentando a expressão de genes relacionados à expansão das células do cumulus e à competência oócitária. Objetivou-se com o presente estudo testar se a adição do FGF10 ao meio de maturação melhora a maturação, diminui as taxas de oócitos apoptóticos e influencia na produção de embriões in vitro e na expressão de genes relacionados à competência e implantação embrionárias (COX2, CDX2 e PLAC8). Em todos os experimentos, oócitos foram obtidos de abatedouro, coletados de vacas adultas e maturados por 22 h em meio TCM 199 suplementado com: 2.5 ng/mL FGF10, 10 ng/mL FGF10, 50 ng/mL FGF10 ou na ausência de FGF10 (grupo controle). No Experimento 1, depois da maturação, os oócitos foram fixados e corados com TUNEL para determinar a porcentagem de oócitos apoptóticos e posteriormente com Hoechst-33342 para avaliação dos diferentes estágios da meiose (metáfase 1, metáfase 2 ou metáfase 2 com extrusão do primeiro corpúsculo polar). No Experimento 2, os oócitos foram fertilizados e cultivados até o estágio de blastocisto inicial. No experimento 3 avaliou-se o efeito da suplementação do FGF10 ao meio de maturação in vitro sobre a expressão dos genes COX2, CDX2 e PLAC8 em embriões bovinos. No experimento 1, os resultados demonstraram que a dose de 2,5 ng/mL FGF10 aumentou a porcentagem de oócitos com extrusão do primeiro corpúsculo polar (36%) quando comparado as doses de 10 ng/mL FGF10 (13%), 50 ng/mL FGF10 (12%) e grupo controle (19%; p≤0.05). Com relação ao número de oócitos apoptóticos, as maiores doses de FGF10 apresentaram menor quantidade de oócitos TUNEL-positivos (10 ng/mL and 50 ng/mL FGF10, 5% e 6%, respectivamente) quando comparados a menor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

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