Les kinases dépendantes des Cyclines (Cdk) contrôlent le déroulement du cycle cellulaire, mais leur étude est difficile car des mécanismes de compensation se développent lorsqu'une Cdk est absente. Cdk2 est principalement impliquée dans la phase de réplication de l'ADN, cependant l'ablation génétique de Cdk2 chez la souris n'a pas d'effet sur leur développement: les fonctions de Cdk2 sont compensées par d'autres Cdk. L'inhibition chimique permet de bloquer une Cdk et de limiter les compensations. Pour étudier les rôles de Cdk2, nous l'avons inhibé avec NU6102 qui sélectif pour Cdk2 dans le modèle xénope. Nous avons aussi développé des mutants de Cdk2 résistants à NU6102 pour vérifier sa sélectivité et avons cherché à mieux comprendre les paramètres qui déterminent l'affinité entre Cdk2 et un ligand. D'autre part, nous déterminons in vitro que NU6102 serait plus sélectif pour Cdk2 que pour les autres Cdk chez l'humain, et avons décrit les phénotypes induits par cet inhibiteur dans les cellules humaines en cultures. Ces résultats ne permettent pas de confirmer la sélectivité de NU6102 mais montrent que NU6102 a des caractéristiques intéressantes pour être utilisé dans le traitement contre le cancer. L'activité des Cdk est essentielle à l'initiation de la réplication de l'ADN, mais aucun substrat essentiel n'a été identifié chez les métazoaires. Nous avons réalisé un crible des protéines chargées sur la chromatine en présence et en absence d'activité Cdk dans le modèle xénope, afin d'identifier des substrats qui pourraient être impliqués dans la réplication. Ces résultats suggèrent que l'activité Cdk, qui initie la réplication au niveau des origines de réplication de l'ADN, pourrait être impliquée dans d'autres fonctions cellulaires. / Cycline Dependant Kinases (Cdk) control cell cycle progression. The study of their roles is often difficult because of functional redundancy; when a given Cdk is absent, others may compensate. The main role of Cdk2 in the cell cycle is in the initiation of DNA replication, but absence of Cdk2 is compensated for by Cdk1. For example, mice with a genetic knockout of Cdk2 are viable. The chemical inhibition of Cdks may limit compensation by other Cdks. Therefore, to study Cdk2 roles, we have studied chemical inhibition by NU6102, which seems to be selective for Cdk2 in the Xenopus model. To verify the selectivity and study parameters that determine selectivity, we have designed and produced mutants of Cdk2 which are resistant to NU6102, allowing restoration of function in the presence of inhibitor. Moreover, we demonstrate in vitro that NU6102 is selective for Cdk2 compared to other human Cdks, and we describe phenotypes induced by NU6102 in cultured cells, which are interesting in the light of potential applications of NU6102 in cancer chemotherapy. Cdk activity is essential for initiation of DNA replication, but in metazoans no essential substrates are known. To identify potential Cdk substrates during DNA replication, we have performed a proteomics screen of the proteins loaded onto chromatin in the presence or absence of Cdk activity, in the Xenopus model. The results suggest that Cdk activity is not only required for assembling DNA replication complexes onto origins of replication, but may also be implicated in other cellular functions.

Le complexe cohésine est un complexe protéique en forme d'anneau composé de quatre sous-unités essentielles très conservées: Smc1, Smc3, Rad21 et Scc3. Par sa capacité à encercler les molécules d’ADN, les cohésines participent à de nombreux processus cellulaires tels que la ségrégation des chromosomes, la signalisation et la réparation des dommages à l’ADN, la régulation de la transcription et l'organisation du génome. Pour assurer ces différentes fonctions biologiques les cohésines doivent être finement régulées à la fois dans le temps et l’espace. Ces régulations reposent en partie sur le contrôle de leur association à la chromatine (capture de l’ADN). Cela nécessite l'action d'un «facteur de chargement » composé de deux protéines conservées et essentielles, Mis4 et Ssl3 chez la levure S. pombe. Comment ce complexe régule la capture de l’ADN par l’anneau de cohésine dans l'espace et le temps demeure à ce jour très mal compris. Afin d’identifier des régulateurs de l’association des cohésines à la chromatine, nous avons réalisé un crible génétique visant à rechercher des suppresseurs de la mutation thermosensible mis4-367. Ce crible a conduit à l’identification de la Cyclin-Dependent Kinase Pef1 qui agit comme un régulateur négatif de la cohésion des chromatides soeurs en contrôlant vraisemblablement négativement l’association des cohésines à la chromatine. De forts arguments expérimentaux indiquent que Pef1 exerce sa fonction en régulant directement la phosphorylation de la sous-unité Rad21 du complexe cohésine. De façon intéressante, via un autre crible génétique, nous avons identifié la phosphatase Pph3/Psy2 qui joue un rôle dans l’établissement de la cohésion des chromatides soeurs en contrôlant la déphosphorylation de Rad21.Ensemble, ces données suggèrent que le contrôle de l’état de phosphorylation de la sous-unité Rad21 du complexe cohésine joue un rôle central dans le processus de cohésion chez la levure S. Pombe. / Cohesin is a highly conserved ring-shaped protein complex made of four essential subunits: Psm1, Psm3, Rad21 and Psc3. By its ability to capture DNA molecules within its ring-like structure, cohesion plays a key role in many cellular processes such as chromosome segregation, DNA damage signalling and repair, transcriptional gene regulation and nuclear organization. To ensure all of its biological functions, cohesin must be tightly regulated in space and time. This regulation relies in part on the control of cohesin binding to chromatin (DNA capture). Cohesin recruitment to chromatin requires the action of a “loading complex” made of two conserved and essential proteins named Mis4 and Ssl3 in the fission yeast. How this complex regulates where and when DNA capture by the cohesin ring must occur remains poorly understood. To identify regulators of cohesin binding to chromatin we have performed a genetic screen for suppressors of the thermosensitive mutation mis4-367. This genetic screen has led to the identification of the cyclin-dependent-kinase Pef1 that acts as a negative regulator of sister chromatids cohesion may be bynegatively controlling cohesin binding to chromatin. Strong experimental evidences indicate that Pef1 exerts its function at least in part by directly phosphorylating the Rad21 subunit of the cohesin complex. Interestingly, a genetic screen made in parallel identified the Pph3/Psy2 phosphatase as implicated in the establishment of sister chromatid cohesion by regulating Rad21 dephosphorylation. Strikingly, the control of Rad21 phosphorylation status appears central to the cohesion process in the fission yeast S. pombe.

Diss.--Åbo Akademi University, 2003. / Contient cinq articles publiés par l'auteur dans des revues scientifiques. Bibliogr. en fin de chap.

The cell cycle of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is regulated by a complex network of chemical reactions controlling the activity of the cyclin-dependent kinases (CDKs), a family of protein kinases that drive the major events of the cell cycle. A previous mathematical model by Chen et al. (2000) described a molecular mechanism for the Start transition (passage from G1 phase to S/M phase) in budding yeast. In this thesis, my main goal is to extend Chen's model to include new information about the mechanism controlling Finish (passage from S/M phase to G1 phase). Using laws of biochemical kinetics, I transcribed the hypothetical molecular mechanism into a set of differential equations. Simulations of the wild-type cell cycle and the phenotypes of more than 60 mutants provide a thorough understanding of how budding yeast cells exit mitosis. / Master of Science

La progression à travers le cycle cellulaire est assurée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline-CDK. Les complexes cycline D-CDK4 assurent la progression au cours de la phase G1 du cycle cellulaire en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille Rb. L’activation de la CDK4 nécessite son association à une cycline D et sa phosphorylation sur Thr172 par la CAK nucléaire (CDK activating kinase). Le rôle essentiel des protéines de la famille Cip/Kip dans la régulation de l’activité de ces complexes reste controversé. Les protéines de cette famille (comprenant p27 et p21) ont initialement été identifiées comme des inhibiteurs puissants des complexes cycline-CDK et comme les intermédiaires de l’action antimitogénique de différents signaux intra ou extra-cellulaires. Il a été proposé que la liaison de la p27 ou de la p21 aux complexes cycline D-CDK4 empêche leur phosphorylation activatrice par la CAK et leur activité pRb kinase. Cependant, l’observation que des complexes cycline D-CDK4 associés à p21/p27 possèdent une activité pRb kinase a donné naissance à une seconde hypothèse sur la régulation de ces complexes par la p27 ou la p21. Ces « inhibiteurs » ont été paradoxalement proposés comme facteurs nécessaires et suffisants d’assemblage et de localisation nucléaire des complexes cycline D-CDK4. Dans le modèle physiologiquement relevant des thyrocytes de chien en culture primaire, la mitogénèse dépendante de l’AMPc activée par la TSH diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu’elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’«inhibiteur» de CDK p27. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4, leur translocation nucléaire et leur association à p27. Dans ce modèle, le TGF inhibe la mitogénèse dépendante de l’AMPc en inhibant la translocation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4 et leur association à la p27. Nous avons étudié l’activité catalytique et l’activation des complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien en culture primaire ou produits en cellules d’eucaryotes supérieurs (CHO et Sf9). Nous avons pu montrer que les complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien stimulés par la TSH présentent une activité pRb-kinase qui est inhibée par le TGF. En outre, la production des complexes cycline D3-CDK4-p27 en cellules CHO ou Sf9 nous a permis de montrer que l’impact de la p27 sur l’activité catalytique des complexes cycline D3-CDK4 dépend de sa stoechiométrie de liaison à ces complexes. L’analyse du profil de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de la CDK4 issue de ces trois systèmes montre que la p27 n’empêche pas la phosphorylation activatrice de la CDK4, même aux concentrations de p27 qui empêchent l’activité pRb kinase du complexe cycline D3-CDK4. Nous avons également montré dans les cellules CHO que la p27 détermine la localisation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4, ceux-ci étant relocalisés dans le cytoplasme par la transfection d’un mutant de la p27 dépourvu de son signal de localisation nucléaire. Ces résultats valident les observations réalisées par immunofluorescence dans les thyrocytes de chien dans lesquels nous avons mis en évidence une étroite corrélation au niveau des cellules individuelles stimulées par la TSH entre la translocation nucléaire de la CDK4 et l’apparition de la p27 nucléaire. Cette colocalisation est partiellement inhibée par le TGF. Ces observations renforcent l’hypothèse d’un rôle de la p27 dans l’ancrage nucléaire des complexes cycline D3-CDK4. Alors que la localisation de la CAK est considérée comme exclusivement nucléaire et son activité catalytique constitutive, nous avons pu montrer que la phosphorylation activatrice de la CDK4 associée à la cycline D3 n’est pas affectée par sa localisation sub-cellulaire et qu’elle est régulée par le TGF dans les thyrocytes de chien et par le sérum dans les cellules T98G indépendamment de l’association de la CDK4 à la p27. De plus, la phosphorylation de la CDK4 sur Thr172 dans les cellules T98G est stimulée par le sérum, alors que la phosphorylation activatrice de la CDK6, son homologue fonctionnel, ne l’est pas. La comparaison de la séquence de ces deux CDKs à proximité des Thr phosphorylées (Thr177 pour la CDK6) révèle, outre une forte similarité de séquence, une différence au niveau de l’acide aminé situé en aval de la thréonine : il s’agit d’une proline dans la CDK4 et d’une sérine dans la CDK6. La mutation P173S de la CDK4 abolit la phosphorylation sur Thr172 et l’activité de la CDK4 associée à la cycline D3 dans les cellules CHO, mais n’affecte pas la phosphorylation et l’activation de la CDK4 par la CAK recombinante in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que la/les CAKs régulée(s) responsables de l’activation de la CDK4 n’ont pas encore été identifiées et que la proline située en aval de la Thr172 de la CDK4 est essentielle pour sa phosphorylation activatrice et son activité pRb kinase.

The cell cycle is a highly orchestrated developmental process that eventually leads to the reproduction of a cell. In metazoans, it is driven by the successive activation of cyclin-dependent kinases (Cdk) and proper coordination of cell cycle transitions and processes ensure genomic stability. DNA replication takes place during S phase to faithfully duplicate a cell’s genetic material. In eukaryotes, S phase onset involves the initiation of numerous licensed replication origins across the genome and requires the activities of two protein kinases, S phase-Cdk and Cdc7. In this thesis, I present work relating to the role of the S phase-promoting kinases in DNA replication and S phase regulation. Using the cell-free system of Xenopus egg extracts, a small molecule inhibitor of Cdc7, PHA-767491, was characterised. PHA-767491 was then used to demonstrate that Cdc7 executes its activity early in S phase before the Cdk-dependent step. Cdc7 is not rate limiting for the progression of the replication timing programme once its essential function has been executed, unlike S-Cdk whose activity is required throughout S phase. Protein Phosphatase 1 (PP1) was identified as a modulator of Cdc7 activity in egg extracts, which rapidly reverses Cdc7-dependent phosphorylation of chromatin-bound Mcm4 and likely functionally lowers Cdc7 activity during an etoposide-induced checkpoint response. This provides a novel mechanism for regulating Cdc7 by counteracting its activity on essential replication substrates in the event of replicative stress. In the second part of the thesis, the design strategy for generating a Cdc7-conditional knockout mouse (cko) is outlined and results from the screen for a transgenic founder are presented. A Cdc7-cko mouse will be a valuable tool to further dissect Cdc7 function and regulation in mammalian cells. In the final section, S phase entry and progression in mouse embryonic fibroblasts lacking both Cdk1 and Cdk2 was examined. Contrary to expectations, Cdk1/Cdk2 double knockout cells can enter S phase in the absence of detectable S phase-Cdk activity. S phase progression, however, was inefficient. Cdc6 and cyclin E1 proteins were found to accumulate in high levels in these cells. The exact function(s) and mechanism(s) for these observations remain to be discovered. With this work, I hope to provide additional insight into the roles and regulation of S phase kinases in eukaryotic DNA replication.

Pour assurer une ségrégation correcte des chromosomes, la cohésion entre les deux chromatides sœurs doit être protégée au centromère contre la vague de phosphorylation du "prophase pathway", depuis la prophase jusqu'à la transition métaphase-anaphase. Cette protection est sous contrôle de la shugoshine (Sgo1), une protéine recrutée au centromère par la thréonine 120 de l'histone H2A phosphorylée par la kinase Bub1. Mon équipe d'accueil a montré que la déplétion de la désacétylase HDAC3 conduit à l'acétylation et la perte de la di-méthylation de la lysine 4 de l'histone 3 au centromère. Cette acétylation forcée de H3K4 est corrélée avec un défaut de la protection de la cohésion et une perte de la localisation des acteurs majeurs de cette protection. L'objectif général de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine kinase CDK11p58 dans la protection de la cohésion. Nous avons pu confirmer que CDK11p58 est nécessaire à la protection de la cohésion centromérique. Des analyses de déplétion de CDK11 montrent une séparation précoce des chromatides sœurs. Cette séparation est corrélée à une perte de la localisation de Bub1, de la phosphorylation de H2A-T120 et de Sgo1 au centromère, mais la diméthylation de H3K4 reste intacte. Grâce à des expériences de FISH en utilisant des sondes qui ciblent la région centromérique du chromosome 11, nous avons démontré que CDK11 protège la cohésion des chromatides sœurs à partir de la mitose mais pas en interphase. En utilisant des lignées exprimant la forme sauvage ou mutée sur le domaine kinase de CDK11p58, nous avons démontré que l'activité kinase de cette protéine est nécessaire pour ce processus de protection. Les résultats de ma thèse documentent le rôle de l'activité kinase de CDK11p58 dans la protection de la cohésion des chromatides sœurs. Ces résultats montrent l'existence d'un substrat de CDK11p58 impliqué dans le recrutement au centromère des facteurs de cohésion qui assurent la protection des cohésines centromériques contre le "prophase pathway". / Sister chromatid cohesion during the early stages of mitosis is essential to ensure faithful chromosome segregation. Sister chromatid cohesion is established in S phase and is maintained at centromeres until the metaphase to anaphase transition. Protection of cohesion at centromeres is under the control of the Bub1 kinase which phosphorylates histone H2A on threonine 120. Phosphorylated H2AT120 recruits the cohesion protection factor shugoshin (Sgo1) at centromeres. We had previously reported that depletion of the HDAC3 deacetylase induces acetylation of histone H3 lysine 4 at the centromere and loss of dimethylation at the same position. Forced acetylation of H3K4 at centromeres correlates with impaired Sgo1 recruitment and loss of sister chromatid separation. Cdk11p58, a member of the p34cdc2 related protein kinase family, is a G2/M specific protein, involved in different cell cycle events such as centrosome maturation, spindle formation or centriole duplication. It has also been reported as being involved in sister chromatid cohesion. Here we report that, upon cdk11p58 depletion, sister chromatids do not prematurely separate until the early stages of mitosis. We confirm that Cdk11p58 depletion induces a loss of Bub1 and Sgo1 from the centromeres and we show that H3K4 dimethylation is not affected by Cdk11p58 depletion. We report that depletion of endogenous Cdk11p58 in a cell line expressing a kinase-dead version of Cdk11p58 do not rescue the premature sister chromatid separation phenotype. Thus, phosphorylation of an unknown susbtrate by Cdk11p58 is necessary to maintain Bub1 at centromeres and our efforts are now directed towards its identification.

Quinases Dependentes de Ciclinas (CDKs) são holoenzimas que possuem uma subunidade catalítica, a CDK, e uma subunidade regulatória, a ciclina. CDKs são Ser/Thr quinases, ou seja, fosforilam resíduos de aminoácidos específicos. A CDK8 fosforila o CTD da RNA Pol II, sendo considerada como regulador transcricional positivo, implicando em efeitos oncogênicos. Em suma, essas descobertas a colocam como alvo de drogas em pesquisas relacionadas ao câncer. Técnicas de biologia molecular foram realizadas a fim de obter o recombinate CDK8::pET28a. A CDK8-HisTag foi expressa em Rosetta(DE3), com cauda de histidina no N-terminal (45 kDa), no entanto a proteína foi expressa como corpos de inclusão. Desta forma, a CDK8-HisTag foi solubilizada com SDS 2%, o detergente foi completamente removido e o refolding da mesma foi obtido com cromatografia líquida de alta eficiência utilizando coluna de Ni2+. A proteína reenovelada e purificada foi analisada por DC e revelou a existência de 13, 6% de hélices α, 34,5 %d e folhas β e 33,1 % de coil. O espectro de emissão de fluorescência da CDK8-HisTag mostrou comprimento de onda máximo em torno de 360 nm. A análise de docking com potenciais inibidores obtidos da espécie W. brachypetala revelou o alcaloide O-metil-hyeronimona como potencial inibidor de CDK8. Este é o primeiro relato de expressão e purificação da proteína CDK8 em E. coli, assim como do screening virtual desta proteína na presença de inibidores naturais obtidos de W. brachypetala. / Cyclin Dependent Kinases (CDK) are holoenzyme having a catalytic subunit, CDK, and a regulatory subunit, cyclin. CDKs are Ser / Thr kinases, which phosphorylate specific amino acid residues. The CDK8 phosphorylates the CTD of RNA Pol II. It is considered a positive transcriptional regulator, resulting in oncogenic effects. In short, these findings pose as a drug target in research related to cancer. Molecular biology assays were performed in order to obtain the recombinant CDK8::pET28a. CDK8-HisTag was expressed in Rosetta (DE3), with a N-terminal tail histidine (45 kDa), however, the protein was expressed as inclusion bodies. In this way, a CDK8-HisTag was solubilized with 2% SDS, then the detergent was completely removed and the refolding of the same was obtained with High Performance Liquid Chromatography using Ni2 + column. A refolded and purified protein for DC analysis revealed the existence of 13.6% helix, 34.5% beta and 33.1% coils. The fluorescence emission spectrum of CDK8-HisTag showed the maximum wavelength around 360 nm. An analysis with potential inhibitors obtained from the W. brachypetala species revealed the alkaloid O-metil-hyeronimona as a potential inhibitor of CDK8. This is the first report of expression and purification of the CDK8 protein in E. coli, as well as the virtual screening of this protein in the presence of natural inhibitors obtained from W. brachypetala.

Quinases Dependentes de Ciclinas (CDKs) são holoenzimas que possuem uma subunidade catalítica, a CDK, e uma subunidade regulatória, a ciclina. CDKs são Ser/Thr quinases, ou seja, fosforilam resíduos de aminoácidos específicos. A CDK8 fosforila o CTD da RNA Pol II, sendo considerada como regulador transcricional positivo, implicando em efeitos oncogênicos. Em suma, essas descobertas a colocam como alvo de drogas em pesquisas relacionadas ao câncer. Técnicas de biologia molecular foram realizadas a fim de obter o recombinate CDK8::pET28a. A CDK8-HisTag foi expressa em Rosetta(DE3), com cauda de histidina no N-terminal (45 kDa), no entanto a proteína foi expressa como corpos de inclusão. Desta forma, a CDK8-HisTag foi solubilizada com SDS 2%, o detergente foi completamente removido e o refolding da mesma foi obtido com cromatografia líquida de alta eficiência utilizando coluna de Ni2+. A proteína reenovelada e purificada foi analisada por DC e revelou a existência de 13, 6% de hélices α, 34,5 %d e folhas β e 33,1 % de coil. O espectro de emissão de fluorescência da CDK8-HisTag mostrou comprimento de onda máximo em torno de 360 nm. A análise de docking com potenciais inibidores obtidos da espécie W. brachypetala revelou o alcaloide O-metil-hyeronimona como potencial inibidor de CDK8. Este é o primeiro relato de expressão e purificação da proteína CDK8 em E. coli, assim como do screening virtual desta proteína na presença de inibidores naturais obtidos de W. brachypetala. / Cyclin Dependent Kinases (CDK) are holoenzyme having a catalytic subunit, CDK, and a regulatory subunit, cyclin. CDKs are Ser / Thr kinases, which phosphorylate specific amino acid residues. The CDK8 phosphorylates the CTD of RNA Pol II. It is considered a positive transcriptional regulator, resulting in oncogenic effects. In short, these findings pose as a drug target in research related to cancer. Molecular biology assays were performed in order to obtain the recombinant CDK8::pET28a. CDK8-HisTag was expressed in Rosetta (DE3), with a N-terminal tail histidine (45 kDa), however, the protein was expressed as inclusion bodies. In this way, a CDK8-HisTag was solubilized with 2% SDS, then the detergent was completely removed and the refolding of the same was obtained with High Performance Liquid Chromatography using Ni2 + column. A refolded and purified protein for DC analysis revealed the existence of 13.6% helix, 34.5% beta and 33.1% coils. The fluorescence emission spectrum of CDK8-HisTag showed the maximum wavelength around 360 nm. An analysis with potential inhibitors obtained from the W. brachypetala species revealed the alkaloid O-metil-hyeronimona as a potential inhibitor of CDK8. This is the first report of expression and purification of the CDK8 protein in E. coli, as well as the virtual screening of this protein in the presence of natural inhibitors obtained from W. brachypetala.

La réplication de l’ADN est un processus essentiel qui doit avoir lieu une seule fois par cycle cellulaire. Ce processus hautement régulé et très conservé chez les eucaryotes, assure une complète duplication et donc une totale transmission de l’information génétique. Des changements dans le programme de réplication, qui est définit par le moment d’activation et la fréquence d’utilisation de l’ensemble des origines, ont été observés lors du développement, après induction de la différenciation chez des cellules souches embryonnaires de souris, ainsi que dans un grand nombre de cancers. La régulation de la réplication de l’ADN est donc un processus essentiel pour le maintien de l’intégrité du génome et le programme de réplication pourrait y contribuer de manière importante. Cependant, en dépit d’un grand nombre de travaux sur les différentes protéines et modifications impliquées dans la sélection des origines, les principaux déterminants ainsi que leur interdépendance restent étonnement méconnus. Mon projet de thèse se focalise sur l’identification des paramètres clés qui régulent le programme de réplication, en utilisant comme modèle la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe. Premièrement, je me suis intéressé au rôle de la dynamique de l’activité des CDKs lors de la phase G1 ainsi que de leur niveau d’activité à la frontière G1/S dans la sélection des origines. J’ai démontré que changer la longueur de la phase G1 à travers la modulation de l’activité des CDKs se traduit par une modification du profil de réplication tout au long du génome. Plus précisément, les origines inefficaces sont utilisées plus fréquemment alors que les origines efficaces ont une activité réduite. D’un autre coté, nous avons également montré que le nombre d’origines actives pour une phase S donnée, dépend du niveau d’activité des CDKs lors de l’entrée en phase S, suggérant ainsi que cette activité est un facteur limitant dans la régulation de l’initiation de la réplication. Dans un second temps, j’ai utilisé une approche dans laquelle les cellules établissent un programme de réplication de novo après la sortie de quiescence, afin d’étudier les premières étapes de la sélection des origines de réplication, en se focalisant sur l’importance du recrutement de ORC (Origin Recognition Complex) aux origines. L’analyse du profil de liaison de ORC révèle une forte corrélation entre le niveau de liaison de ORC aux origines et l’efficacité de ces dernières, démontrant pour la première fois que ORC n’est pas simplement un marqueur des sites d’initiation potentiels mais plutôt un déterminant crucial dans l’établissement du programme de réplication. Finalement, j’ai observé que les origines efficaces ont tendance à être organisées en groupes tout au long du génome, suggérant que l’organisation chromosomique pourrait être importante dans la sélection des origines de réplication. Afin d’étudier cela, j’ai généré des souches contenant différents réarrangements chromosomiques. Nos résultats indiquent que la position relative d’une origines par rapport à son contexte chromosomique, joue un rôle important dans la régulation de son efficacité et que des régions distinctes peuvent avoir des effets opposés sur la sélection des origines en étant soit activatrices ou inhibitrices. / DNA replication is an essential process that occurs only once in a cell cycle before cell division. Replication is highly regulated through conserved mechanisms to ensure the faithful duplication and transmission of genetic information. Interestingly, changes in the replication program, defined by the temporal and spatial pattern of replication origin activation, have been observed during development in distinct cell types, after induction of differentiation in mouse embryonic stem cells, and in various cancers. The regulation of DNA replication is therefore essential for ensuring the integrity of the genome, and the program of origin activation may be an important contributor to this process. However, despite a large body of work on the many enzymes and modifications involved in origin selection, the critical determinants as well as their interdependence remain surprisingly unknown. My thesis project focuses on identifying the key parameters that regulate the replication program, taking advantage of unique approaches using the fission yeast Schizosaccharomyces pombe as a model system. First, we investigated the qualitative and quantitative aspects of the role of CDK activity in determining the program of DNA replication. We demonstrated that changing the length of G1 phase through modulation of CDK activity has an impact on the profile of replication initiation along the chromosome. More specifically, inefficient origins show increases in their usage, while efficient origins have reduced activities. Moreover, we have shown that cells are highly sensitive to differences in CDK activity levels at the G1/S transition, which result in genome-wide changes in replication initiation across the entire spectrum of efficiencies. This suggests that CDK activity is a dose-dependent, limiting factor in the regulation of origin usage. Thus, our study establishes the integration of both temporal and quantitative regulation of CDK activity as a key determinant in defining the program of genome duplication. Second, using an approach in which cells establish a replication program de novo after exit from quiescence, we investigated the critical first steps of origin selection. We focused on the importance of the essential Origin Recognition Complex, whose recruitment to origins is required for the subsequent assembly of replication complexes. Our analysis reveals a strong correspondence between the level of ORC binding at origins and the efficiency of these origins in both cells exiting quiescence as well as those in vegetative growth conditions. Therefore, we demonstrate for the first time that ORC is not simply a marker of potential initiation sites but rather a crucial determinant in the program of origin usage.Finally, our observation that efficient origins are organized in distinct clusters in the de novo replication program suggested that chromosomal organization may be important for origin selection. To address this question, we have generated strains containing a series of distinct chromosomal rearrangements and assessed their origin efficiency profiles. Our findings indicate that the localization of an origin with respect to its chromosomal context plays an important role in regulating its efficiency. Moreover, distinct regions may have different effects on origin selection by being permissive or inhibitory for origin activity. Those observations could indicate a role for the spatial organization of the genome in origin selection and thus led us to study chromosome and nuclear organization in conditions where the replication program is different.