Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-12Bitstream added on 2014-06-13T19:08:57Z : No. of bitstreams: 1 antonio_t_me_araiq.pdf: 609701 bytes, checksum: da17caf99f88297148973c0dd3d64e83 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os grupos de antibióticos mais importantes clinicamente são os dos b-lactâmicos, aminoglicosídeos e tetraciclinas. Streptomyces clavuligerus produz vários compostos b- lactâmicos, com destaque para os antibióticos envolvidos na rota biossintética da cefalosporina C (penicilina N, deacetoxicefalosporina C e cefamicina C) e o ácido clavulânico (AC) que, embora não tenha atividade biológica significativa, é um potente inibidor de b-lactamases (penicilinases e cefalosporinases). A cefamicina C (CefC) é uma 7-metoxi-cefalosporina que apresenta maior atividade que a cefalosporina C (CPC), produzida somente por fungos, por ser resistente a b-lactamases. Apesar das rotas biossintéticas de AC e CefC serem completamente independentes em S. clavuligerus, são controladas pelo mesmo elemento multifuncional (ccaR), o que dificulta a indução da produção de um ou outro composto durante o processo fermentativo. No presente trabalho, procurou-se obter maiores concentrações de CefC manipulando-se componentes em meio solúvel de cultivo de S. clavuligerus, selecionados dentre compostos que, segundo a literatura, atuam como agentes reguladores da síntese daquele antibiótico. As fermentações foram realizadas em frascos agitados (28ºC, 260 rpm) para selecionar fontes de C e de N e, então, avaliar o processo no melhor meio-padrão, variando-se concentrações combinadas de L-lisina (10 a 108 mM) e -cetoglutarato (3 a 110 mM) através de metodologia de planejamento experimental. A presença de -cetoglutarato acarretou em aumento indesejável de pH, afetando negativamente o processo e os melhores resultados (entre 300 e 400 mg CPC totais/L após 72 horas de fermentação) foram obtidos no meio adotado como meio-controle, contendo amido e extrato protéico de semente de algodão como principais fontes de C e N, respectivamente, e L-lisina. / The most important groups of antibiotics, from a clinical standpoint, are -lactams, aminoglycosides and tetracyclines. Streptomyces clavuligerus produces several -lactam compounds, primarily the antibiotics involved in the biosynthetic route of cephalosporin C (penicillin N, deacetoxycephalosporin C and cephamycin C) and clavulanic acid (CA), which, despite its slight biological activity, is a potent inhibitor of -lactamases (penicillinases and cephalosporinases). Cephamycin C (CMC) is a 7-methoxycephalosporin with higher bioactivity than cephalosporin C (CPC) because it is more resistant to -lactamases. Although the biosynthetic routes of CA and CMC are completely independent in S. clavuligerus, they are controlled by a common multi-functional element (ccaR), which hinders induction of the production of one or the other compound during the fermentation process. In this work, we sought to obtain higher concentrations of CMC by handling compounds in a soluble medium of S. clavuligerus, which were selected from compounds that, according to the literature, act as regulating agents in the synthesis of that antibiotic. Fermentation was carried out in flasks under shaking (28ºC, 260 rpm), in order to select sources of C and N. The process was then evaluated in the best standard medium, by varying combined concentrations of lysine (10 to 108 mM) and -ketoglutarate (3 to 110 mM) using an experimental planning methodology. The presence of -ketoglutarate caused an undesirable increase in pH, negatively affecting the process. The best results (between 300 and 400 mg/L of total CPC after 72 h of fermentation) were obtained in the medium used as the control, which contained starch and cottonseed protein extract as main sources, respectively, of C and N, and L-lysine.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2676.pdf: 1847822 bytes, checksum: 58fc94ed542ac5ac19abe8c829cc836d (MD5) Previous issue date: 2009-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / Clavulanic acid and cephamycin C are ϐ-lactam compounds, an important group of drugs used in the treatment of several bacterial diseases, and are simultaneously produced by the bacteria Streptomyces clavuligerus. Similarly to any secondary metabolite, the production of these compounds can be controlled by the intracellular concentration of precursors and cofactors, and their availability to be used in the secondary metabolism depends directly on the nutritional composition changes in the culture media. Based on these facts, the aim of this work was to evaluate the effect of some carbon and nitrogen sources on clavulanic acid (CA) and cephamycin C (CefC) production by S. clavuligerus, and to propose a kinetic model able to represent the influence of these compounds on the behavior of this bioprocess. The fermentation runs were carried out in shakers, using synthetic media, combining glycerol, maltose, asparagine, proline, glutamic acid and ornithine. The results showed that both carbon and nitrogen sources were limitants. The fermentations with media containing maltose gave the highest CA and CefC productions, but the bacterial growth was lower. On the other hand, the fermentations with the media containing glycerol gave a higher bacterial growth and lower production, except for the fermentation using the media composed by glycerol, proline and ornithine, that gave the lowest growth and CA production, and there was no CefC production. The aditition of glutamic acid in the medium containing maltose and asparagine, and the aditition of more asparagine in this same medium favored the bacterial growth, but have no effect on production. The glutamic acid effect on the growth was more intense than that of asparagine. Based on the obtained results, a kinetic model describing the growth, CA and CefC production was proposed. The adjustment of the model to the experimental data was made in six different fermentations. The model had a good adjustment to four of all the media tested, and was able to represent the bioprocess within the conditions studied in this work. / O ácido clavulânico e a cefamicina C são compostos -lactâmicos, um importante grupo de medicamentos utilizados no tratamento de doenças bacterianas, e são produzidos simultaneamente pela bactéria Streptomyces clavuligerus. Como qualquer metabólito secundário, a produção destes compostos pode ser controlada pela concentração intracelular de precursores e cofatores, e a sua disponibilidade para uso no metabolismo secundário responde diretamente a mudanças na concentração de nutrientes presentes no meio de cultura. Baseado nestas informações, este trabalho teve como objetivo avaliar como certas fontes de carbono e nitrogênio afetam a produção do ácido clavulânico (AC) e cefamicina C (CefC) por S. clavuligerus, e desenvolver um modelo cinético que possa descrever matematicamente a influência destes componentes no bioprocesso. Para isso, foram realizados cultivos em mesa incubadora rotativa, usando meios sintéticos constituídos da combinação de glicerol, maltose, asparagina, prolina, ácido glutâmico e ornitina. Os resultados dos cultivos mostraram que tanto as fontes de carbono e energia quanto as fontes de nitrogênio foram limitantes. Os cultivos em meios com maltose apresentaram as maiores produções de AC e CefC, mas um menor crescimento. Um comportamento contrário foi observado nos cultivos com os meios contendo glicerol. O cultivo realizado no meio contendo glicerol, prolina e ornitina foi o que apresentou menor crescimento e produção de AC, e nenhuma produção de CefC. O ácido glutâmico favoreceu o crescimento no meio com maltose e asparagina, mas não alterou a produção. O aumento da concentração de asparagina no meio com maltose e asparagina também favoreceu o crescimento, mas também não apresentou nenhum efeito sobre o crescimento e produção. Baseado nos resultados obtidos, foi proposto um modelo matemático que descrevesse o crescimento e a produção de AC e CefC nos meios utilizados. O ajuste foi feito em seis meios diferentes. O modelo apresentou um bom ajuste aos dados experimentais para quatro dos meios estudados e foi capaz de representar o bioprocesso nas condições testadas neste trabalho.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3016.pdf: 1439858 bytes, checksum: d2fb7acefaebdedc5e74fca49ca5195d (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephamycin C (CephC) is a natural antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus that presents β-lactamases resistance, enzymes that clives β-lactam of antibiotics. The aim of present work was study cephamycin production by Streptomyces clavuligerus in batch and fed-batch cultivations, in order to define important parameters as culture medium and carbon source feeding conditions for the purpose of maximize the CefC production. First the methodology of analysis of CefC was tested. Due to standard unavailability for analysis of CefC in the fermentative broths, it was evaluated the sensibility of microorganism test (Escherichia coli ESS) face other standards. It was verified that E. coli ESS strain presents super sensibility to penicillin G and cephalosporin C. Due to the presence of clavulanic acid (CA) in the both, a β-lactamase inhibitor, it was evaluated the influence of the sample treatment (acid and basic hydrolisis) on penicillin N hydrolysis by penicillinase. For an adequate CephC analysis, the results showed that both clavulanic acid and cephamycin C were degraded in acid and alkaline medium, with higher degradation was in alkaline pH. The results show that the samples should be treated only with penicillinase for the correct CephC analysis by elimination of intermediates compounds the CephC biosynthetic pathway. For the evaluation of the CephC production, firstly different culture media proposed in the literature were tested with S. clavuligerus ATCC 27064 strain in bench scale bioreactor. The best result in terms of cellular growth and CephC production (374.8 mg.L-1 em 66 h) was obtained in batch cultivation that utilized starch and cottonseed meal as carbon and nitrogen sources. The influence of carbon and nitrogen sources on CephC production was then evaluated utilizing two Streptomyces clavuligerus strains, ATCC 27064 and DSM 41826, a natural mutant indicated as higher CephC producing by literature. Glycerol and soy bean meal have showed more suitable as carbon and nitrogen sources for CephC production due probably to slow and gradual availability of nitrogen from protein hydrolysis of soy bean meal (insoluble nitrogen source). In the fed-batch cultivation utilizing glycerol or starch as carbon source, the best result in terms of CephC production (566.5 mg.L-1 in 108 h) was obtained in the fed-batch cultivation with glycerol feeding at volumetric flow rate of 0,01 L.h-1 and concentration of 177 g.L-1. In the experimental conditions tested in the fed-batch cultivations, ranging carbon source and feeding conditions, it was not possible visualize the dissociation between clavulanic acid and cephamycin productions. The higher CephC in medium with glycerol is probably associated to its favorable energetic balance and metabolization rate in relation to starch. / A cefamicina C (CefC) é um antibiótico natural produzido por Streptomyces clavuligerus que apresenta resistência à ação de β-lactamases, enzimas que degradam o anel β -lactâmico de antibióticos. O presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de CefC por Streptomyces clavuligerus em batelada e batelada alimentada, no sentido de se definir parâmetros importantes como composição do meio de cultura e condições de alimentação de meio suplementar de forma a maximizar a produção de CefC. Primeiramente, a metodologia de análise de CefC foi testada. Devido à indisponibilidade de um padrão para a análise da concentração de CefC obtida nos caldos fermentados, avaliou-se a sensibilidade do microrganismo teste, Escherichia coli ESS, frente a outros padrões. Verificou-se que a linhagem de E. coli ESS é supersensível à penicilina G e à cefalosporina C. Devido à presença de ácido clavulânico (AC) no caldo, um inibidor de β-lactamases, foi avaliada a influência do tratamento das amostras (hidrólises ácida ou alcalina) na hidrólise de penicilina N por penicilinase. Tanto AC quanto a CefC foram degradados em meios ácidos e alcalinos, sendo a degradação maior em pH básico. Os resultados demonstraram que a inativação do ácido clavulânico não é necessária para a inativação de penicilina N pela penicilinase. Para a avaliação da produção de CefC, primeiramente foram testados diferentes meios de cultura propostos na literatura com a linhagem de S. clavuligerus ATCC 27064. O melhor resultado foi alcançado no cultivo utilizando meio de cultura composto por amido como fonte de carbono e farinha de semente de algodão como fonte de nitrogênio que forneceu boa produção de cefamicina (374,8 mg.L-1 em 66 h) associada a bom crescimento celular. Foi também estudada a influência de diferentes fontes de carbono e de nitrogênio na produção de CefC, utilizando duas linhagens de Streptomyces clavuligerus, ATCC 27064 e DSM 41826. O glicerol e farinha de soja mostram-se como mais favoráveis, mostrando que a produção de CefC é melhorada com a lenta e gradual disponibilidade de nitrogênio a partir da hidrólise de proteínas da farinha de soja (fonte insolúvel de nitrogênio). Nos cultivos em batelada alimentada, a maior produção de CefC (566,5 mg.L-1 em 108 h) foi alcançada no cultivo alimentado com glicerol à vazão volumétrica de 0,010 L.h-1 e concentração de glicerol na alimentação de 177 g.L-1. Nas condições experimentais testadas variando fonte de C e condições de alimentação não foi possível visualizar a dissociação entre as produções de ácido clavulânico e de cefamicina C. A maior produção de CefC com glicerol em relação ao amido está associada provavelmente ao balanço energético e velocidade de metabolização favoráveis ao glicerol.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008Bitstream added on 2014-06-13T18:50:20Z : No. of bitstreams: 1 correa_t_me_araiq.pdf: 384400 bytes, checksum: 29862180365116d9b884951e094a9a20 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Muitos compostos beta-lactâmicos são sintetizados por bactérias do gênero Streptomyces. As cefalosporinas, entre elas a cefamicina C (CefC) são apenas alguns exemplos de antibióticos sintetizados por Streptomyces clavuligerus. Os antibióticos beta-lactâmicos são formados, em procariotos e eucariotos, a partir de três aminoácidos, o ácido L-alfaaminoadípico (AAA), a L-cisteína e a L-valina. Em procariotos, o AAA é formado por desaminação da L-lisina pela enzima lisina ε-aminotransferase (LAT). A L-lisina exerce um papel fundamental na síntese destes compostos atuando como indutora da LAT, a primeira enzima da rota biossintética de CefC. Desta forma, uma variação adequada na concentração de lisina no meio de produção deve proporcionar melhorias na produção da CefC. Além da lisina, as fontes de carbono e nitrogênio também exercem fundamental importância, uma vez que participam de vários mecanismos reguladores, tanto do metabolismo primário como do secundário, durante o processo fermentativo. O presente trabalho teve como objetivo investigar a influência da presença e concentração de fontes de carbono, de L-lisina e de compostos relacionados à rota biossintética de antibióticos beta-lactâmicos em S. clavuligerus ATCC 27064, com ênfase no aumento da produção de CefC. Foram realizadas fermentações variando-se a natureza e a concentração de determinados compostos no meio de produção (fontes de carbono, de nitrogênio, etc) e, também, as condições de suplementação de L-lisina e outros compostos ao longo do processo. Com relação à fonte de carbono e energia (substrato limitante), os resultados demonstraram que o amido propiciou a maior produção de cefalosporinas totais, enquanto o glicerol foi mais adequado ao crescimento celular. Os resultados permitiram obter um meio padrão adequado para a... / Many beta-lactamic compounds are synthesized by bacteria from the Streptomyces ssp. The cephalosporins and among then the cephamycin C (CefC) are some examples of antibiotics synthesized by Streptomyces clavuligerus. The beta-lactam antibiotics are formed, both in eukaryote and prokaryote, by three amino acids, the L-alfa-aminoadipic acid (AAA), the L-cysteine and the L-valine. In prokaryote the AAA is formed by desamination of the Llysine by the lysine ε-aminotransferase (LAT) enzyme. The L-lysine plays a fundamental roll in the synthesis of these compounds acting as an inductor of the LAT, the first enzyme in the biosynthetic route of the CefC. Therefore, an adjusted variation on the lysine concentration in the production medium should provide improvement in the production of CefC. Besides lysine, the carbon and nitrogen sources also exert a crucial importance, once they are part of many regulating mechanisms from primary and secondary metabolism during fermentation. The objective in this paper is to investigate the influence of the presence and concentration of sources of carbon, L-lysine and composites related to the beta-lactam antibiotics biosynthetic route in S. clavuligerus ATCC 27064, with emphasis in the increase of the CefC production. Fermentation had been carried through varying the nature and concentration of certain composites in the production environment (sources of carbon, nitrogen, etc) and also the lysine and other compounds supplementation conditions along with the process. In relation to the sources of carbon and energy (limiting substrate), the results show that starch provides a higher production of total cephalosporins while glycerol has been more appropriate to cellular growth. The results allowed obtaining an appropriate standard medium to develop cephalosporins, ...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5228.pdf: 2240292 bytes, checksum: 0afa7318b447dd1c9b5cbc1d58e3434b (MD5) Previous issue date: 2013-04-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephalosporins are β-lactam antibiotics which are widely used in the treatment of bacterial infections. Within this group, cephamycin C (CefC) stands out from the others cephalosporins antibiotics due to its greater resistance to β-lactamases enzymes and its broader spectrum of action against Gram-negative pathogens. It is produced by the bacteria Nocardia lactamdurans and Streptomyces clavuligerus, usually in submerged fermentation. In the literature, the available information about the purification processes of this antibiotic are restricted to patents or papers published in the past decades. As cefC is the raw material for the production of important semi-synthetic antibiotics and due to the lack of scientifically substantiated information about its separation and purification processes, the motivation for the development of this thesis has arisen. Then, the aim of this thesis was to study the purification process of CefC produced by S. clavuligerus, by using the processes of adsorption and ion exchange in fixed bed columns. The techniques of adsorption and ion exchange present themselves as good strategies for CefC purification due to the amphoteric nature of the antibiotic molecule, which has positive or negative charges depending on the environmental pH, and the bicyclic nucleus in its structure, which allows the interaction with hydrophobic structures. As there is no chemical standard of cefC available on the market, in this study we have only used culture broth containing this antibiotic. The adsorbents evaluated were the neutral resins Amberlite XAD4 and Amberlite XAD16 and the anionic resin Q Sepharose XL. At first, ion exchange column experiments using the resin QXL were carried out. The results showed that the variation of the flow rate in the range of 2.5 mL/min to 7.5 mL/min did not affect the efficiencies of product recovery nor of bed utilization, and it did not interfere with the bioactive compounds elution. The isocratic elution modes using 0.1% or 1% NaCl (w / v) were able to separate cefC from other (s) compound (s) with antimicrobial activity present in the broth, which were not identified. But the use of 1% NaCl solution promoted the antibiotic recovery in a shorter process time and smaller volume than using 0.1 % NaCl solution. After analysis by mass spectrometry, carried out by ESI ionization in the positive mode, it was observed that the ion exchange process with QXL resin followed by adsorption on a C18 SPE cartridge were able to separate cefC from compound (s) whose molecules after ionization acquired m/z ratios corresponding to the lysine s molecule, and they also reduced the concentration of contaminants with m/z ratios corresponding to the molecules of penicillin N, deacetylcephalosporin C and deacetoxycephalosporin C. As the ion exchange studies were done, the adsorption studies using the neutral resins were initiated. At first, adsorption isotherms of cefC on XAD4 and XAD16 resins were obtained, and the effects of pH and temperature in the adsorption equilibrium were evaluated. The results showed that the broth pH had strong influence on the adsorption and the best condition was observed at pH 2.6 at 15° C. The kinetic experiments have shown that equilibrium is reached more quickly on the resin XAD16. Estimation of intrinsic kinetic parameters and mass transfer coefficients returned higher values for this resin. The column adsorption processes with XAD4 resin, when the column feed consisted of the ultrafiltered or clarified broth and the elution solutions were 1% or 5% (v/v) EtOH solutions, did not lead to separation of cefC from contaminants that were monitored in the experiments. But when the feed consisted of a preAbstract iv purified fraction, obtained in the ion exchange column with QXL resin, added with cephalosporin C, it was possible to separate the two antibiotics. Cephalosporin C was added to simulate the presence of some contaminants in the culture broth - deacetylcephalosporin C and deacetoxycephalosporin C. As these contaminants are in very low concentrations and there are not commercial chemical standards available to purchase, neither an analytical methodology to quantify them, it was decided to add cephalosporin C, whose chemical structure is very similar to the contaminants, the commercial standard is commercially available and there is a quantification method to determinate it. The column experiments with resin XAD16 showed similar results to the experiments with resin XAD4, in which it was also observed the separation of cefC from cephalosporin C. The moment analysis of the chromatographic peaks showed that cefC average retention times and peak dispersions were smaller in the column assays with XAD16 than with XAD4. Thus, a more concentrated fraction containing cefC was obtained in the column experiments with XAD16 resin. Therefore, it was demonstrated by the purification processes studied that the techniques of adsorption and ion exchange were effective in the purification of cefC in relation to contaminants that are difficult to separate / As cefalosporinas são antibióticos β-lactâmicos muito utilizados no tratamento de infecções bacterianas. Dentro do grupo, a cefamicina C (cefC) se destaca devido a sua maior resistência à ação das β-lactamases bacterianas e ao seu maior espectro de ação contra patógenos Gramnegativos. Ela é produzida pelas bactérias Nocardia lactamdurans e Streptomyces clavuligerus, geralmente em cultivos submersos. Na literatura, as informações existentes sobre os processos de purificação deste antibiótico estão disponíveis apenas em patentes ou em artigos publicados em décadas passadas. Sendo um composto que é matéria-prima para produção de antibióticos semissintéticos de grande importância clínica e comercial, e devido à falta de informações fundamentadas cientificamente sobre os processos de separação e purificação deste antibiótico, surgiu a motivação para o desenvolvimento desta tese. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a purificação da cefC produzida por S. clavuligerus, utilizando o processo de adsorção e troca iônica em colunas de leito fixo. As técnicas de adsorção e troca iônica apresentam-se como uma boa estratégia para purificação da cefC devido à natureza anfótera da molécula do antibiótico, que possui cargas positivas ou negativas dependendo do pH do meio, e ao núcleo bicíclico em sua estrutura, que permite a interação com estruturas hidrofóbicas. Como não há o padrão da cefC disponível no mercado, neste estudo trabalhou-se apenas com o caldo de cultivo. Os adsorventes avaliados foram as resinas neutras Amberlite XAD4 e Amberlite XAD16 e a resina de troca iônica Q Sepharose XL. Inicialmente, foram realizados experimentos em coluna de troca iônica com a resina QXL. Os resultados destes ensaios mostraram que a variação da vazão no intervalo de 2,5 mL/min a 7,5 mL/min não alterou as eficiências de recuperação do produto e de utilização do leito, nem interferiram na eluição dos compostos bioativos. A eluição no modo isocrático com solução de NaCl 1% (m/v) possibilitou a separação da cefC de outro(s) composto(s) com atividade antimicrobiana presentes no caldo, mas não identificados, e promoveu uma recuperação do antibiótico em um tempo menor de processo e em um volume menor de solução que a eluição com NaCl 0,1%. Após análise por espectrometria de massas, com ionização feita por ESI no modo positivo, observou-se que o processo de troca iônica seguido da adsorção em cartucho de SPE C18 foi capaz de separar a cefC de composto(s) com a razão m/z correspondente à lisina, e diminuir a concentração de contaminantes presentes no caldo cujas moléculas apresentaram, após ionização, razão m/z correspondentes à das moléculas de penicilina N, desacetilcefalosporina C e desacetoxicefalosporina C. Finalizados os experimentos de troca iônica, iniciaram-se os estudos de adsorção utilizando as resinas neutras. Os primeiros experimentos consistiram na determinação de isotermas de adsorção da cefC nas resinas XAD4 e XAD16, avaliando a influência do pH e da temperatura no equilíbrio de adsorção. Os resultados mostraram que o pH do caldo teve drástica influência na adsorção, sendo que a melhor condição observada foi no valor de pH 2,6 à 15°C. Os ensaios cinéticos mostraram que o equilíbrio é atingido mais rapidamente na resina XAD16. A estimativa dos parâmetros cinéticos intrínsecos e de transferência de massa retornaram valores maiores para esta resina. O processo de adsorção em coluna com a resina XAD4, quando a alimentação da coluna consistiu do caldo ultrafiltrado ou clarificado e a eluição foi feita com as soluções de EtOH 1% ou 5% (v/v), não levou à separação da cefC dos contaminantes que Resumo ii foram monitorados nos ensaios. Mas quando a alimentação foi feita com uma fração prépurificada, oriunda da troca iônica, adicionada de cefalosporina C, foi possível obter a separação dos dois antibióticos. A cefalosporina C foi adicionada para simular a presença de alguns contaminantes presentes no caldo de cultivo a desacetilcefalosporina C e desacetoxicefalosporina C. Como estes contaminantes estão em concentrações muito baixas e não existem os padrões comerciais disponíveis para serem adquiridos, nem metodologia analítica para quantificá-los, optou-se por adicionar cefalosporina C, cuja estrutura química é bem similar à dos contaminantes, existe o padrão comercial para ser adquirido e possui um método de quantificação. Os experimentos em coluna com a resina XAD16 mostraram resultados similares aos experimentos com a resina XAD4, nos quais também foi observada a separação entre a cefC e a cefalosporina C. Após análise dos momentos dos picos cromatográficos, verificou-se que a cefC apresentou tempos de retenção médios menores na resina XAD16 e a dispersão dos picos foi menor. Desta forma, foi obtida uma fração mais concentrada em cefC nos ensaios em coluna com esta resina do que com a resina XAD4. Portanto, pôde-se constatar pelo processo de purificação estudado que as técnicas de adsorção e troca iônica mostraram-se eficientes na purificação da cefC em relação a contaminantes difíceis de serem separados.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5315.pdf: 2167736 bytes, checksum: 42c21ae0612a2550b93786bcc8cd967b (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephamycin C is a β-lactam antibiotic that belongs to the cephalosporins. This antibiotic stands out from other cephalosporins because it has activity against gram-negative bacteria and for being resistent to β-lactamases produced by pathogenic microorganisms, and which represent one of the major mechanisms of bacterial resistance to β-lactam antibiotics. In view of the restricted information in the literature about the steps of the process, both from the point of view of research and of industrial production of cephamycin C, the study about its production and, consequently, the process of separation and purification becomes of great importance. Therefore, the main objective of this work was to develop a separation and purification process of cephamycin C from a fermentation broth produced by cultivations of Streptomyces clavuligerus in aired submerged processes. Extraction and separation processes of cephamycin C were performed by means of an aqueous two-phase system (ATPS) and ionexchange chromatography, respectively. Initially, studies on the stability of cephamycin C were performed in order to allow the establishment of conditions which minimize losses and increase the yield of the global process. In these studies, conditions at pH levels of 2.2, 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 7.6 and 8.7 at a temperature of 20 °C were evaluated. The smallest half-life was of 52.6 hours and was verified for pH 8.7; the longest half-life was of 459 hours for pH 6.0; and for the most acid pH (2.2), half-life was of 118.2 hours. The second step of the work was the study of the separation of cephamycin C and amino acids with the aqueous two-phase system composed by PEG/phosphate. The presence of ornithine, lysine and asparagine amino acids in the fermentation broth, even after the primary separation steps performed by filtration processes consisting of microfiltration and ultrafiltration, is due to the composition of the culture medium which is of complex origin. The experiments were carried out by varying the following parameters: molecular mass of PEG (400, 600, 1000 and 4000), pH (6, 7 and 8), tieline length (TLL 37 and 43) and phase volume ratio (rTLL 0.75, 1.00 and 1.25), in order to enable the determination of the best system for cephamycin C extraction. The best conditions obtained for this process were pH 8, PEG 400, TLL 43 and rTLL 1.00, where the highest partition coefficient, kp of 5.57, was acquired. For the separations of cephamycin C and the amino acids present in the broth, it was possible to verify the following separation efficiencies: 3.4 (ornithine), 6.9 (lysine) and 2.8 (asparagine). The last step of the work showed that it is possible to recover cephamycin C from the PEG phase promoting an even greater purification with the residual amino acids. The ion-exchange chromatography was used to propose so. For this proposal, we used the ion exchange chromatographic technique, with use of anionic resin Amberlite IRA 400. These experiments were performed under temperatures of 20, 25 and 30 °C and pH 2.8 and 6.8. The Amberlite IRA 400 Cl- resin showed affinity for cephamycin C, and in the experiments in fixed bed column, it was possible to separate cephamycin C from PEG, from the phosphate salt and from the amino acids present in the top phase. The results allowed the conclusion that the proposed process is an excellent alternative for the extraction, separation and purification of cephamycin C. / A cefamicina C (cef C) é um antibiótico β-lactâmico que pertence à classe das cefalosporinas. Este antibiótico se destaca das demais cefalosporinas por possuir atividade frente a bactérias gram-negativas e ser resistente à ação das β-lactamases, produzidas por micro-organismos patogênicos, e que representam um dos principais mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo, tanto sob o ponto de vista de pesquisa e industrial de produção da cefamicina C, torna-se de grande importância o estudo de sua produção e consequentemente do processo de separação e purificação. Portanto, o objetivo principal deste trabalho foi desenvolver um processo de separação e purificação da cefamicina C, a partir de um caldo fermentado produzido por cultivos da bactéria Streptomyces clavuligerus, em processos submersos aerados. Os processos de extração e separação da cefamicina C foram realizados por meio de sistema de duas fases aquosas (SDFA) e cromatografia de troca iônica em coluna de leito fixo, respectivamente. Inicialmente, foram realizados estudos de estabilidade da cefamicina C, tendo em vista permitir o estabelecimento de condições que minimizem as perdas e aumentem o rendimento do processo global. Nestes estudos foram avaliadas as condições em pH de 2,2, 3,3, 5,0, 6,0; 7,0; 7,6 e 8,7 a uma temperatura de 20 °C. A meia-vida para o pH 8,7 foi de 52,6 horas, para o pH 6,0 a meia-vida foi de 459 horas e, para o pH mais ácido (2,2), a meia-vida foi de 118,6 horas. A segunda etapa do trabalho correspondeu ao estudo da separação entre a cefamicina C e os aminoácidos, por meio do sistema de duas fases aquosas composto por polietileno glicol (PEG) /fosfato. A presença dos aminoácidos ornitina, lisina e asparagina no caldo fermentado, mesmo após as etapas de separação primária, realizada por processos de filtração compostos por microfiltração e ultrafiltração, devem-se a composição do meio de cultura de origem complexa. Os experimentos foram realizados variando-se os seguintes parâmetros: massa molecular de PEG (400, 600, 1000 e 4000), pH (6, 7 e 8), tamanho de tieline (TLL 37 e 43) e razão de volume das fases (rTLL 0,75, 1,00 e 1,25), de modo a possibilitar a determinação do melhor sistema para a extração da cefamicina C. As melhores condições obtidas para este processo foram pH 8, PEG 400, TLL 43 e rTLL 1,00, onde se obteve o maior coeficiente de partição, kp de 5,57. Para as separações entre a cef C e os aminoácidos presentes no caldo foi possível verificar as seguintes eficiências de separação: 3,4 (ornitina), 6,9 (lisina) e 2,8 (asparagina). Na etapa final do trabalho foi possível recuperar a cef C da fase PEG, promovendo ainda uma maior purificação com os aminoácidos residuais. Para tal proposta, utilizou-se a técnica cromatográfica de troca iônica, com utilização da resina aniônica Amberlite IRA 400. Estes experimentos foram realizados sob temperaturas de 20, 25 e 30 °C e pH 2,8 e 6,8. A resina Amberlite IRA 400 mostrou afinidade em relação à cef C, e nos experimentos em coluna de leito fixo, foi possível separar a cef C do PEG, do sal de fosfato e dos aminoácidos presentes na fase de topo. Os resultados obtidos permitiram concluir, que o processo proposto mostrou-se viável para a extração e separação da cefamicina C.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2710.pdf: 4294730 bytes, checksum: d0fe5cecb9df30a9763959023ef77038 (MD5) Previous issue date: 2009-09-01 / Universidade Federal de Sao Carlos / The cephamycin C is a natural cephalosporin produced by Streptomyces clavuligerus, of great importance in the pharmaceutical industry; it is a β-lactam antibiotic that acts as an inhibitor of the cellular wall synthesis. Besides some activity against Gram-negative bacteria, the cephamycin C is resistant to the action of β-lactamase enzymes responsible for the resistance to penicillin. The information available in the literature, on the stages of the industrial production process of cephamycin C is scarcely found, studying the production process and the antibiotic separation is essential to provide technology to the production section. The present study aimed to develop alternative protocols to isolate and purify composites produced by Streptomyces clavuligerus DSM 738, such as the cephamycin C and penicillin, which present antibacterial activity. The sequence of purification stages proposed in this work consisted of: 1) Microfiltration of the broth for the separating cells and insoluble solids; 2) Ultrafiltration for the separation of high molecular weight sub products, such as proteins and enzymes; 3) Use of adsorption process with non ionic resin for the broth clarification; and 4) Finally, the hipotese this work, the adsorption process by ionic exchange, for the separation of composites with antibacterial activity, such as cephamycin C and Penicillin N. On the other hand, cephamycin C is not available in the market, being restricted to the industries that possess the production technology. The biological method of choice for the bacteriological activity test was the Escherichia coli ESS bacteria against all β-lactams. RMN-1H analysis showed that the use of the microfiltration and ultrafiltration are essential as first purification stages. The second purification stage with non ionic resin (Amberlite XAD-4) showed to be efficient on retaining pigments, finally, with this clarified broth, it was possible to separate two major and well defined fractions with antibacterial activity, by the use of an anion exchange resin (QXL of Amershan), utilizing NaCl and CH3COONa as mobile phase. Analysis by RMN-1H showed that the first fraction can represent a cephalosporin molecule, such as cephamycin C, among others compounds. / A cefamicina C é uma cefalosporina natural produzida por Streptomyces clavuligerus de grande importância na indústria farmacêutica, esta é um antibiótico beta-lactâmico que atua como um inibidor da síntese da parede celular. Além de possuir atividade contra bactérias Gram-negativas, a cefamicina C é resistente à ação de enzimas beta-lactamases responsáveis pela resistência à ação das penicilinas. Tendo em vista as restritas informações na literatura sobre as etapas do processo industrial de produção da cefamicina C, torna-se indispensável o estudo dos processos de produção e separação deste antibiótico para que seja possível disponibilizar sua tecnologia ao setor produtivo. O presente trabalho buscou desenvolver protocolos alternativos para isolar e purificar compostos que apresentam atividade antibacteriana produzidos por Streptomyces clavuligerus DSM 738 como a cefamicina C e penicilinas. A seqüência de etapas de purificação utilizadas nesta dissertação constou de: 1) Microfiltração do caldo para a separação de células e sólidos insolúveis; 2) Ultrafiltração para a separação de subprodutos de alto peso molecular, como proteínas e enzimas; 3) Utilização de processo de adsorção com resina não iônica para clarificação do caldo e finalmente a hipótese de trabalho desta dissertação foi de aplicar um processo de adsorção por troca iônica para a separação de compostos com atividade antibacteriana, os quais podem ser a Cefamicina C e a Penicilina N. Cabe ressaltar que a cefamicina C não está disponível no mercado, sendo restrita às indústrias que detém a tecnologia de produção. Se utilizou o metodo biologico teste de atividade bacteriológica com a bactéria Escherichia coli ESS comtra beta-lactâmicos totais. Analises realizada por RMN mostram que a utilização da microfiltração e ultrafiltração são fundamentais como etapas iniciais de purificação. A segunda etapa de purificação com resina não iônica (Amberlite XAD-4) mostrou sua eficiência na retenção de pigmentos, e por fim, com este caldo clarificado, foi possível separar duas frações majoritárias e bem definidas com atividade antibacteriana, através da utilização da resina de troca aniônica (QXL da Amershan), utilizando como eluentes NaCl e CH3COONa. As análises realizadas por RMN- 1H mostraram que a primeira fração pode representar a molécula de uma cefalosporina, tal como é a cefamicina C, dentre outros compostos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:08:57Z : No. of bitstreams: 1 cavallieri_ap_me_araiq.pdf: 708556 bytes, checksum: 7e6135c09f6e81026381b8ad167bf086 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / β-lactâmicos são compostos de elevada importância clínica. Streptomyces clavuligerus produz vários destes compostos, como penicilina N (PenN), deacetilcefalosporina C, deacetoxicefalosporina C, cefamicina C (CefC) e ácido clavulânico (AC). Particularmente, CefC é um antibiótico de grande interesse por suas características de resistência a β-lactamases. A biossíntese deste antibiótico envolve uma série complexa de reações enzimáticas, iniciando-se com a etapa limitante de conversão de L-lisina em ácido L-α-aminoadípico (AAA) que, então, condensa-se com cisteína e valina para formar L-α-aminoadipil-L-cisteinil-D-valina (ACV), o precursor dos antibióticos β-lactâmicos. A formulação de meios utilizando-se estratégias racionais tem sido de fundamental importância para incrementar a produção de antibióticos β - lactâmicos em S. clavuligerus. No presente trabalho, visando contornar a etapa de conversão de L-lisina, investigou-se o efeito da adição de AAA e/ou L-lisina no processo de produção de CefC por S. clavuligerus ATCC 27064 em meio de produção complexo solúvel contendo amido e farinha de semente de algodão (ProfloTM) como principais fontes de C e energia e de N, respectivamente. Inicialmente, foram realizadas fermentações adicionando-se ao meio um ou outro aminoácido. Os resultados destes experimentos subsidiaram, então, a seleção de faixas de concentração dos aminoácidos, através de métodos de planejamento experimental, para investigar o efeito combinado destes compostos no processo. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por meio de metodologia de superfície de resposta, relacionando-se concentração inicial e consumo de AAA e L-lisina com a produção de CefC. Nos experimentos com os meios contendo somente L-lisina ou AAA, como também naqueles estabelecidos através de metodologia de planejamento experimental... / β-lactams are compounds of high clinical importance. Streptomyces clavuligerus produces various of these compounds, such as penicillin N (PenN), deacetiylcephalosporin C, deacetoxycephalosporin C, cephamycin C (CefC), and clavulanic acid (AC). Particularly, CefC is an antibiotic of great interest for its characteristics of β-lactamases resistance. The biosynthesis pathway of CefC involves a complex series of enzymatic reactions, starting with the rate-limiting step of the lysine conversion to α-aminoadipic acid (AAA), followed of this compound condensation with cysteine and valine to form L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine (ACV), the precursor of β-lactam antibiotics. In this work, the effect of the addition of AAA and / or lysine on CefC production by S. clavuligerus ATCC 27064 was investigated. It was used a complex medium containing soluble starch and cottonseed flour (ProfloTM) as main sources of C and energy, and N, respectively. Initially, fermentations were carried out by adding to the medium one or other amino acid. The results of these experiments were used to select the concentration ranges of amino acids by using methods of experimental design. A three-level full-factorial design was applied to investigate the combined effects of lysine and AAA concentrations on CefC production. Response surface methodology was used to determine statistically the optimum amino acids concentration values in order to obtain the maximum concentration of antibiotic. Positive effects of these amino acids on the production of antibiotics were observed in the experiments using media containing lysine or AAA, as well in the designed experiments. The effect of adding phosphate ions in the production medium was investigated too. It was found that there was a maximum production with the addition of 15 mM, within the range studied (0 to 25 mM phosphate). To confirm the results, a fermentation run was... (Complete abstract click electronic access below)