La voie des microARNs est un mécanisme post-transcriptionnel de régulation génique qui contrôle divers aspects développementaux et physiologiques chez de nombreux eucaryotes supérieurs. Afin de mieux comprendre les rôles et modes d’actions des microARNs, nous avons entrepris l'exploration des interactions génétiques de cette voie chez le nématode \textit{Caenorhabditis elegans}. Nous nous sommes ainsi concentrés sur les gènes codant pour les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2, qui sont les principaux constituants effecteurs de cette voie. Premièrement, nous avons caractérisé la relation entre ces deux paralogues, en étudiant respectivement leur expression spatio-temporelle, leur association avec des microARNs, ainsi que les phénotypes associés à leur perte de fonction. Nous avons ainsi pu définir des caractéristiques communes et spécifiques pour chacune de ces deux protéines Argonautes et décrire de manière précise leurs rôles essentiels lors du développement embryonnaire. En effet, nous avons démontré que l'absence d'expression zygotique des protéines ALG-1/2 provoque un arrêt du processus morphogénétique lors de l'allongement des embryons et un défaut dans les structures de fixation épidermique-musculaires. Deuxièmement, nous avons realisé un criblage génétique dans le but d'identifier des nouveaux partenaires des protéines Argonautes ALG-1/2. Nous avons découvert le gène codant pour la protéine VPS-52, qui est un composant du complexe GARP (\textit{Golgi Associated Retrograde Protein}). La caractérisation de ce gène nous a permis de démontrer que VPS-52 interagit génétiquement avec le gène \textit{alg-1} et se comporte comme un modulateur positif de l'activité de certains miARNs impliqués dans le développement larvaire. Les mutants de \textit{vps-52} aggravent les défauts des cellules souches épidermales observés dans les mutants de \textit{alg-1} et du microRNA \textit{mir-48}. Ils augment également la létalité du mutant \textit{let-7(n2853)} et ce dépendement de sa cible. Ces augmentations phénotypiques sont liées à une baisse des niveaux des microARNs miR-48, miR-241 et des protéines GW182. Cette étude nous amène donc à proposer que l'activité des microARNs peut être contrôlée en partie par un mécanisme de transport rétrograde dépendant du complexe GARP. / The microRNA pathway is a post-transcriptional gene regulatory system that controls multiple developmental and physiological processes in many eukaryotes. We have undertaken the exploration of the genetic interactions of this pathway in the nematode \textit{Caenorhabditis elegans}, with the goal of unveiling processes controlled by microRNAs and the mechanisms of microRNA action. We focused on the genetic interactions of the \textit{alg-1} and \textit{alg-2} genes, that encode the microRNA-specific Argonaute proteins, key effector constituents of this pathway. In the first place, we characterized the relationship between these two argonaute paralogs, with respect to their spatio-temporal expression, association to microRNAs, and loss-of-function phenotypes. Thus, we defined shared and gene-specific features of these Argonautes and defined in detail their essential role during embryonic development. The absence of zygotic \textit{alg-1} and \textit{alg-2} expression causes arrest during the morphogenetic process of elongation with defects in the epidermal-muscle attachment structures. Addressing another aspect, we sought to elucidate novel genetic interactors of these argonautes using a forward genetics approach. We identified \textit{vps-52}, a component of the GARP (Golgi Associated Retrograde Protein) complex, as a genetic interactor of the \textit{alg-1} gene and established that, through its GARP complex function, it effects a positive modulatory role on miRNA activity. Mutants of \textit{vps-52} exacerbate the seam cell defects in the loss-of-function alleles of \textit{alg-1} and the \textit{let-7} miRNA family member \textit{mir-48} and enhance the lethality of the \textit{let-7(n2853)} hypomorph in a target dependent manner. These phenotypic enhancements related to decreased levels of the \textit{let-7} family microRNAs (miR-48 and miR-241) and the worm GW182 protein. Furthermore, the positive effect of \textit{vps-52} on microRNA activity seems to be conserved in mammalian cells, where VPS52 co-fractionates with miRISC components. Our analyses allow us to propose that VPS-52 as part of the GARP complex participates in membrane-related processes of the miRNA pathway, which facilitate miRNA activity and operate at the effector miRISC level.

OBJECTIFS : Le Bortezomib (Velcade©) est un inhibiteur de protéasome présentement utilisée en chimiothérapie pour soigner les cas de myélomes multiples et de lymphomes. Les tumeurs solides sont souvent résistantes à ce type de traitement. Mon laboratoire d’accueil à récemment déterminé que le traitement de cellules cancéreuses issues de tumeurs solides avec le Bortezomib induit une réponse de stress caractérisée par la phosphorylation du facteur d’initiation à la traduction eIF2α. Cette phosphorylation est médiée par une protéine kinase, nommée Heme Regulated Inhibitor (HRI). La phosphorylation du facteur eIF2α par HRI occasionne la formation de granules de stress (GS); corps cytoplasmiques renfermant les protéines ribosomales, les ARNms, et des molécules de signalisation. La formation des GS est associée à une résistance à la mort cellulaire induite par différents types de stress, tels qu’un choc oxydatif, l’hypoxie ou les radiations. Nous avons ainsi impliqué la formation des GS dans la résistance des cellules cancéreuses au Bortezomib. En effet, nous avons démontré que la suppression des GS en interférant avec l’expression d’HRI sensibilisait les cellules cancéreuses au traitement de Bortezomib. Ce résultat dénote aussi un nouveau rôle potentiel de HRI dans la chimiorésistance. Mon projet consistait donc à tester cette hypothése in vivo en utilisant des cellules cancéreuses déplétées de manière stable en HRI. MÉTHODES : D’abord, en surexprimant de manière transitoire la protéine HRI grâce à un plasmide GFP-HRI, nous avons pu évaluer l’effet de sa surexpression sur la viabilité cellulaire. D’autre part, en créant des lignées stables exprimant des Small hairpin RNA (shRNA) dirigés contre l’ARNm HRI, nous avons pu étudier l’effet de l’absence de cette kinase sur la physiologie cellulaire et ce, en condition normale et en condition de traitement au Bortezomib. RÉSULTATS : La surexpression de la protéine HRI cause l’induction de granules de stress dépendant de la phosphorylation du facteur eIF2α. Ce résultat valide nos résultats de déplétion démontrant un rôle majeur de HRI dans la formation des GS en condition de Bortezomib via la phosphorylation de son substrat eIF2. De façon surprenante, nous avons également constaté une morphologie cellulaire ainsi qu’un taux de croissance différents en condition non traitée, comparativement aux contrôles shRNA non effecteurs. Ceci suggère un rôle nouveau de HRI dans la croissance cellulaire, indépendamment de la phosphorylation d’eIF2a. L’injection sur la membrane chorioallantoique d’un fœtus de poulet (in ovo) de cellules cancéreuses déplétées en HRI occasionne une diminution de développement tumoral. Inversement, on observe la formation d’une masse apparente pour les contrôles non effecteurs et ce, toujours en condition non traitée. Ceci suggère donc un rôle de HRI dans la croissance tumorale. CONCLUSION : La kinase HRI est impliquée dans la résistance des cellules cancéreuses à la mort cellulaire engendrée par le Bortezomib, mais semble également jouer un rôle physiologique dans la croissance tumorale.

La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale est un évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la dissémination métastatique. Nous avons déjà démontré que la phosphorylation de la Ser283 de la tropomyosine-1 (Tm1) par la DAPK1, en aval de la voie ERK1/2, est nécessaire à la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales exposées aux stress oxydant. La perméabilité endothéliale et la migration transendothéliale de carcinomes du côlon ont été mesurées par des essais de perméabilité et de migration en chambre de Boyden. L’usage d’ARNi et des formes sauvages et mutantes de la Tm1 ont permis de démontrer que la phosphorylation de la Tm1 est un évènement clé nécessaire dans les mécanismes de protection contre la dysfonction endothéliale lorsque l’endothélium est soumis à un stress oxydant. / Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension, and facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis. We already showed that phosphorylation of tropomyosin-1 (Tm1) at Ser283 by DAPK1, downstream of the ERK1/2 pathway, is necessary to stress fibers formation in endothelial cells in response to oxidative stress. Endothelial permeability and transendothelial migration of colon cancer cells were evaluated by Boyden chamber assays. Use of siRNA and wild-type and mutated forms of Tm1 provide evidence indicating that phosphorylation of Tm1 is a key event required inside protection mechanism against endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress injury.

Chez les mammifères, le passage d’une génération à une autre nécessite la reprogrammation du génome. Cette reprogrammation nécessite la déméthylation de l’ADN parternel et maternel ainsi que celle des lysines des histones suite à la fécondation. Des familles d’enzymes ont récemment été associées à ces processus : les déaminases, notamment Aicda (activation-induced cytosine deaminase), et les Tet (Ten-eleven translocation) désoxygénase, Tet1, Tet2 et Tet3. Plusieurs déméthylases des lysines des histones (KDM) ont été identifiées au cours des dernières années mais très peu d’informations sont disponibles à leur sujet, particulièrement en ce qui a trait à l’embryon bovin. Notre étude s’est attardée à dresser un profil d’expression spatiotemporel de ces familles d’enzymes lors des différents stades embryonnaires précoces chez la vache. Nous suggérons que Tet3 participe activement à la déméthylation de l’ADN, possiblement assisté par Tet2, mais sans Tet1 ni Aicda. Nous montrons également que KDM3A, KDM4A, KDM4C et KDM5B sont présents à des stades et à des endroits précis de l’embryon suggérant ainsi un rôle dans certains processus clés du développement embryonnaire. Ces informations ouvrent la voie à de nouvelles recherches afin de comprendre les modifications de l’épigénome et de réduire les anomalies épigénétiques rencontrées chez les animaux issus de certains protocoles de reproduction assistée. / In mammals, the transition from one generation to the next requires genomic reprogramming. Such epigenetic change is mediated by paternal and maternal DNA demethylation as well as histone lysines demethylation after fertilization, which is a poorly understood process. Some family of enzymes have recently been associated to those process: the deaminases, like Aicda (activation-induced cytosine deaminase), and Tet (Ten-eleven translocation) dioxygenases, Tet1, Tet2 and Tet3. Many lysine specific histone demethylases (KDM) have been identified in the past few years but little is known about their roles in mammalian embryo. The objective of this study was to develop of a spatiotemporal expression profile of those proteins at different preimplantation stage of bovine embryo. We suggest an active participation of Tet3 in DNA methylation, possibly supported by Tet2 but without Tet1 or Aicda. We also demonstrate the presence and specific localization of KDM3A, KDM4A, KDM4C and KDM5B which may suggest a role during the different embryonic stages. This information opens up the possibilities for further research in order to reduce epigenetic abnormalities associated to assisted reproduction technologies.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription essentiels durant l’embryogénèse. Les études antérieures menées chez les femelles Hoxa5-/- ont démontré une désorganisation de la morphologie de leurs glandes mammaires se reflétant par une incapacité à allaiter leur progéniture. Ce travail consistait à déterminer le rôle du gène Hoxa5 dans la composition du stroma mammaire de femelles à quatre et dix mois et au 12.5ème jour de gestation. Pour cela cinq gènes ont été analysés, soient le collagène, la fibronectine, la décorine, le lumican et UCP-1 (Uncoupling protein 1). Les transcrits et protéines de ces gènes étaient modulés dans les glandes mammaires Hoxa5-/-. Il a été démontré que la fonction du gène Hoxa5 est nécessaire à quatre et à dix mois au cours du cycle œstral pour l’établissement et le maintien de l’intégrité du stroma mammaire, et au 12.5ème jour de gestation pour la différenciation terminale des structures épithéliales. / Hox genes encode transcriptional factors essential for embryogenesis. Previous studies on Hoxa5 mutant female mice have demonstrated a disorganization of the mammary gland morphology causing incapacity to feed the pups. This study consists to determine the implication of Hoxa5 gene in mammary stroma composition by using four and ten month old female mice as well as 12.5 days pregnant mice. Our investigation consists in analyzing the expression of five proteins: collagen, fibronectin, decorin, lumican, and UCP-1 (Uncoupling protein-1). Both transcript and protein genes’ levels were modulated in mammary gland of Hoxa5-/- mice. I have shown that Hoxa5 gene expression in mammary gland is necessary to establish and maintain stroma integrity during oestrus cycle in four and ten month old mice and for the terminal differentiation of mammary gland epithelial structures at 12.5 days of gestation.

L’hormone peptidique Insulin-like 3 (INSL3) est produite par les cellules de Leydig du testicule. Elle est essentielle à la première phase de la descente testiculaire lors du développement fœtal. Les divers modèles animaux invalidés en Insl3 présentent une descente testiculaire incomplète chez les mâles, la cryptorchidie. Il s’agit du trouble développemental le plus courant chez les garçons nouveau nés des pays industrialisés et son incidence s’est accrue au cours des dernières décennies. Plusieurs études animales indiquent que les estrogènes répriment l’expression d’Insl3. La répression de l’expression d’Insl3 implique probablement le récepteur alpha des estrogènes (ERα) et/ou le récepteur nucléaire Nr0b2, tous deux présents dans les cellules de Leydig. En vue de vérifier la répression d’Insl3 par les estrogènes et d’impliquer ERα et/ou Nr0b2, j’ai analysé l’activité promotrice d’Insl3 murin par transfection et j’ai étudié les variations d’expression de son ARNm en PCR quantitatif. J’ai pu vérifier la répression d’Insl3 par l’estradiol et Nr0b2 ne parait pas être impliqué. L’implication d’ERα semble probable, mais les résultats de techniques différentes sont contradictoires.

Les kératinocytes de l’épiderme interagissent fortement avec les fibroblastes du derme sous-jacent. Notre équipe a précédemment démontré que les cellules de l’épiderme des cicatrices hypertrophiques jouent un rôle dans le développement de la fibrose de cette pathologie. Une étude comparative des protéines sécrétées par les kératinocytes de peau et des kératinocytes pathologiques a été réalisée. Les analyses ont été effectuées par la technique d’électrophorèse en deux dimensions (Gel 2D-DIGE: Two-Dimensional Difference gel electrophoresis). La première dimension permet la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique et la deuxième dimension permet une séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaires La comparaison des gels effectués avec des surnageants de 7 populations de kératinocytes de peau et 7 populations de kératinocytes provenant de cicatrices hypertrophiques a permis de détecter des différences entre les deux types cellulaires. Seize points ont été séquencés par spectrométrie de masse permettant de déterminer la présence de 12 protéines potentiellement sécrétées différemment selon l’origine des kératinocytes. La concentration de deux de ces protéines (MMP-1 et SPINK5) a ensuite été mesurée par des méthodes quantitatives afin de valider les résultats obtenus par les gels 2D-DIGE. Nos résultats montrent que les kératinocytes provenant de cicatrices hypertrophiques sécrètent une moins grande quantité de MMP (Matrix MetalloProteinase) que les kératinocytes provenant de peau saine, pouvant ainsi expliquer l’augmentation de la fibrose lors du développement de cette pathologie.

La production de microparticules pendant le processus de cicatrisation par les myofibroblastes provenant de plaies est une nouvelle voie de recherche dans le domaine de la communication intercellulaire. À notre connaissance, l’étude de microparticules produites par les cellules de tissus est une première. Les microparticules sont perçues comme étant des cargos transporteurs de signaux. Afin de déterminer le type d’information que les microparticules produites par les myofibroblastes cicatriciels transportent, leur contenu protéique a été caractérisé. Trois techniques d’extraction des protéines couplées à l’analyse par spectrométrie de masse ont été utilisées : le 2D-DIGE, la méthode du Disc SDS-PAGE améliorée ainsi qu’un lysat total précipité à l’acétone. La liste de protéines obtenue a permis d’identifier l’implication potentielle des microparticules dans plusieurs voies signalétiques. La caractérisation du protéome des microparticules produites par les myofibroblastes cicatriciels permettra une meilleure compréhension de la communication intercellulaire qui se produit pendant le processus de cicatrisation. / Production of microparticles by myofibroblasts during wound healing process is a new finding in the field of cellular communication. To our knowledge, study of microparticles secreted by cell tissue is a premiere. Microparticles are thought to be carriers for signaling. To determine information carried by wound healing myofibroblast microparticles, their protein content has been characterized. Three means of protein extraction followed by mass spectrometry have been used : 2D-DIGE, improved Disc SDS-PAGE and acetone precipitation. The obtained list of proteins allows the identification of potential implication of microparticles in several pathways. Wound healing myofibroblast microparticles proteome characterization will help to better understand intercellular communication during wound healing.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X. Elle est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles, mais son succès dépend du contrôle du rejet des myoblastes greffés et des fibres musculaires hybrides. À présent, le contrôle du rejet est obtenu par l’administration d’immunosuppresseurs puissants. Notre objectif à long terme est de développer un protocole de tolérance immunologique qui permettrait de prévenir le rejet, sans recours à une immunosuppression soutenue. La première étape du protocole de tolérance immunologique que nous souhaitons développer est d’induire la formation de lymphocytes T régulateurs en utilisant le facteur de transcription Foxp3. Nos travaux nous ont permis de produire, dans des bactéries E. coli, la protéine de fusion Tat-Foxp3. Par des essais in vitro nous avons démontré l’augmentation de l’expression du récepteur CD25 sur les lymphocytes T CD4+ naïfs après transduction de la protéine Tat-Foxp3. Cela suggère que la protéine Tat-Foxp3 pourrait convertir les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs. D’autres travaux seront nécessaires pour confirmer que ces cellules exprimant le CD25 sont vraiment des T régulateurs. / The Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease. This disease is inherited as an X-linked recessive trait. It is caused by the absence of dystrophin in muscle fibers. Cell therapy is the potential treatment but, its success depends on the control of the rejection of the transplanted myoblasts and of the hybrid fibers that they formed. At present, the control of the graft rejection is achieved by administration of powerful immunosuppressive drug. Our long-term aim is to develop a protocol for immune tolerance that would prevent the graft rejection without sustained immunosuppression. The first step of this tolerance protocol that we want to develop is to induce the formation of regulatory T cells using the transcription factor Foxp3. In this study we generated, in bacteria E. coli, a fusion protein Tat-Foxp3. By in vitro assays, we demonstrated that Tat-Foxp3 protein up-regulated the expression of CD25 in naïve CD4+ T cells. Additional experiments will be required to confirm that these CD25 expressing cells are Treg.