La maladie à coronavirus (COVID-19) est une infection virale hautement contagieuse causée par le virus SRAS-CoV-2. La maladie s’est rapidement propagée entrainant une épidémie mondiale, causant la mort des personnes à risque. De nombreuses mesures sanitaires ont été prises durant ces deux dernières années, cependant la maladie n’est pas encore éradiquée. Considérant l’importance du système immunitaire dans le contrôle des maladies infectieuses et dans l’induction d’une mémoire immunitaire de longue durée, le SRAS-CoV-2 pourrait être une cible du système immunitaire, en particulier du système adaptatif représenté par les lymphocytes B et T. La réponse humorale induite chez les personnes convalescentes est largement perçue comme étant efficace pour combattre le virus. Par conséquent, toutes les plateformes de vaccination actuelles se sont basées sur la réponse humorale induite, particulièrement par la protéine SPIKE du virus. Compte tenu de la variabilité des réponses humorales ainsi que leur déclin rapide observé chez certains patients, et l’émergence de variants, il est nécessaire d’inclure d’autres stratégies permettant de renforcer la réponse immunitaire. Nous avons émis l’hypothèse qu’une réponse cellulaire pouvait être induite par les lymphocytes T contre les différentes protéines virales du SRAS-CoV-2. Dans cette étude nous avons détecté la réactivité des lymphocytes T contre les protéines virales (SPIKE, membrane, nucléocapside) par ELISPOT chez les patients convalescents. Nous avons ensuite identifié plus précisément les séquences riches en épitopes au niveau de la protéine membranaire et de la nucléocapside en préparant des délétants successifs (approche « mRNA PCR-based epitope chase technique” ou mPec). La validation de ces séquences a été confirmée par l’utilisation de banques de peptides dans des zones définies, se chevauchant de 12 acides aminés. En vue d’inclure ces régions dans une stratégie vaccinale future, une protéine de fusion MN contenant les séquences riches en épitopes a été créée et la réactivité des lymphocytes T contre la protéine MN a été évaluée de nouveau par ELISPOT. Nos données démontrent une réponse T dirigée principalement contre la nucléocapside et la protéine membranaire. Trois zones immunogènes sont identifiées au niveau de la nucléocapside et une zone au niveau de la membrane. La réactivité observée contre la protéine de fusion MN souligne le potentiel pouvoir immunogène des protéines (membrane et nucléocapside) et l’importance d’inclure ces protéines dans une stratégie vaccinale future afin de solliciter une réponse immunitaire cellulaire protectrice. / Coronavirus disease (COVID-19) is a highly contagious viral infection caused by the SARS-CoV-2 virus. The disease has spread rapidly resulting in a worldwide epidemic, causing death in those at risk. Numerous health measures have been taken over the past two years, but the disease has not yet been eradicated. Considering the importance of the immune system in the control of infectious diseases and in the induction of a long-lasting immune memory, SARS-CoV-2 could be a target of the immune system, in particular of the adaptive system represented by B and T lymphocytes. The humoral response induced in convalescent individuals is widely used as an effective therapy to combat the virus. Therefore, all current vaccination platforms have relied on the humoral response induced particularly by the virus' SPIKE protein. Given the variability of humoral responses and their rapid decline in some patients, and the emergence of variants, it is necessary to include other strategies to enhance the immune response. We hypothesized that a cellular response could be induced by T cells against the different viral proteins of SARS-CoV-2. In this study, we detected the reactivity of T cells against viral proteins (SPIKE, membrane, nucleocapsid) by ELISPOT in convalescent patients. We then identified more precisely the immunogenic sequences at the level of the membrane protein and the nucleocapsid by successive deletants using the mRNA PCR-based epitope chase technique (mPec). The validation of these sequences was confirmed by the use of small peptide libraries (overlapping by 12 amino acids), covering defined sequences rich in epitopes. In order to include these regions in a future vaccine strategy, a MN fusion protein containing the selected sequences was created and T cell reactivity against the MN protein was further confirmed by ELISPOT. Our data show a T-cell response primarily against the nucleocapsid and membrane protein. Three immunogenic zones were identified at the nucleocapsid level and one zone at the membrane level. The reactivity observed against the MN fusion protein cassette rich in epitopes, highlights the potential immunogenicity of the proteins (membrane and nucleocapsid) and the importance of including these proteins in a future vaccine strategy.

No description available.

Combinatorial techniques have changed the paradigm of materials research by allowing a faster data acquisition in complex problems with multidimensional parameter space. The focus of this thesis is to demonstrate biomaterials design and characterization via preparation of two dimensional combinatorial libraries with chemically-distinct structured patterns. These are prepared from blends of biodegradable polymers using thickness and temperature gradient techniques. The desired pattern in the library is chemically-distinct cell adhesive versus non-adhesive micro domains that improve library performance compared to previous implementations that had modest chemical differences. Improving adhesive contrast should minimize the competing effects of chemistry versus physical structure. To accomplish this, a method of blending and crosslinking cell adhesive poly(季aprolactone) (PCL) with cell non-adhesive poly(ethylene glycol) (PEG) was developed. We examine the interaction between MC3T3-E1 osteoblast cells and PCL-PEG libraries of thousands of distinct chemistries, microstructures, and roughnesses. These results show that cells grown on such patterned biomaterial are sensitive to the physical distribution and phases of the PCL and PEG domains. We conclude that the cells adhered and spread on PCL regions mixed with PEG-crosslinked non-crystalline phases. Tentatively, we attribute this behavior to enhanced physical, as well as chemical, contrast between crystalline PCL and non-crystalline PEG.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-06T13:04:43Z No. of bitstreams: 1 arquivoptotal.pdf: 2877352 bytes, checksum: 9e31e912377c0a68df303843bc0368bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T13:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivoptotal.pdf: 2877352 bytes, checksum: 9e31e912377c0a68df303843bc0368bc (MD5) Previous issue date: 2016-08-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Inflammatory Bowel Disease (IBD) is characterized as an uncontrolled chronic inflammation of the intestinal mucosa and mainly includes two pathologies: Crohn's disease and ulcerative colitis. Accordingly, the local immune system remains compromised and the intestine intensely inflamed, due to an inability of decreasing inflammatory responses. Complementary and alternative medicines have been of great interest for the treatment of IBD, with the aim to improve the side effects of commonly used drugs. Goat whey present oligosaccharides and conjugated linoleic acid with different functional properties, but also an effect on intestinal incipient modulation. This thesis was divided into two studies: the first being goat whey ability in preventing intestinal inflammation in an inflammation model induced by acetic acid in rats, evaluated by comparing it with a standard sulfasalazine medicine used in the treatment of DII; in the second study, the anti-inflammatory effect of the whey colitis model induced by 2,4-dinitrobenzenesulfonic acid in mice. In the first, the pre-treatment with goat whey (1, 2 and 4 g. Kg-1) and sulfasalazine (250 mg. Kg-1) improved the inflammatory markers (myeloperoxidase, leukotriene B4 and pro-inflammatory cytokines) and oxidative stress (total content of glutathione and malondialdehyde) in colonic tissue of rats. Histological and immunohistochemical evaluation of colonic tissue showed cytoarchitecture preservation and reduction in COX-2 expression, respectively, as well as iNOS and MMP-9 in conjunction with an increase in SOCs-1 expression. The results suggest that goat whey exerted a preventive effect against intestinal damage induced by acetic acid, showing similar efficacy to sulfasalazine, and thus is a potential treatment for human inflammatory bowel disease. In the second model, we used the best dose of the first to conduct different analyses. In the second model with a different inducing agent of IBD was used to dose goat whey that Showed better results in improving of intestinal inflammation the previous study. This study, there was also an improvement of intestinal damage in the group of animals, confirmed by evaluating colonic inflammation and colonic gene expression of pro-inflammatory markers IL-6, IL-1β, IL-17,TNF-α, iNOS, ICAM- 1, MMP-9, regulators of intestinal epithelial integrity (MUC-2, MUC-3, occludin and ZO-1) and supressor of cytokine signaling (SOCS-1). The anti-inflammatory properties of the goat whey were demonstrated by an in vitro study on murine macrofhages line Raw 264 and CMT-93 cells derived from murine rectum carcinoma which promoted a significant reduction in nitric oxide production and IL-6. Thus, goat whey shown as an innovative product in the prevention and control of intestinal inflammation in murine models. / A Doença Inflamatória Intestinal (DII), caracterizada por apresentar uma inflamação crônica não controlada na mucosa intestinal, engloba, principalmente, duas patologias: a Colite Ulcerativa e a Doença de Crohn. Nestas, o sistema imunológico local permanece cronicamente ativado e o intestino intensamente inflamado, devido a uma incapacidade do organismo para a diminuição das respostas inflamatórias. Terapias alternativas e complementares tem sido de grande interesse para o tratamento das DII, com o objetivo de melhorar os efeitos secundários dos fármacos comumente utilizados. O soro de leite caprino apresenta na sua composição oligossacarídeos e ácido linoleico conjugado com propriedades funcionais, mas ainda insipiente como efeito na modulação intestinal. A presente tese foi dividida em dois estudos: no primeiro, foi avaliada a capacidade do soro de leite de cabra em prevenir a inflamação intestinal no modelo de inflamação induzida por ácido acético em ratos, comparando com um fármaco padrão, a sulfassalazina utilizada no tratamento da DII; no segundo, foi estudado o efeito anti-inflamatório do soro de leite no modelo de colite induzido por ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico em camundongos. O pré-tratamento com soro de leite caprino (1, 2 e 4 g. Kg-1) e sulfassalazina (250 mg. Kg-1) melhorou os marcadores inflamatórios (mieloperoxidase, leucotrieno B4 e citocinas pró-inflamatórias) e de estresse oxidativo (conteúdo total de glutationa e malondialdeido) no tecido colônico dos animais. A avaliação histológica e imunohistoquímica do tecido colônico revelaram, respectivamente, uma preservação da citoarquitetura e redução na expressão de COX-2, iNOS e MMP-9, em conjunto com um aumento da expressão de SOCs-1. Os resultados sugerem que o soro caprino exerceu um efeito preventivo contra o dano intestinal induzida por ácido acético, mostrando uma eficácia semelhante à mostrada por sulfassalazina, sendo, portanto, um potencial tratamento para a doença inflamatória intestinal humana. No segundo modelo, com diferente agente indutor da DII, utilizou-se a dose de soro de leite caprino que mostrou melhor resultado na melhora da inflamação do estudo anterior. Neste estudo, também houve uma melhora do dano intestinal no grupo dos animais, confirmado pela avaliação do processo inflamatório colônico, e expressão gênica do cólon dos marcadores pró-inflamatórios IL-6, IL-1β, IL-17, TNF-α, iNOS, ICAM- 1, MMP-9, reguladores da integridade intestinal epitelial (MUC-2 e MUC-3, ocludina e ZO-1) e supressor de sinalização de citocinas (SOCS-1). As propriedades anti-inflamatórias do soro foram evidenciadas no estudo in vitro em células Raw 264 de macrófagos de murinos e CMT-93 derivada de células de carcinoma retal de murinos, em que promoveu uma redução significativa da produção de óxido nítrico e IL-6. Dessa forma, o soro de leite caprino, mostra-se como um produto inovador na prevenção e controle inflamação intestinal em modelos murinos.

Les pili de type IV (PT4), certainement les organelles les plus répandues des bactéries à Gram-négatif, sont des machineries à multiples fonctions qui jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de nombreux pathogènes humains, notamment notre modèle Neisseria meningitidis. L’assemblage des PT4 nécessite une machinerie complexe incluant au moins vingt protéines localisées dans la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. Certaines de ces protéines ne sont pas nécessaires pour la biosynthèse des PT4, mais supportent les fonctions qui leur sont associées. Ces protéines, appelées pilines mineures, sont au nombre de trois. Par l’analyse phénotypique des mutants dans les gènes codant pour les pilines mineures, le rôle de chacune a pu être déterminée. Ainsi la piline mineure ComP est nécessaire pour la compétence pour la transformation d’ADN, PilV est requise pour la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte et PilX est essentielle pour l’adhésion des bactéries sur les cellules épithéliales et endothéliales, la formation d’agrégats bactériens et la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte. De nombreuses similarités avec la piline majoritaire laissent penser que les pilines mineures s’insèrent dans la fibre des PT4 pour exercer leurs fonctions, bien que ceci n’a jamais été démontré. Si on connait bien les fonctions des pilines mineures, leur mode d’action n’est toujours pas compris. L’objectif global de ce travail de thèse a été de comprendre comment une fibre protéique peut assurer une diversité de fonctions aussi importante. Pour y parvenir, l’étude du mode d’action des pilines mineures a été entreprise. Contrairement à ce qui prévalait dans le modèle dominant, les pilines mineures PilV et PilX exercent leur fonction à partir de l’espace périplasmique pour moduler la quantité de pili exprimés en surface. En effet, les mutants pilV et pilX présentent respectivement des défauts de piliation de l’ordre de 39% et de 63% par rapport à la souche sauvage. Ces défauts expliquent cependant les phénotypes des mutants. En effet, l’ensemble des fonctions dépendantes des PT4 nécessite une forte quantité de PT4, soit au moins 40% pour l’agrégation et l’adhésion et 70% pour le déclenchement de la réponse cellulaire. Ces résultats révèlent que les pilines mineures sont impliquées dans la biogenèse des PT4 plutôt que dans le support biochimique direct de leurs propriétés. Le défaut de piliation de ces mutants est restauré par l’absence de rétraction, indiquant que les pilines mineures PilV et PilX jouent un rôle dans la stabilité des PT4. Nous avons également montré que la piline mineure ComP est nécessaire pour la piliation et qu’elle présente une fonction redondante avec la piline mineure PilV. Afin de comprendre comment les pilines mineures PilV et PilX exercent leur rôle sur la quantité de pili exprimés en surface, nous avons réalisé une étude structure/fonction de ces deux protéines. Nous avons observé une absence de piliation, en bloquant les pilines PilV et PilX dans la membrane interne, indiquant une interaction directe avec la machinerie des PT4 probablement via la piline majeure PilE. Nous avons également montré qu’il existe une interaction entre les pilines mineures et PilE au niveau de la membrane interne et en amont de l’assemblage des pili. Ces résultats, obtenus par une technique de pontage disulfure, ont cependant besoin d’être confirmés par des contrôles supplémentaires. Par une stratégie de mutagenèse, nous avons enfin mis en évidence que la région D de PilV et les boucles α/β et β2/β3 de PilX sont nécessaires à leur fonctionnement. Ces travaux ont permis de montrer que la quantité de pili exprimés par la bactérie est un facteur déterminant pour définir les propriétés des PT4. Les pilines mineures agissent au niveau du périplasme pour promouvoir la biosynthèse des pili, ce qui met en avant le rôle direct de la piline majeure PilE dans les fonctions associées aux PT4. / Type IV Pili (TFP) are widespread filamentous organelles extending from the surface of many Gram-negative bacteria that mediate multiple functions and play a key role in the pathogenesis of several important human pathogens, including our model, Neisseria meningitidis. The assembly of TFP requires a complex machinery composed by at least twenty proteins that are localized in the inner membrane, the outer membrane and the periplasm. Three of these proteins, called minor pilins, are not required for the biosynthesis of the TFP, but support their functions. Based on the phenotypes associated with the mutants, their role on TFP functions has been determined. The minor pilin Comp is required for natural competence for DNA transformation, PilV is required for the deformation of the host cell plasma membrane and PilX is essential for the adhesion of bacteria to epithelial and endothelial cells, the bacterial aggregation and the deformation of the host cell plasma membrane. Many similarities with the major pilin PilE suggests that minor pilin are inserted into the fiber of TFP to exert their functions, although it has never been demonstrated. How these proteins carry out their functions mechanistically is not elucidated. The general objective of this thesis was to understand how a single fiber can provide such a variety of functions. To achieve this, the study of the mode of action of minor pilins was undertaken. Contrarily to what has been previously proposed, the PilV and PilX minor pilins seem to exert their functions from the periplasmic space to modulate the amount of surface exposed pili. Indeed, pilV and pilX strains show piliation defects of 39 % and 63 % respectively compared to the wild type. Besides, we have shown that TFP functions require a large amount of TFP, at least 40 % for the aggregation and adhesion and 70% to induce the reorganization of the plasma membrane. Thus these modest decreases in the amount of pili explain the phenotypes of these mutants. These results indicate that the minor pilins are involved in the biogenesis of TFP rather than in the direct support of their biochemical properties. Moreover, the piliation defect of these mutants is restored in the absence of retraction, indicating that the PilV and PilX minor pilins play a role in the stability of TFP. To understand how PilV and PilX minor pilins modulate surface exposed pili level, we performed a structure/ function analysis of these two proteins. Blocking the PilV and PilX minor pilins in the inner membrane abolishes piliation, indicating a direct interaction with the machinery of TFP, probably via the major pilin PilE. We have also shown that an interaction between the minor pilins and the major pilin occurs in the inner membrane and upstream of the pilus assembly. However, these results, obtained by biochemical techniques, need to be confirmed by additional controls. By a mutagenesis strategy, we finally demonstrated that the D region of PilV and the α/β and β2/β3 loops of PilX are necessary for their functions. This study has shown that a relatively modest decrease in the amount of pili displayed on the bacterial surface leads to a strong effect on the functions carried by TFP. Minor pilins act in the periplasm to promote the biosynthesis of pili, which highlights the direct role of the major pilin in the TFP-dependent functions.

No description available.

En période néonatale, la muqueuse intestinale est immature et particulièrement perméable, notamment aux facteurs environnementaux comme les toxiques, les infections mais aussi les événements stressants. De la bonne maturation de la barrière intestinale va dépendre la mise en place de l'homéostasie intestinale et donc la tolérance vis-à-vis des antigènes luminaux. La survenu d’évènements stressants durant la petite enfance est associée au déclenchement et/ou l’entretien de pathologies gastro-intestinales fonctionnelles comme le Syndrome de l’Intestin Irritable (SII) mais aussi organiques comme les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI). De plus, ces pathologies malgré leurs différences dans la sévérité et les signes cliniques, partagent un certain nombre de caractéristiques physiopathologiques communes, comme la rupture de l’intégrité de la barrière intestinale associée à une rupture de tolérance vis-à-vis des antigènes luminaux et plus particulièrement contre le microbiote intestinal. L’objectif de ce travail a été d’évaluer les effets d’un Stress de Séparation Maternelle (SSM) sur l’homéostasie intestinale et la réponse immunitaire vis-à-vis du microbiote commensal chez la souris jeune adulte. Nos résultats ont mis en évidence un dimorphisme sexuel dans ce modèle. Chez les souris mâles jeunes adultes, le SSM diminue les fonctions de la barrière intestinale associé à une altération de la réponse humorale et cellulaire au niveau systémique vis-à-vis du microbiote commensal, ainsi qu’à un défaut des cellules présentatrices d’antigènes, conduisant à une inflammation de bas grade malgré un profil proinflammatoire des lymphocytes T. Chez les souris femelles jeunes adultes, le SSM altère la fonctionnalité des cellules de Paneth associée à surpopulation bactérienne intestinale, responsable de la sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale et une réponse humorale systémique dirigée contre le microbiote commensal. Nous avons mis en évidence une empreinte du SSM chez le jeune adulte, capable d'induire des modifications profondes de l’homéostasie intestinale ainsi que de la réponse immunitaire systémique contre le microbiote intestinal. Le SSM altère l'homéostasie intestinale et reproduit des caractéristiques communes aux pathologies digestives à savoir une rupture de barrière associée à une réponse immunitaire contre le microbiote sans symptômes majeurs. Ce travail a permis d'identifier la survenue d'événements stressants pendant la petite enfance comme un facteur environnemental important capable d'altérer l'homéostasie intestinale chez des individus sains et qui pourrait contribuer au déclenchement de pathologies intestinales chez des individus génétiquement prédisposés. / Perinatal period is characterized by an immature intestinal barrier particularly permeable to luminal antigens and as such highly vulnerable to environmental factors like toxins, infections or stressful events. The appropriate maturation of intestinal barrier leads to intestinal homeostasis and tolerance toward luminal contents. Early life stressful events are associated with the development and/or maintenance of functional gastrointestinal disorders like Irritable Bowel Syndrome (IBS) or organic one like Inflammatory Bowel Diseases (IBD). These pathologies are highly different in term of etiology and clinical severity however they share common features like alteration in intestinal barrier associated with an abnormal immune response toward luminal contents especially commensal microbiota. Our aim was to evaluate the consequences of maternal separation (MS) on intestinal homeostasis, host-microbiota relationship and the humoral and cellular response at adulthood. Due to sexual dimorphism in this model, the results are presented separately for male and female. In young adult male mice, MS decreases intestinal barrier functions associated with an alteration of systemic humoral and cellular response toward commensal microbiota. Moreover, a defect of antigen presenting cells in spleen leads to systemic low grade inflammation despite a pro-inflammatory profile of T cell. In young adult female mice, MS alters the functionality of Paneth cells associated with an intestinal bacterial overgrowth, leading to visceral sensitivity and systemic humoral response toward commensal microbiota. We highlighted that MS has long lasting adverse effects on intestinal homeostasis and systemic immune response toward commensal microbiota in young adult. MS impairs intestinal homeostasis in healthy individuals and might contribute to trigger intestinal pathologies in susceptible persons.

No description available.