Le transfert de prions des aliments dans la muqueuse et leur passage de la muqueuse vers le système nerveux constituent des chaînons manquants dans la compréhension de la pathogenèse des ESST. Ces événements cruciaux se déroulent à des stades très précoces de linfection et restent sans signes cliniques. Lexplication de ces phénomènes permettrait de mieux appréhender les mécanismes infectieux et de mettre en place des traitements. élucidation Ce travail repose sur des observations largement étayées : - lors dune infection orale par des prions, les plaques de Peyer, spécialisées dans léchantillonnage et le traitement déléments transitant dans liléon, sont des zones privilégiées de passage dagents infectieux de la lumière vers la muqueuse intestinale. - lagent responsable des maladies à prions est retenu et répliqué par des cellules du système immunitaire comme les cellules folliculaires dendritiques. Laccumulation de prions est en effet mise en évidence dans les organes lymphoïdes secondaires dorganismes infectés. - en cas dinfection par voie orale par des prions, le processus de neuroinvasion débute dans le système nerveux périphérique et se propage vers le système nerveux central par les fibres sympathiques et parasympathiques. Ces différentes observations sont à la base de notre hypothèse de travail : les cellules dendritiques capteraient les prions au niveau de la lumière des plaques de Peyer, migreraient dans les tissus lymphoïdes drainants et les transmettraient aux cellules folliculaires dendritiques et/ou aux fibres nerveuses périphériques. En véhiculant les prions, elles seraient à la base à la fois de la lymphoinvasion et de la neuroinvasion. Pour vérifier notre hypothèse nous avons investigué plusieurs pistes : létude comparative du phénotype et la localisation des cellules dendritiques des plaques de Peyer chez les souris saines et les souris infectées par les prions. la localisation des zones de contact entre cellules dendritiques et des fibres nerveuses au sein des organes lymphoïdes secondaires de souris infectées versus saines. lélaboration et létude dun modèle in vitro murin de transmission de prions des cellules dendritiques aux cellules nerveuses périphériques. Le phénotype et la localisation des cellules dendritiques des plaques de Peyer durant la phase préclinique dinduction orale dune ESST ont été analysés selon plusieurs paramètres. Les résultats seront décrits et discutés dans le chapitre 1. Lépithélium associé aux follicules lymphoïdes des plaques de Peyer est une zone de transcytose déléments qui transitent dans le tractus intestinal. On y distingue des entérocytes, des cellules M et des cellules dendritiques. Une attention particulière a été portée aux cellules dendritiques localisées dans lépithélium à différents temps durant une infection par des prions. Une analyse quantitative et phénotypique de cette population particulière de cellules a été réalisée dans la perspective de classer cette population parmi les sous-populations de cellules dendritiques connues. Lexpression membranaire de la protéine prion cellulaire et la détection de la forme totale (PrPc + PrPsc) à la surface de ces cellules dendritiques des plaques de Peyer a été examinée. Les zones de contacts entre DC et FDC, lieux possibles de dissémination des prions au sein des organes lymphoïdes, ont été étudiées de façon quantitative. En vue de connaître les sites potentiels de neuroinvasion, nous avons établi dans le chapitre 2 une topographie des fibres nerveuses au sein des plaques de Peyer, des ganglions mésentériques et de la rate. Nous avons comparé les observations faites sur des souris saines, des souris infectées avec prions et des souris transgéniques. Ensuite, nous avons tenté de mettre en évidence des contacts entre les cellules dendritiques et les fibres nerveuses. La localisation des connexions neuro-immunes dans les organes lymphoïdes a particulièrement retenu notre attention. Les connexions entre cellules dendritiques et les fibres nerveuses décrites dans le chapitre 2 fournissent des informations de localisation. Elles permettent donc denvisager des sites potentiels de neuroinvasion mais elles ne renseignent pas sur la transmission des prions dun type cellulaire à lautre. En particulier la dissémination de lagent pathologique des DC aux neurones périphériques. Le chapitre 3 détaille nos travaux consacrés à lélaboration dun modèle in vitro reproduisant des interfaces entre des DC et des cellules nerveuses. Dans un premier temps, nous avons évalué la validité du modèle par rapport à la situation in vivo. Dans un second temps, les cellules dendritiques infectées par les prions ont été cultivées au contact de neurones issus des ganglions de la racine dorsale, ceux-là mêmes qui sont infectés in vivo, pour étudier la transmission des prions des DC aux neurones du système nerveux périphérique.

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+. Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV. L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+.<p>Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique.<p><p>Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV.<p>L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished