This thesis comprises two separate studies that focus on the consequences of cellular damage. The first investigates the effects of DNA damage on centriole behavior and the second characterizes phototoxicity during live-cell imaging. Cancer treatments such as ionizing radiation and/or chemotherapeutic DNA damaging agents are intended to kill tumor cells, but they also damage normal proliferating cells. Although centrosome amplification after DNA damage is a well-established phenomenon for transformed cells, it is not fully understood in untransformed cells. The presence of extra centrosomes in normal cell populations raises the chances of genomic instability, thus posing additional threats to patients undergoing these therapies. I characterized centriole behavior after DNA damage in synchronized untransformed (RPE1) human cells. Treatment with the radiomimetic drug, Doxorubicin, prolongs G2 phase by at least 72hrs, where 52% of cells display disengaged centrioles and 10% contain extra centrioles. This disengagement is mediated by Plk and APC/C activities both singly and in combination. Disengaged centrioles are associated with maturation markers suggesting they are capable of organizing spindle poles. Despite the high incidence of centriole disengagement, only a small percentage of centrioles reduplicate due to p53/p21 dependent inhibition of Cdk2 activity. Although all cells become prolonged in G2 phase, 14% eventually go through mitosis, of which 26% contain disengaged or extra centrioles. In addition to cancer treatments, cellular damage can be acquired from various external conditions. Short wavelengths of light are known to be toxic to living cells, but are commonly used during live-cell microscopy to excite fluorescent proteins. I characterized the phototoxic effects of blue (488nm) and green (546nm) light on cell cycle progression in RPE1. For unlabeled cells, I found that exposure to green light is far less toxic than blue light, but is not benign. However, the presence of fluorescent proteins led to increased sensitivity to both blue and green light. For 488nm irradiations, spreading the total irradiation durations out into a series of 10s pulses or conducting single longer, but lower intensity, exposures made no significant changes in phototoxicity. However, reducing oxidative stress by culturing cells at physiological (~3%) oxygen, or treatment with a water-soluble antioxidant, Trolox, greatly improved the cells tolerance to blue light. Collectively, my work offers an explanation for centrosome amplification after DNA damage and demonstrates the importance of proper centriole regulation in untransformed human cells. Further, it provides a practical assessment of photodamage during live-cell imaging.

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Epithelial cells are necessary building blocks of the organs they line. Their apicalbasolateral polarity, characterized by an asymmetric distribution of cell components along their apical-basal axis, is a requirement for normal organ function. Although the centrosome, also known as the microtubule organizing center, is important in establishing cell polarity the mechanisms through which it achieves this remain unclear. It has been suggested that the centrosome influences cell polarity through microtubule cytoskeleton organization and endosome trafficking. In the first chapter of this thesis, I summarize the current understanding of the mechanisms regulating cell polarity and review evidence for the role of centrosomes in this process. In the second chapter, I examine the roles of the mother centriole appendages in cell polarity during cell migration and cell division. Interestingly, the subdistal appendages, but not the distal appendages, are essential in both processes, a role they achieve through organizing centrosomal microtubules. Depletion of subdistal appendages disrupts microtubule organization at the centrosome and hence, affects microtubule stability. These microtubule defects affect centrosome reorientation and spindle orientation during cell migration and division, respectively. In addition, depletion of subdistal appendages affects the localization and dynamics of apical polarity proteins in relation to microtubule stability and endosome recycling. Taken together, our results suggest the mother centriole subdistal appendages play an essential role in regulating cell polarity. A discussion of the significance of these results is included in chapter three.

La réponse cellulaire humaine aux agents génotoxiques est essentielle pour le maintien de l'intégrité génétique. Elle implique une régulation coordonnée de nombreuses voies métaboliques qui déclencheront un arrêt du cycle cellulaire et la réparation des macromolécules endommagées, l'inflammation et l'apoptose. La Réparation Globale du Génome par Excision de Nucléotides (GG-NER) est une voie majeure de réparation de l'ADN pour la prévention de la cancérogenèse car elle élimine une grande variété de lésions induites par les rayonnements ultraviolets, des carcinogènes chimiques et d'autres facteurs de notre environnement. Ces lésions sont reconnues par XPC, qui est le premier facteur protéique impliqué dans cette voie de réparation. XPC forme un complexe avec Rad23B. Nous avons montré qu'in vivo le complexe XPC/Rad23B comportait également la centrine 2. Le mode d'interaction de XPC avec la centrine 2 est très conservé de la levure à l'homme indiquant une participation de ce complexe à un processus biologique général à tous les eucaryotes. La centrine 2 est impliquée dans la division cellulaire en régulant la duplication du centrosome. Rad23B intervient dans le contrôle stabilité/dégradation des protéines par le protéasome 26S. Nous avons montré que l'existence de ce complexe ancré à la chromatine permettait son accumulation immédiate sur les sites des lésions induites par les UV ou après l'impact d'un laser à 405 nm. Cette localisation dépend uniquement de la présence de XPC. Nous avons montré que XPC régulait le niveau basal et l'équilibre de la centrine 2 entre le noyau et le centrosome. Ceci pourrait être primordial pour coordonner la réparation de l'ADN et la division cellulaire. De plus, nous avons observé que Rad23B promouvait la survie cellulaire en stabilisant XPC après une irradiation aux UVC. Enfin, nos résultats montrent que la présence de XPC est requise pour l'accumulation des transcrits centrine 2 et Rad23B suite à une irradiation aux UV. Ceci conforte l'idée que XPC pourrait faire partie d'un système de signalisation qui induit l'expression de gènes après la reconnaissance des dommages de l'ADN. Cet hétérotrimère regroupe donc des protéines aux fonctions distinctes qui sont localisées précocement sur les dommages de l'ADN. Nous proposons que ce complexe coordonne différents processus biologiques immédiatement après la reconnaissance des lésions par XPC : la régulation du cycle cellulaire par la centrine 2, le contrôle stabilité/dégradation de protéines, dont XPC, par Rad23B et le déclenchement de la réparation et l'induction de l'expression de gènes par XPC. Des études récentes montrent que XPC serait également impliquée dans d'autres voies de réparation comme la réparation par excision de bases et la réparation des cassures double-brin. L'ensemble de ces observations suggère que ce complexe multifonctionnel pourrait avoir un rôle global dans la réponse cellulaire aux agents génotoxiques.