La bactérie Bacillus subtilis est considérée comme une solution alternative aux pesticides conventionnels pour la gestion des agents phytopathogènes. Les mécanismes de biocontrôle de cette bactérie sont multiples et reposent fortement sur la production de lipopeptides. A l'heure actuelle, l'influence des mycètes/oomycètes phytopathogènes sur la physiologie et les mécanismes de biocontrôle de B. subtilis est peu connue. L'objectif de ce projet de doctorat était d'étudier chez B. subtilis l'influence de différents mycètes/oomycètes phytopathogènes sur les mécanismes de biocontrôle et plus particulièrement sur la production de lipopeptides. Dans un premier temps, les lipopeptides produits par B. subtilis PTB185 ont été caractérisés par spectrométrie de masse et une méthode permettant leur quantification relative a été développée à l'aide d'un MALDI-TOF. Cette première étape a permis de montrer que la souche PTB185 produit de la surfactine, de l'iturine et de la fengycine. Les essais de confrontation sur gélose ont montré que l'activité antagoniste et la production de lipopeptides par B. subtilis variaient significativement (P ≤ 0.05) selon l'agent pathogène testé. Aucune corrélation entre la production de lipopeptides et l'activité antimicrobienne de B. subtilis n'a toutefois été observée. Le mycélium autoclavé des agents phytopathogènes a également influencé significativement les quantités de lipopeptides produites par B. subtilis en milieu liquide. La production de fengycine et/ou d'iturine a augmenté significativement en présence du mycélium de Botrytis cinerea, Mucor sp., Pythium ultimum ou Rhizoctonia solani, alors que l'addition de mycélium n'a pas affecté de façon significative la production de surfactine, en comparaison avec le traitement témoin. Les bactéries cultivées en milieu liquide en présence du mycélium de Mucor sp. ont causé une réduction significativement plus importante de la croissance de B. cinerea, R. solani et S. sclerotiorum, comparativement aux bactéries cultivées en absence de mycélium. Ces résultats montrent pour la première fois l'influence du mycélium autoclavé des agents phytopathogènes sur l'activité antagoniste et la production de fengycine/iturine chez B. subtilis. Une étude plus approfondie de l'influence du mycélium autoclavé et des composés extracellulaires des mycètes/oomycètes phytopathogènes sur B. subtilis PTB185 a par la suite été réalisée en protéomique. Le mycélium autoclavé de tous les agents phytopathogènes testés a fortement inhibé les protéines associées au métabolisme et à la biosynthèse de la thiamine chez la bactérie. Le mycélium autoclavé de Mucor sp. a fortement stimulé les protéines associées au « phage-like element PBSX » et fortement diminué celles du métabolisme et de la biosynthèse de la biotine. Les composés extracellulaires de P. ultimum ont diminué les protéines associées à la formation des flagelles et stimulé celles associées à la production de subtilosine. Le mycélium autoclavé et les composés extracellulaires de R. solani ont augmenté de façon importante les protéines associées à la synthèse de sidérophores. Les composés extracellulaires de S. sclerotiorum ont pour leur part très faiblement impacté le protéome de la bactérie. Les résultats de cette étude, en plus de témoigner de l'influence des interactions biotiques sur la production des lipopeptides, apportent des informations supplémentaires quant à l'influence de ces dernières sur la physiologie/les mécanismes de biocontrôle de B. subtilis. Enfin, cette étude offre de nouvelles perspectives pour optimiser le milieu de culture de B. subtilis à des fins biotechnologiques. / The bacterium Bacillus subtilis is considered as a promising alternative to conventional pesticides for plant disease management. The mechanisms underlying the biocontrol properties of this bacterium are multiple and are closely related to the production of lipopeptides. Currently, little is known about the influence of plant pathogenic fungi/oomycetes on B. subtilis physiology and biocontrol mechanisms. The objective of this doctoral research project was to study the influence of fungi/oomycetes on B. subtilis biocontrol mechanisms, especially on the production of lipopeptides. In the first instance, the lipopeptides produced by B. subtilis PTB185 were characterised by mass spectrometry and a method allowing the relative quantification of these compounds was developed using MALDI-TOF instrumentation. This first step displayed the capacity of strain PTB185 to produce surfactin, iturin, and fengycin. Confrontation assays conducted on agar showed that B. subtilis antagonistic activity and production of lipopeptides vary significantly (P ≤ 0.05) according to the pathogen tested. However, no correlation between lipopeptides production and B. subtilis antimicrobial activity was observed. Autoclaved mycelia of plant pathogens were also shown to significantly influence the quantities of lipopeptides produced by B. subtilis in liquid culture. Fengycin and/or iturin were produced in significantly higher amounts in presence of mycelium of Botrytis cinerea, Mucor sp., Pythium ultimum, or Rhizoctonia solani, while addition of mycelium in the medium did not significantly affect surfactin production as compared to the control. Bacteria grown in liquid medium amended with Mucor sp. mycelium caused a significantly higher reduction of mycelial growth of B. cinerea, R. solani, and Sclerotinia sclerotiorum as compared to the bacteria grown with no mycelium. These results show for the first time the influence of autoclaved plant pathogen mycelium on B. subtilis antagonistic ability and production of fengycin/iturin. The influence of autoclaved mycelia and extracellular compounds of plant pathogenic fungi/oomycetes on B. subtilis was further investigated by proteomics. Autoclaved mycelium of all tested pathogens strongly inhibited the proteins associated with B. subtilis thiamine metabolism and biosynthesis. Autoclaved mycelium of Mucor sp. strongly increased proteins associated with the phage-like element PBSX and strongly decreased those related to biotin metabolism and biosynthesis. Extracellular compounds of P. ultimum reduced proteins associated with flagellar assembly and stimulated those related to the production of subtilosin. Autoclaved mycelium and extracellular compounds of R. solani strongly increased proteins associated with the production of siderophores. Extracellular compounds of S. sclerotiorum barely affected the proteome of the bacterium. The results of this study, besides providing additional evidence of the influence of biotic interactions on lipopeptides production, give further information on the influence of the latter on B. subtilis physiology and biocontrol mechanisms. Finally, this study provides new insights into the optimisation of the culture medium to grow B. subtilis for biotechnological applications.

L’agriculture durable repose sur l’utilisation de moins d’intrants chimiques et favorise l’utilisation des produits biologiques comme le biochar. Ce dernier, à certaines doses, peut stimuler la fixation biologique d’azote chez les légumineuses. Notre projet vise à étudier l’effet d’un biochar de copeaux de pin pyrolysés à 700 ºC sur la symbiose tripartite Ensifer meliloti-Rhizophagus irregularis-Medicago sativa L., sur la production d’inocula bactériens et envers la lutte contre les agents pathogènes. Une culture de luzerne inoculée avec deux E. meliloti A2 et S14, en présence du Rhizophagus irregularis et dans un sol amendé avec 0, 15 ou 30 % de biochar (v:v) a été réalisée. Une stimulation significative de la mycorhization a été observée en présence de 15 % de biochar, et des souches A2 et S14. Par contre, l’inoculation de la luzerne avec A2 ou S14 n’a pas eu d’effet significatif sur les rendements, indiquant la présence dans le sol de souches efficaces d’E. meliloti. Une étude portant sur la survie des rhizobiums et du Bacillus subtilis MBI 600 menée pendant 120 jours à 4 et 25 °C. Elle a montré que 15 % de biochar favorise significativement la survie des cellules de rhizobiums. Par contre, pour Bacillus subtilis c’est le Pro-mix à 100 % qui supporte mieux la survie des cellules. Ainsi, l’effet de biochar sur la survie des microorganismes dépend de la nature de ces derniers et de la dose utilisée. L’étude de l’effet des trois doses du biochar sur les agents pathogènes a montré qu’à forte dose il pourrait favoriser le développement des pathogènes. Les résultats apportent des pistes pour les modalités d’application de biochar en agriculture. Par contre, notre étude est réalisée avec un seul type de biochar à trois doses. Il sera donc très important de tester d’autres types ainsi que d’autres doses de biochar. / Sustainable agriculture is based on the use of less chemical inputs and promotes the use of biological products such as biochar. Many studies clearly indicate that some biochars can stimulate biological nitrogen fixation in legumes. Our project aims to study the effect of a biochar (Pines, 700ºC) on the tripartite symbiosis Ensifer meliloti-Rhizophagus irregularis-Medicago sativa L., on the production of bacterial inocula and on the fight against pathogens. A culture of alfalfa inoculated with two strains of E. meliloti A2 or S14, in the presence of Rhizophagus irregularis and in a soil amended with 0, 15 or 30% of biochar (vol:vol) was conducted. A significant stimulation of mycorrhization was observed in the presence of 15% biochar and A2 or S14. However, inoculation of alfalfa with A2 or S14 had no significant effect on yields, indicating the presence in soil of effective strains of E. meliloti. A study on survival of rhizobia and Bacillus subtilis MBI 600 at 4°C and 25°C was conducted for 120 days. It showed that biochar (15%, vol:vol) promotes significantly the survival of rhizobial cells but for Bacillus subtilis it is the Pro-mix without biochar which supports better cell survival. Thus, the biochar effect on survival of microorganisms depends on the dose of biochar used. The effect of biochar amendments on P. ultimum and FORL colonization and infection was also evaluated. The study of the effect of three doses of biochar (0, 15, 30%; vol:vol) on pathogens showed that high doses may offer a good environment for pathogens development. Our study was performed using a single type of biochar with three doses. Therefore, it is very important to test other types and doses of biochar to be able to make recommendations.

Cette étude s'inscrit dans le cadre d'un programme de recherche destiné à évaluer le potentiel de la biodésinfection anaérobie (BDA) pour lutter contre les champignons phytopathogènes du sol dans les fraisières. Elle avait pour objectifs de (1) caractériser les profils d'acides gras volatils (AGVs) obtenus suite à la BDA réalisée avec différentes matières organiques et (2) déterminer la fongitoxicité et la phytotoxicité des AGVs. La BDA du sol a été réalisée in vitro avec comme amendements organiques une variété de résidus lignocellulosiques et de sous-produits de l'industrie agroalimentaire largement disponibles dans la province de Québec. Les sols amendés en matière organique ont généralement présenté des valeurs négatives de potentiel redox après deux semaines de BDA. Les concentrations du sol en AGVs (acide acétique, butyrique, isobutyrique, propionique, valérique et isovalérique) et la concentration totale en AGVs ont varié selon l'amendement organique utilisé. Les concentrations totales en AGVs les plus élevées furent obtenues dans les sols amendés avec la mélasse, la drêche de brasserie ou le marc de pomme. L'exposition à l'acide acétique et à l'acide butyrique, aux concentrations obtenues dans les sols soumis à la BDA, fut létale pour Verticillium dahliae et Neopestalotiopsis rosae. Des plantules de fraisier (Fragaria × ananassa) transplantées dans le sol après la BDA ont développé des symptômes de phytotoxicité au niveau des feuilles et des racines. Les symptômes les plus intenses ont été observés dans les sols dont les concentrations totales en AGVs étaient les plus élevées. L'acide butyrique et l'acide acétique seraient responsables, à tout le moins en partie, des symptômes foliaires de phytotoxicité. Cette étude démontre que le type de matière organique incorporé dans le sol influence les profils d'AGVs obtenus suivant un traitement de BDA et que l'acide acétique et l'acide butyrique, les AGVs produits en plus grande quantité, sont fongitoxiques et phytotoxiques.

Les dommages causés par les pathogènes des plantes sont une menace redoutable pour l’environnement, la diversité, ainsi que pour une partie considérable des ressources naturelles forestières et agronomiques telles que les arbres, les plantes et les récoltes. Les endroits situés à proximité des ports d’importation pour le commerce international et des sites de décharge de déchets verts sont considérés comme étant à risque pour l’introduction d’organismes exotiques et indésirables tels que des insectes, des phytopathogènes et des plantes envahissantes. Bien qu’il existe plusieurs méthodes développées et validées selon des standards établis visant à détecter certains genres préoccupants ou espèces ciblées, la plupart d’entre elles sont mal adaptées aux analyses à grande échelle ou sont limitées en ce qui concerne le nombre d’organismes différents pouvant être détectés simultanément. L’objectif principal de ce projet était de développer une méthode de détection nouvelle, plus rapide, à haut débit, hyper sensible et couvrant de plus grandes superficies afin de contribuer à l’amélioration des méthodes de dépistage et de lutte contre les phytopathogènes et les espèces envahissantes. Le projet a tiré avantage d’enquêtes en entomologie d’envergure nationale et préétablies par l’Agence Canadienne d’Inspection des Aliments en réutilisant les liquides de préservation provenant de pièges à insectes. Ces pièges, en plus de pièges à spores et de pièges à granules de pollen issus du butinage par des abeilles, ont été utilisés pour recueillir des échantillons environnementaux à travers le Canada. Le développement d’un pipeline bio-informatique adapté aux types d’organismes recherchés a permis de supporter et d’analyser efficacement les grandes charges de données produites par la plateforme de séquençage de nouvelle génération (SNG) Ion Torrent. De plus, la conception d’amorces de fusion a conféré un pouvoir de multiplexage significatif aux analyses. Le pipeline intégré au métabarcodage a permis d’effectuer la biosurveillance d’entités phytopathogènes fongiques et oomycètes, de plantes envahissantes ainsi que de localiser des régions géographiques d’intérêt où des organismes indésirables ont été trouvés. Les résultats suggèrent l’existence de pathosystèmes entre des insectes xylophages et des maladies fongiques n’ayant jamais été reportés auparavant. De plus, certains pathogènes fongiques et leurs plantes hôtes ont été trouvés dans les échantillons de granules de pollen, et les espèces de plantes identifiées par SNG corroboraient avec l’identification visuelle des plantes ayant été effectuée sur le terrain. Certains des résultats obtenus par métabarcodage ont été validés avec des tests qPCR spécifiques à certaines espèces cibles, ce qui a confirmé le pouvoir et la sensibilité de cette nouvelle méthode. Par exemple, de minimes quantités de propagules d’espèces de Phytophthora spp. ont été obtenues. Plusieurs espèces faisant partie de genres préoccupants ont été détectées, dont les champignons phytopathogènes Heterobasidion annosum s.s., H. abietinum/H. parviporum, Leptographium spp., Ophiostoma spp., Gremmeniella spp. et Geosmithia spp. et les oomycètes phytopathogènes Peronospora spp., Pythium spp. et Phytophthora spp. Ces résultats prometteurs indiquent que des organismes de réglementation de partout dans le monde pourraient ajouter cette méthode de métabarcodage à leur boîte à outils servant à faire la biosurveillance et la détection d’espèces réglementées. Dans le cas où des zones nécessitant des enquêtes approfondies étaient localisées selon les résultats de métagénomique, des tests qPCR ou tout autre test validé demeurent essentiels, surtout lorsqu’il s’agit d’identifier des espèces critiques comme des ravageurs réglementés. En outre, comme les technologies de séquençage évoluent continuellement, elles produisent des données dont la qualité s’améliore constamment, et ce, à moindre coût. Par conséquent, il est anticipé que la qualité des bases de données sur lesquelles repose le métabarcodage se perfectionne du même coup, permettant également d’augmenter la capacité de résolution de la nouvelle méthodologie décrite. / Damage caused by plant pathogens represents a devastating threat to the environment, diversity, and a significant part of natural forest and agronomic resources such as trees, plants, and crops. Areas that are in close proximity to international trade ports and green waste disposal facilities are considered high-risk introduction sites for exotic and unwanted organisms such as insects, phytopathogens, and invasive plants. Although there are many standard methods developed to detect numerous specific genera of concern or target species, most are ill-suited for large-scale screening, or are limited in the number of different organisms that can be assessed at a time. The main objective of this project was to develop a new detection method which is fast, high-throughput, highly sensitive, and targets vast survey areas, in order to contribute in the improvement of the methods for screening and battling of phytopathogens and invasive species. Spore traps, insect traps, and honeybee-foraged pollen clusters were used to collect environmental samples across Canada. The project took advantage of entomology surveys conducted by the Canadian Food Inspection Agency by reusing preservative fluids from those insect traps. The development of a bioinformatics pipeline customized for the types of organisms screened allowed for the handling and efficient analysis of the large data loads produced with the Ion Torrent next-generation sequencing (NGS) platform. Additionally, the design of fusion primers conferred the analyses a significant multiplexing power. Integrating the pipeline to metabarcoding allowed for the biosurveillance of fungal and oomycete phytopathogens, as well as invasive plants, and pinpointing geographical regions of concern where unwanted species were found. Results suggest the existence of wood-boring insects and fungal diseases pathosystems never previously reported. In addition, certain fungal pathogens and their plant hosts were detected from the pollen cluster samples, and the plants species identified by NGS corroborated the records of the visual plant inspections performed in the field. Some of the metabarcoding results were validated with some species-specific qPCR assays, which confirmed the power and the sensitivity of this new method. For example, very low levels of some Phytophthora species propagules could be detected. Multiple species within genera of concern were identified, including the plant pathogenic fungi Heterobasidion annosum s.s., H. abietinum/H. parviporum, Leptographium spp., Ophiostoma spp., Gremmeniella spp., and Geosmithia spp., and the oomycetes Peronospora spp., Pythium spp., and Phytophthora spp. These promising results indicate that regulatory agencies across the world could combine our new metabarcoding approach to their regulated species monitoring and detection toolbox for biosurveillance and screening. In the case where areas requiring further inquiries are pinpointed based on the metagenomics results, qPCR or alternate validated assays remain essential, especially to resolve the identification of critical species such as regulated pests. Furthermore, given that constantly evolving sequencing technologies yield increasing quality data continually, and at reduced costs, it is anticipated that the quality of the databases on which metabarcoding relies will improve at the same time, therefore increasing the resolving capacity of the new method described.

La fraise est un fruit très sensible aux contaminations fongiques provoquées par les moisissures phytopathogènes en conditions post-récolte. Pour contrôler ces infections, le maintien des conditions optimales d'entreposage est primordial. Il s'agit principalement de contrôler l'atmosphère en ajustant la température autour du 0 °C et l'humidité relative à 90-95 %. Cependant, la gestion de ces conditions demeure un moyen insuffisant pour lutter contre la prolifération microbienne sur les fraises en post-récolte. Pour cette raison, des agents chimiques sont appliqués, bien que cela représente un danger pour l'humain, l'animal ainsi que l'environnement de manière générale. La réutérine est un aldéhyde produit par une bactérie lactique probiotique Lactobacillus reuteri ayant démontré un potentiel antimicrobien contre un bon nombre de bactéries, levures et moisissures. Le squalène est un produit naturel extrait des huiles d'olive ou d'amarante, connu pour ses propriétés antioxydantes, anticancéreuses et antimicrobiennes. Ces dernières ont été démontrées dans certaines études contre quelques bactéries et moisissures. Le but de ce projet était de démontrer le potentiel antifongique de la réutérine et du squalène pour ouvrir une voie à leur utilisation en post-récolte en tant que biofongicides. Les moisissures mises à l'étude étaient Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Rhizopus stolonifer et Penicillium expansum. Les expériences in vitro consistaient à réaliser des tests de diffusion sur géloses pour observer un halo d'inhibition par chaque antifongique, puis au moyen d'une microtitration, déterminer les concentrations d'inhibition. Les expériences in vivo consistaient à placer des fraises dans des conditions de post-récolte après inoculation et traitement. La réutérine a montré un effet fongicide avec des concentrations minimales inhibitrices de 23.4, 2.92, 11.7 et 11.7 mM contre Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Rhizopus stolonifer et Penicillium expansum, respectivement. Le squalène n'a pas eu d'effet inhibiteur contre les souches de moisissures testées. La réutérine a également été efficace sur les fraises entreposées à 4 °C, les tests microbiologiques ayant donné des résultats probants (p<0.0001). Les résultats sur la qualité des fraises étaient proches des valeurs de référence, ce qui est acceptable pour la réutérine étant donné que le squalène n'a pas montré d'effet significatif. / The strawberry fruit is very sensitive to fungal contamination caused by phytopathogenic molds in postharvest. It is essential to maintain ideal transport and storage conditions to control infections. This basically involves keeping the temperature around 0 °C and the relative humidity to 90-95 %. However, the management of these conditions remains an insufficient strategy for controlling microbial growth in cold-stored strawberries. Therefore, chemical treatment agents are applied, especially before harvesting. Nevertheless, this is a dangerous practice for humans, animals, and the environment. Reuterin is an aldehyde produced by a lactic acid bacteria Lactobacillus reuteri that have demonstrated an antimicrobial potential against several bacteria, yeasts, and molds. Squalene is a natural product extracted from olive or amaranth oils. It is known for its antioxidant, anticancer, and antimicrobial properties that have been demonstrated in a few studies against some bacteria and molds. The aim of this project was to prove the antifungal potential of reuterin and squalene to pave the way for their postharvest use as biofungicides. Tested molds included Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Rhizopus stolonifer and Penicillium expansum. The in vitro experiments consisted of agar diffusion tests to observe inhibition spots by each antifungal agent, and then my means of microtitration, to determine the inhibitory concentrations. The in vivo experiments consisted of placing strawberries under postharvest conditions after inoculation and treatment. Reuterin showed fungicidal effect with minimum inhibitory concentrations of 23.4 mM, 2.92 mM, 11.7 mM, and 11.7 mM against Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Rhizopus stolonifer and Penicillium expansum, respectively. Squalene had no inhibitory effect against the mold strains tested. Reuterin was also effective on strawberries stored at 4 °C, microbiological tests providing conclusive results (p<0.0001). Moreover, quality tests were acceptable since reuterin had no effect on changes in reference values of quality parameters. However, squalene did not show any significance on quality parameters.

La symbiose mycorhizienne joue un rôle significatif en agriculture, notamment en facilitant la nutrition des plantes et l'amélioration de leur résistance envers les stress biotiques et abiotiques. Cette étude visait à évaluer cinq souches de champignons mycorhiziens arbusculaires pour leur capacité à s'adapter aux sols alcalins d'Haïti. L'expérience a été réalisée en serre pour examiner l'effet combiné du champignon Rhizophagus irregularis et du carbonate de calcium sur la biomasse aérienne, la colonisation mycorhizienne et la composition minérale du poireau. Les résultats ont montré une amélioration significative de la biomasse aérienne des plantes sous l'effet de l'inoculation mycorhizienne, cette amélioration persistant à tous les niveaux de carbonate de calcium. Par ailleurs, les plantes inoculées avec trois des cinq souches de champignon (DAOM 241558, DAOM 197198(AAC) et DAOM 197198(PT)) ont généré un rendement en biomasse supérieur à celui du témoin non inoculé, avec des accroissements de l'ordre de 87%. En ce qui concerne le taux de colonisation, les plantules inoculées ont montré un niveau de colonisation mycorhizienne variant de 45% à 61% selon les souches de champignon, qui diminue avec l'augmentation de la concentration de carbonate de calcium. Les résultats révèlent une corrélation positive entre la biomasse aérienne et le taux de colonisation mycorhizienne. En effet, plus la colonisation est élevée, plus le rendement en biomasse aérienne augmente. Cette observation s'applique à toutes les souches, à l'exception de la souche DAOM 234181 qui, malgré un taux de colonisation élevé, génère un faible rendement en biomasse chez la plante inoculée. Enfin, une teneur plus importante des plantes en phosphore, en potassium et en zinc a été observée lorsque celles-ci ont été inoculées avec l'une de ces trois souches, soit DAOM 241558, DAOM 197198(AAC) et DAOM 197198(PT), et ceci même à des concentrations élevées de carbonate de calcium.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 septembre 2023) / Les infections causées par des pathogènes fongiques sont un problème de santé publique inquiétant. Le taux de mortalité des patients avec une infection fongique invasive dépasse souvent 50%, et ce, même s'ils sont traités. Des études ont estimé que plus de décès sont causés chaque année par les maladies fongiques que par la tuberculose et la malaria. Malgré cela, les infections fongiques ont été très peu étudiées comparativement aux autres types de maladies infectieuses. Les antifongiques tels que les azoles sont essentiels pour traiter les mycoses. Cependant, l'évolution de la résistance met en péril notre capacité à traiter les patients infectés. Plusieurs mutations dans la cible moléculaire des azoles, Erg11, sont connues pour conférer la résistance. Pourtant, nos connaissances actuelles ne sont pas suffisantes pour être utilisées en clinique afin d'assister le choix de traitement et pour aider à développer de nouveaux médicaments. Nous avons construit un système pour étudier des variants d'ERG11 de pathogènes fongiques comme Candida albicans dans la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. Nous avons remplacé le promoteur natif d'ERG11 de S. cerevisiae (ScERG11) avec un promoteur répressible à la doxycycline afin de supprimer l'expression du gène. Nous avons confirmé qu'ERG11 de C. albicans (CaERG11) complémente la fonction de ScERG11. Nous montrons également que des mutations de résistance telles que G464S dans CaERG11 peuvent être reconstituées dans notre système. De plus, en utilisant une approche de type Deep Mutational Scanning, nous avons construit une librairie exhaustive de CaERG11 comprenant presque 8000 mutants. Finalement, nous avons utilisé notre système pour caractériser des mutations dans CaERG11. Nous avons découvert de nouvelles mutations de résistance au fluconazole tout en décrivant des mutations déjà reportées dans la littérature. Ultimement, nous caractériserons systématiquement les mutations dans CaERG11 qui confèrent la résistance aux azoles et évaluerons leur impact sur la fonction de la protéine. / Infections caused by fungal pathogens are a concerning public health problem. The mortality rate of patients with an invasive fungal infection often exceeds 50%, even when they are treated. Studies estimated that more than 1.7 million deaths are caused by fungal disease each year, which is more than tuberculosis or malaria. Despite this, fungal infections have been understudied in comparison to other types of infectious diseases. Antifungals such as azoles are crucial medications to treat mycosis. However, the evolution of resistance to these molecules jeopardizes our ability to treat infected patients. Many mutations in the azole target Erg11 are known to confer resistance. Yet, our current knowledge is not sufficient to be used in clinics to assist the choice of treatment and to help in the development of new drugs. We built a system to study ERG11 variants of fungal pathogens like Candida albicans in the model yeast Saccharomyces cerevisiae. We replaced the native ERG11 promoter of S. cerevisiae (ScERG11) with a doxycycline repressible promoter to suppress the expression of the gene. We confirmed that ERG11 of C. albicans (CaERG11) complements the function of ScERG11. We also show that the resistance phenotypes due to mutations such as G464S in CaERG11 can be reconstituted in our system. Furthermore, using a Deep Mutational Scanning approach, we constructed an exhaustive library of nearly 8000 variants in CaERG11 and validated its completeness by high throughput sequencing. Finally, we confirmed that our system can be used to characterize azole resistance mutations. We screened the CaERG11 library with fluconazole and isolated resistant variants. We discovered new resistance mutations while describing mutants already reported in the literature. Ultimately, our system will be used to systematically characterize azole resistance mutations in ERG11 and to evaluate the impact of mutations on the protein function.

L’étude des champignons endophytes, ainsi que celle des autres composants du microbiote des plantes, a fortement bénéficié du développement des techniques de séquençage à haut débit à la fin des années 2000. Ces progrès technologiques ont notamment permis la popularisation du métabarcoding, une approche servant à identifier les composants de la biodiversité et d’étudier leur distribution au sein d’échantillons environnementaux grâce à leur contenu en ADN. L’abondance des données produites, ainsi que la standardisation de la préparation des échantillons permises par ces techniques de séquençage ont modifié en profondeur la perception de l’ampleur de la diversité fongique. Cependant, les préceptes de l’endophytologie fongique restent majoritairement dictés par les études basées sur les mises en culture bien qu’elles ne parviennent, comme l’ont démontré les études moléculaires, qu’à récolter une partie de la diversité fongique. Les techniques de séquençage à haut débit ne sont pas sans biais elles aussi puisqu’elles tendent à majorer les estimations de la biodiversité même avec les analyses les plus poussées. Les objectifs principaux de cette thèse étaient tout d’abord de développer une approche analytique rigoureuse afin d’estimer de façon conservatrice la biodiversité associée aux données issues du pyroséquençage 454; puis, de développer une meilleure compréhension de la structure de l’endomycobiote des arbres en milieu forestier tout en remettant en question les conclusions des études basées sur les mises en culture. La surestimation de la biodiversité est essentiellement liée à la conservation de séquences erronées qui participent à la formation du nombre important de singletons et doubletons généralement observés avec les techniques de séquençage à haut débit. Trois sources d’erreurs prédominent: la formation de chimères, la substitution de nucléotides lors de l’amplification et les erreurs de séquençage. Nous avons posé l’hypothèse que la sélection d’un sous fragment du code-barres moléculaire fongique, basée sur des propriétés particulières, pourrait si ce n’est identifier formellement ces séquences comme erronées, du moins limiter leur effet sur l’estimation de la biodiversité. Le fragment que nous avons considéré se compose du résidu de la petite sous-unité ribosomique (pSSU) situé à la suite de l’amorce ITS1F, et de l’espaceur transcrit interne 1 (ITS1). Nous avons montré qu’utiliser ce fragment pour analyser les données permet d’améliorer la sensibilité de la détection des chimères. La substitution de nucléotides ainsi que les erreurs de séquençage sont des phénomènes rares, et les séquences erronées sont donc faiblement représentées et relativement similaires à des séquences réelles et abondantes. Nous avons donc posé l’hypothèse qu’inclure le pSSU, dont la variabilité est plus faible que celle de l’ITS1, puisse étouffer l’impact de ces erreurs. Les séquences potentiellement erronées ont été regroupées avec les séquences réelles et abondantes dont elles déviaient, permettant ainsi de réduire la formation des singletons et des doubletons. Suite à cela, nous avons donc développé une méthode afin d’extraire directement le fragment pSSU-ITS1 des amplicons du code-barres fongique. À partir de l’endomycobiote d’un unique sapin baumier que nous avons analysé afin d’évaluer notre traitement de données dans notre premier chapitre, nous avons observé qu’utiliser le fragment pSSU-ITS1 en lieu et place de seulement l’ITS1 n’affecte pas les conclusions sur la structure de la communauté des champignons endophytes. Bien qu’il faille le considérer dans le cadre d’un échantillonnage limité, nous avons évalué, semble-t-il pour la première fois, l’ampleur de la diversité des champignons endophytes recueillis dans un arbre à un moment donné et extrapolé cette richesse à 2 536 ± 73 mOTUs. Nous avons confirmé dans notre second chapitre que les champignons endophytes présentent une certaine spécificité de tissu puisque l’endomycobiote des branches de sapins baumiers se divise selon le type de tissu considéré plutôt que de former une entité ubiquitaire uniformément répartie dans l’ensemble des branches. Enfin, dans notre dernier chapitre, nous avons montré que les mécanismes impliqués dans la colonisation de la plante hôte par les champignons endophytes se révèlent d’une complexité et d’une dynamique plus importantes que le processus d’accumulation passive suggéré par les études basées sur les mises en culture: les quatre dernières cohortes d’aiguilles de sapins baumiers que nous avons étudiées présentaient une diversité relativement conservée, mais des communautés différentes. / As for the studies of other members of the plant microbiota, fungal endophytology has vastly benefited from the development of High Throughput Sequencing techniques in the late 2000s. This technological progress has notably allowed for the popularization of metabarcoding, i.e. a DNA-based approach to identify biodiversity components from environmental samples and study the community composition and distribution. The massive production of data, and the standardization in the sample preparations associated with such methods, have deeply modified the perception of the extent of the fungal biodiversity. Yet fungal endophytology precepts remain largely inherited from culture-dependent methods which have been shown to yield a more fractioned portion of the biodiversity than the molecular-based approach, as many fungi are not amenable to standard culturing. HTS techniques are not without drawbacks either as they tend to inflate the biodiversity estimates even with state of the art analysis. The main goals of this thesis were first to develop a more rigorous approach to analyse data obtained from 454 pyrosequencing, one of the original HTS techniques, in order to estimate conservatively the biodiversity; and then to develop a better understanding of the structure of forest trees endomycobiota and challenge earlier conclusions based on culture-dependent methods. Inflation of the biodiversity is mostly due to remaining undetected erroneous sequences partially forming the large number of singletons and doubletons generally observed with HTS based studies. Three sources of error are significant: PCR chimeras, PCR single base substitutions, and sequencing error. Here we hypothesized that the selection of a sub-region of the fungal barcode displaying particular characteristics might, if not formally assess erroneous sequences as such, at least limit their impact on the estimation of the diversity. We thus considered a fragment composed of the partial ribosomal small sub-unit immediately following the ITS1F primer in addition of the ITS1 sub-locus (pSSU-ITS1). We showed that basing the analysis on the pSSU-ITS1 fragment enhances the sensitivity of chimera detection. As PCR single base substitutions and sequencing errors remain rare events, spurious sequences are rare too and somewhat similar to true abundant sequences. We hypothesized that the presence of the pSSU, whose variability is lower than that of the ITS1 sub-locus, might buffer these errors. Putative rare spurious sequences were grouped with the true abundant sequences they deviated from, thus reducing the proportion of singletons and doubletons. We then developed an approach to readily extract this pSSU-ITS1 fragment from fungal ITS amplicons. We observed from the endomycobiota of a single balsam fir that we produced to test our data treatment in the first chapter that considering the pSSU-ITS1 fragment did not alter the conclusions on the structure of the fungal endophytic community from ITS1 analysis. While it has to be considered with appropriate reservations due to the limited sampling, we also estimated, for the first time to the best of our knowledge, the extent of the fungal endophyte biodiversity harboured by a single tree at a precise time with an extrapolation of 2 536 ± 73 mOTUs. In the second chapter on the endomycobiota present in the different tissue types of balsam fir branches, we confirm that some tissue specificity is exhibited by fungal endophytes as our results suggest that the aerial endomycobiota of balsam fir trees might be fractioned in distinct communities depending on the tissue types. Finally, in the third chapter, we reveal that the mechanisms of colonization of the host plant by fungal endophytes might be more complex and dynamic that the suggested passive accumulation hinted by culture-dependent methods. The last four cohorts of needles from balsam fir sampled displayed relatively similar diversities, but harboured distinct communities.

Cette thèse, qui s'inscrit dans un programme de recherche destiné à valoriser la mycoflore du Québec, avait pour objectif d'avoir une meilleure connaissance de la composition chimique de la mycoflore du Québec, l'une des plus riches au monde, qui a jusqu'ici été peu étudiée dans un contexte mycochimique. La teneur en lipides et la composition en acides gras ont d'abord été étudiées chez différentes espèces de champignons indigènes du Québec appartenant à la famille des Agaricaceae, Amanitaceae, Boletaceae, Coprinaceae, Ganodermataceae et Lycoperdaceae. L'analyse des lipides des champignons à l'étude, dont la teneur se situait entre 3,1 et 16% du poids sec, a permis l'identification de plus de 40 acides gras différents (C4 à C26) dont certains sont rapportés pour la première fois chez les basidiomycètes soient les acides 11- hexadécénoïque (16:1 Ail), 7,10-hexadécadiénoïque (16:2 A7,10), 11-heptadécénoïque (17:1 Ail), et chez les mycètes, nommément les acides cw-11,12- méthylèneoctadécanoïque (19:0 cycll) et élaïdique (18:1 A9/). Les principaux acides gras retrouvés étaient les acides palmitique (16:0), oléique (18:1 A9c) et linoléique (18:2 A9c,12c). L'analyse des profils d'acides gras a par ailleurs montré que le contenu en certains acides gras peut varier d'une espèce à l'autre. L'étude des profils d'acides gras de deux espèces de Pleurotus (P. ostreatus et P. cornucopiae var. citrino-pileatus) cultivées sous différentes conditions de température a pour sa part révélé une augmentation du niveau d'insaturation chez les acides gras des fractions polaire et non polaire des carpophores de P. ostreatus lorsque la température de croissance était inférieure à 17°C. Bien que les températures de croissance supérieures à 17°C n'aient pas eu un effet clair sur le degré d'insaturation des acides gras, l'analyse des résultats obtenus révèle que la température de croissance influence les profils d'acides gras des carpophores de P. ostreatus et de P. cornucopiae var. citrino-pileatus, et ce de façon différente selon l'espèce considérée. Ces travaux suggèrent qu'il pourrait être possible de moduler le degré d'insaturation des acides gras des espèces du genre Pleurotus en modifiant la température de croissance. Les travaux réalisés sur le champignon Ganoderma tsugae ont quant à eux permis de soupçonner la présence de 16 composés ayant des structures complexes qui, à ce jour, n'ont jamais été rapportés chez cette espèce. La purification partielle de deux de ces composés, ayant des poids moléculaires respectifs de 646 (composé A) et 662 (composé B), ainsi que les analyses spectroscopiques effectuées ont permis de réduire à une le nombre de formules moléculaires possibles pour chaque composé, soient C40H38O8 pour le composé A et C41H42O8 pour le composé B. Au niveau structural, les données obtenues suggèrent pour chaque composé une structure de base compacte, possiblement triterpénique ou stéroïdienne à cinq hexacycles accompagnée d'une chaîne latérale d'une douzaine de carbone, possiblement cyclique. Les composés pentacycliques sont fréquents chez les plantes vertes, mais demeurent peu rapportés chez les mycètes. La caractérisation des composés A et B devra être complétée afin de confirmer la présence de tels composés chez G. tsugae. Enfin, les travaux destinés à démontrer la présence d'éritadénine et de lovastatin chez les champignons indigènes du Québec n'ont pu révéler la présence de ces molécules d'intérêt nutraceutique chez les 29 espèces de champignons analysées.

Une énorme partie du phosphore (P) soluble ajouté sous forme d’engrais chimiques et de fumiers précipite dans le sol et devient non disponible aux plantes. Par ailleurs, l’utilisation excessive des engrais chimiques n’est pas compatible avec l’agriculture moderne qui se veut durable, ni avec l’agriculture biologique. De plus, ces pratiques ont été effectuées sans tenir compte de la microflore présente au niveau de la mycorhizosphère ce qui conduit à des applications pouvant être onéreuses et néfastes. En effet, les microorganismes bénéfiques du sol, notamment les bactéries solubilisant les phosphates (BSP) et les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA), ont une influence importante sur la fertilité des sols et la productivité végétale. Une nouvelle approche basée sur le piégeage des BSP au niveau de l’hyphosphère du CMA Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, préalablement inoculé avec des suspensions de microorganismes telluriques, a permis d’isoler des BSP compétentes capables de dissoudre efficacement le phosphate de roche (PR) d’origine ignée en milieu liquide. Les travaux ont ensuite permis de prouver l’importance du synergisme entre les hyphobactéries (Burkholderia anthina Ba8 et Rhizobium miluonense Rm3) et le mycélium extraracinaire des CMA Ri dans l’amélioration de la solubilisation des phosphates in vitro. L’étude approfondie des mécanismes qui pourraient être impliquées dans cette interaction montre que les hyphobactéries, principalement la souche B. anthina Ba8, adhèrent fortement à la surface des hyphes et aussi à celle du PR. Il est fortement probable que les interactions décrites ainsi que les caractéristiques bénéfiques aux plantes exprimées par les BSP sont responsables de l’amélioration de la croissance, de la nutrition phosphatée et du rendement en matière fraîche et sèche chez le maïs cultivé en serre, coinoculé avec les BSP et les CMA Ri et fertilisé avec le superphosphate ou le PR du Québec. / Soluble phosphorus (P) fertilizers added to soil rapidly precipitate, forming sparingly soluble phosphates, not available to plants. Furthermore, the excessive use of chemical fertilizers to compensate soil P deficiency is not considered sustainable and it leads to costly and potentially harmful applications. Many reports confirmed that beneficial soil microorganisms, including phosphate-solubilizing bacteria (PSB), have a significant influence on soil fertility and crop productivity. Indeed, PSB can also improve phosphate rock (PR) efficiency when directly applied to soil. However, most published works on PSB overlooked the possible interaction between PSB and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), which are ubiquitous in cultivated plants. A new approach based on the trapping of PSB strongly attached to the hyphosphere of AMF Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, previously inoculated with microbial soil suspensions was developed to isolate relevant PSB able to mobilize P from a low reactive igneous PR more efficiently than those directly isolated from the same rhizosphere soil samples. An in vitro study demonstrated that the synergism between hyphobacteria (Burkholderia anthina Ba8 and Rhizobium miluonense Rm3) and Ri hyphae highly improved the solubilisation of PR. Our results go beyond the existing studies and showed specific mechanisms involved on PSB-AMF interactions. Indeed, hyphobacteria, mainly B. anthina Ba8, strongly adhere to Ri hyphal surfaces and PR particles forming a structured biofilm. Under greenhouse conditions, the direct application of PSB and AMF Ri as biostimulants for sustainable corn production showed that these beneficial microorganisms improve growth and P uptake of corn fertilized with superphosphate or Quebec PR.