Les oomycètes phytopathogènes ont co-évolué avec les microbiotes des plantes hôtes. Il en résulte la formation de biofilms et des réseaux complexes d’interactions dont nous commençons juste à comprendre l’incidence sur la biologie et la virulence des oomycètes. Déterminer la nature de ces interactions et leur rôle dans le contexte d’une infection est aujourd’hui un enjeu cognitif qui concerne la caractérisation des mécanismes moléculaires et communautaires sous-jacents. C’est également une opportunité en termes d’innovation pour élaborer des méthodes de lutte alternative à l’usage de fongicides. Dans ce contexte, ce travail de thèse a consisté à étudier, d’une part, la formation de biofilm chez Phytophthora parasitica, un oomycète polyphage et tellurique, ainsi que, d’autre part, les interactions au sein de ce biofilm entre P. parasitica et le microbiote procaryote rhizosphérique de la plante hôte Solanum lycopersicum. L’analyse du génome de P. parasitica et du transcriptome du biofilm a conduit à la caractérisation d’une nouvelle famille de mucines restreinte à la lignée des oomycètes, les protéines MUCL. Ces 315 protéines sécrétées (25-30 kDa) sont réparties en 15 groupes et possèdent deux domaines : un domaine hautement conservé de fonction inconnue ; un domaine caractéristique des mucines, riche en résidus Sérine et Thréonine avec de très nombreux sites putatifs d’O-glycosylation. Chez P. parasitica, les 3 gènes PPMUCL1/2/3 sont exprimés et co-régulés spécifiquement au stade biofilm. / The interactions between a pathogen and the host surface resident microbiota are critical to disease outbreak. These interactions shape the distribution, the density and the genetic diversity of inoculum. However for most plant pathogens how each of these interactions acts on disease as a single one or as a member of a functional network remains to be specified. This issue is addressed here through the analysis of two types of interactions involving the polyphagous oomycete P.parasitica : (i) the intraspecific interaction that leads to monospecific biofilm formation by P. parasitica zoospores on plant surface; (ii) the interspecific interactions that occur between P. parasitica biofilm and the prokaryotic microbiota of Solanum lycopersicum rhizosphere. The biology of monospecific biofilm is investigated through the characterization of MUCL, a new oomycete-specific Mucin-like Protein family. Gene profiling, biochemical and immunohistological analyses define the extent of this family and lead to identify three members, PPMUCL1/2/3, as residing in P. parasitica biofilm. The Phytophthora parasitica-Microbiota interaction is explored using first a metagenomic approach. Two microbial metagenomes derived from a soil of a tomato greenhouse is defined and compared after 16S RNA gene sequencing: M1 which corresponds to the sub-rhizospheric microbiota able to colonize the roots of axenic tomato seedlings; M2, the sub-microbiota able to colonize the tomato seedling roots previously coated with P. parasitica monospecific biofilm. A representative collection of microorganisms from M2 were also obtained through in vitro selection on a medium prepared from P. parasitica extract.

Dans l’objectif de redynamiser la culture des protéagineux, il est primordial d’améliorer la gestion du risque lié à Aphanomyces euteiches, agent responsable de la pourriture racinaire du pois. Le manque de connaissances sur les mécanismes d’infection d’A. euteiches constitue un frein à l’élaboration de stratégies de contrôle durable. Dansl’optique d’étudier les premières étapes du processus infectieux d’A. euteiches, laconstruction d’une souche A. euteiche-GFP a été entreprise. Transfecter A. euteiches aura permis d’assurer (i) la production de protoplastes par digestion enzymatique du mycélium puis (ii) d’insérer le gène gfp par la méthode de transfection chimique PEG-CaCl2 et (iii) de constater l’insertion stable du gène gfp dont l’expression s'est avérée transitoire. En parallèle, dans l’objectif d’apporter des éléments de réponses quant aux rôles des exsudats racinaires et du Root Extracellular Trap (RET) dans les réactions de défense du pois, une étude comparée des interactions entre Pisum sativum (plante sensible) et Vicia Faba (plante tolérante) au pathogène A.euteiches a été réalisée durant les premières phases de l’infection. Alors que de nombreuses variations au niveau de la composition polysaccharidique du RET et des exsudats ont été observées chez le pois, la féverole a présenté des modifications marginales. Chez le pois, l’infection est intense et rapide alors qu’elle semble réduite chez la féverole. La féverole repousse les zoospores tandis que le pois infecté les attire davantage. La féverole semble pouvoir protéger le pois au travers de mécanismes de communication qu’il convient de caractériser. L’ensemble de ces résultats semblent prometteurs dans le développement de méthode de lutte contre la pourriture racinaire du pois. Enfin, l’étude des propriétés bio-physico-chimiques des sols susceptibles de conditionner l’apparition de la maladie ont permis de confirmer la corrélation positive entre la densité d’inoculum du pathogène et le potentiel infectieux (PI) dans des sols naturellement infestés : les sols possédant des teneurs élevées en sable ou en calcium s'avèrent défavorables au développement de la maladie. Cette étude a aussi permis de mettre en évidence une influence possible des communautés microbiennes des sols, susceptibles d’influencer le processus infectieux d’A.euteiches / Aphanomyces euteiches is a pathogenic oomycete considered to be the most damaging root disease of pea crops in the world and there is currently no registered pesticide for its control. Crop management is the most efficient tool to control root rot, and avoidance of infested soil seems to be the optimal solution. Mechanisms related to A. euteiches root colonization remain poorly understood. In order to better understand A.euteiches infectious cycle, a polyethylene glycol (PEG) – calcium chloride (CaCl2) transformation protocol has been perfected in order to stably express the reporter gene GFP. The data show for the first a transient expression of green fluorescent protein (GFP) which can be observed in A.euteiches mycelium, a Saprolegnia oomycete. Vector pGFPN, containing the ham34 promoter and terminator of the Peronospora oomycete Bremia Lactucae, was introduced in A.euteiches protoplasts. Transient expression of GFP could be observed in A. euteiches mycelium by confocal microscopy. qPCR analyses confirmed the actual gfp gene insertion in its genome. Meanwhile, the influence of both pea and faba bean root extracellular trap (RET) and root exudates has been explored for A. euteiches zoospores by chemotaxis assays, microscopic observations and oomycete DNA quantification. Reciprocally pea and faba bean roots responses to A. euteiches infection have been studied at early stage of infection by biochemical analysis of cell wall polymer content in the RET and root exudates. Whereas infected pea root exudates stimulated A.euteiches zoospores attraction, faba bean exudates had a repellent effect on zoospores. In response to infection, arabinogalactan protein content of root pea exudates was altered. Interestingly, A.euteiches colonization was less intense on faba bean root surface and protect pea root at early stage of infection. Finally, the correlation between inoculum quantity in infested and the inoculum potential (IP) in field has been confirmed by qPCR. Analyses of the influence of abiotic soil parameters on the disease showed that a high calcium concentration or sand content negatively impact the IP. Furthermore, microbial communities proved to play a role in the expression of the disease in some soils. Metagenomics could be applied in order to provide new directions in managing this disease.

La bactérie Bacillus subtilis est considérée comme une solution alternative aux pesticides conventionnels pour la gestion des agents phytopathogènes. Les mécanismes de biocontrôle de cette bactérie sont multiples et reposent fortement sur la production de lipopeptides. A l'heure actuelle, l'influence des mycètes/oomycètes phytopathogènes sur la physiologie et les mécanismes de biocontrôle de B. subtilis est peu connue. L'objectif de ce projet de doctorat était d'étudier chez B. subtilis l'influence de différents mycètes/oomycètes phytopathogènes sur les mécanismes de biocontrôle et plus particulièrement sur la production de lipopeptides. Dans un premier temps, les lipopeptides produits par B. subtilis PTB185 ont été caractérisés par spectrométrie de masse et une méthode permettant leur quantification relative a été développée à l'aide d'un MALDI-TOF. Cette première étape a permis de montrer que la souche PTB185 produit de la surfactine, de l'iturine et de la fengycine. Les essais de confrontation sur gélose ont montré que l'activité antagoniste et la production de lipopeptides par B. subtilis variaient significativement (P ≤ 0.05) selon l'agent pathogène testé. Aucune corrélation entre la production de lipopeptides et l'activité antimicrobienne de B. subtilis n'a toutefois été observée. Le mycélium autoclavé des agents phytopathogènes a également influencé significativement les quantités de lipopeptides produites par B. subtilis en milieu liquide. La production de fengycine et/ou d'iturine a augmenté significativement en présence du mycélium de Botrytis cinerea, Mucor sp., Pythium ultimum ou Rhizoctonia solani, alors que l'addition de mycélium n'a pas affecté de façon significative la production de surfactine, en comparaison avec le traitement témoin. Les bactéries cultivées en milieu liquide en présence du mycélium de Mucor sp. ont causé une réduction significativement plus importante de la croissance de B. cinerea, R. solani et S. sclerotiorum, comparativement aux bactéries cultivées en absence de mycélium. Ces résultats montrent pour la première fois l'influence du mycélium autoclavé des agents phytopathogènes sur l'activité antagoniste et la production de fengycine/iturine chez B. subtilis. Une étude plus approfondie de l'influence du mycélium autoclavé et des composés extracellulaires des mycètes/oomycètes phytopathogènes sur B. subtilis PTB185 a par la suite été réalisée en protéomique. Le mycélium autoclavé de tous les agents phytopathogènes testés a fortement inhibé les protéines associées au métabolisme et à la biosynthèse de la thiamine chez la bactérie. Le mycélium autoclavé de Mucor sp. a fortement stimulé les protéines associées au « phage-like element PBSX » et fortement diminué celles du métabolisme et de la biosynthèse de la biotine. Les composés extracellulaires de P. ultimum ont diminué les protéines associées à la formation des flagelles et stimulé celles associées à la production de subtilosine. Le mycélium autoclavé et les composés extracellulaires de R. solani ont augmenté de façon importante les protéines associées à la synthèse de sidérophores. Les composés extracellulaires de S. sclerotiorum ont pour leur part très faiblement impacté le protéome de la bactérie. Les résultats de cette étude, en plus de témoigner de l'influence des interactions biotiques sur la production des lipopeptides, apportent des informations supplémentaires quant à l'influence de ces dernières sur la physiologie/les mécanismes de biocontrôle de B. subtilis. Enfin, cette étude offre de nouvelles perspectives pour optimiser le milieu de culture de B. subtilis à des fins biotechnologiques. / The bacterium Bacillus subtilis is considered as a promising alternative to conventional pesticides for plant disease management. The mechanisms underlying the biocontrol properties of this bacterium are multiple and are closely related to the production of lipopeptides. Currently, little is known about the influence of plant pathogenic fungi/oomycetes on B. subtilis physiology and biocontrol mechanisms. The objective of this doctoral research project was to study the influence of fungi/oomycetes on B. subtilis biocontrol mechanisms, especially on the production of lipopeptides. In the first instance, the lipopeptides produced by B. subtilis PTB185 were characterised by mass spectrometry and a method allowing the relative quantification of these compounds was developed using MALDI-TOF instrumentation. This first step displayed the capacity of strain PTB185 to produce surfactin, iturin, and fengycin. Confrontation assays conducted on agar showed that B. subtilis antagonistic activity and production of lipopeptides vary significantly (P ≤ 0.05) according to the pathogen tested. However, no correlation between lipopeptides production and B. subtilis antimicrobial activity was observed. Autoclaved mycelia of plant pathogens were also shown to significantly influence the quantities of lipopeptides produced by B. subtilis in liquid culture. Fengycin and/or iturin were produced in significantly higher amounts in presence of mycelium of Botrytis cinerea, Mucor sp., Pythium ultimum, or Rhizoctonia solani, while addition of mycelium in the medium did not significantly affect surfactin production as compared to the control. Bacteria grown in liquid medium amended with Mucor sp. mycelium caused a significantly higher reduction of mycelial growth of B. cinerea, R. solani, and Sclerotinia sclerotiorum as compared to the bacteria grown with no mycelium. These results show for the first time the influence of autoclaved plant pathogen mycelium on B. subtilis antagonistic ability and production of fengycin/iturin. The influence of autoclaved mycelia and extracellular compounds of plant pathogenic fungi/oomycetes on B. subtilis was further investigated by proteomics. Autoclaved mycelium of all tested pathogens strongly inhibited the proteins associated with B. subtilis thiamine metabolism and biosynthesis. Autoclaved mycelium of Mucor sp. strongly increased proteins associated with the phage-like element PBSX and strongly decreased those related to biotin metabolism and biosynthesis. Extracellular compounds of P. ultimum reduced proteins associated with flagellar assembly and stimulated those related to the production of subtilosin. Autoclaved mycelium and extracellular compounds of R. solani strongly increased proteins associated with the production of siderophores. Extracellular compounds of S. sclerotiorum barely affected the proteome of the bacterium. The results of this study, besides providing additional evidence of the influence of biotic interactions on lipopeptides production, give further information on the influence of the latter on B. subtilis physiology and biocontrol mechanisms. Finally, this study provides new insights into the optimisation of the culture medium to grow B. subtilis for biotechnological applications.

Les sols forestiers sont des habitats hétérogènes, véritables réservoirs de microorganismes. Parmi ces microorganismes, les eucaryotes filamenteux (champignons et oomycètes) sont très divers et jouent un rôle important dans le fonctionnement et la durabilité des écosystèmes forestiers. Leur diversité et leur répartition spatiale à différentes échelles sont encore peu connues et les facteurs qui sous-tendent cette dispersion sont encore peu étudiés. Aussi, les objectifs étaient (i) d'exploiter le séquençage haut-débit pour des études d'écologie microbienne à large échelle et valider son application aux communautés d'oomycètes pathogènes en milieu forestier, (ii) de décrire ces communautés microbiennes, en termes de diversité et de structure, à différentes échelles spatiales (locale, régionale et continentale), (iii) de caractériser les variables biotiques et abiotiques structurant ces communautés et (iv) d'évaluer la réponse éventuelle des communautés aux variations climatiques. Une première étude pilote à l'échelle de la parcelle a été suivi de deux études à grande échelle spatiale le long de gradients environnementaux. Des gradients d'altitude et un gradient latitudinal, à l'échelle continentale, ont été utilisés comme gradient climatique. L'étude préliminaire a donc validé l'utilisation du pyroséquençage pour les communautés fongiques, et en particulier pour les espèces ectomycorhiziennes, et apporté des éléments pour établir une méthodologie d'échantillonnage couplée à cette technique. L'application de ces outils moléculaires à l'étude des communautés oomycètes pathogènes reste à optimiser. Les résultats obtenus sur les communautés fongiques telluriques suggèrent que dans l'hypothèse d'un réchauffement climatique, la richesse fongique ne serait pas directement affectée mais la composition des communautés le serait. La composition des communautés fongiques est également fortement liée au pH du sol. Ces résultats sont à affiner en étudiant plus en détail divers groupes taxonomiques et écologiques en lien avec des variables climatiques plus précises. Par ailleurs, de nombreuses perspectives sont envisageables pour améliorer la détection des oomycètes dans les sols forestiers, qui reste un challenge en écologie microbienne / Forest soils are heterogeneous habitats full of microorganisms. In particular, the filamentous eukaryotes (fungi and oomycetes) exhibit a huge diversity and play essential functions in the dynamic and sustainable growth of the forest ecosystem. However, their diversity and their distribution are poorly known; thus, so are the structuring factors of these microbial communities. The main goals were: (i) use a high-throughput pyrosequencing to study soil microbial communities at a broad geographical scale, and particularly to validate its use for the study of soil forest pathogenic oomycete communities, (ii) study the diversity and structure of fungal and pathogenic oomycetes communities at several spatial scales, (iii) identify possible climatic and edaphic variables structuring these communities and (iv) estimate the possible response of these microbial communities to climatic variation. A pilot study was undertaken at the stand scale. Then, two additional studies were carried out along environmental gradients at the regional and continental scales. The use of the pyrosequencing technique was found appropriate for the fungal communities, but difficulties arose in studying the pathogenic oomycete community. At the stand scale, results suggested the soil to be a valuable substitute for the roots to access the ectomycorrhizal richness and composition using pyrosequencing. The results along the broad scale gradients suggested that fungal richness may not be affected by climate warming but that the composition would be. Moreover, our work indicated that soil pH is a major factor explaining fungal community composition. The main conclusions are still to be confirmed and deeper knowledge of the response of different fungal phylum, or family, would be required. The detection and thus the diversity estimation of the pathogenic oomycetes in forest soil remains a current challenge

Afin d’étudier l’écologie microbienne, il est nécessaire, dans un premier temps, de déterminer quels micro-organismes sont présents dans un milieu et à quel instant. Ces informations sont requises pour pouvoir ensuite développer des outils permettant de prédire l’assemblage des communautés et les fonctions que celles-ci peuvent contenir. Cependant, la multitude des processus entrant en jeu dans la structure et la composition des communautés microbiennes, rendent leur étude complexe. Parmi les nombreux processus à étudier, il est notamment question de l’échelle temporelle à prendre en compte pour comprendre l’assemblage des communautés microbiennes. En effet, les événements historiques conditionnent la composition et la biodiversité des futures communautés microbiennes. Pourtant, dans les sols, peu d’études se sont intéressées à l’impact des événements historiques dans l’assemblage des communautés microbiennes. Par conséquent, l’objectif de cette thèse était de quantifier comment les différentes histoires du sol ont influencé la structure et biodiversité des communautés bactériennes et oomycètes associées aux plantes hôtes des Brassicaceae à travers le temps. Les rotations de cultures de Brassicaceae sont de plus en plus courantes dans le monde et ont démontré des avantages pour les cultures concernées, telles que la rétention de l’humidité du sol ou la suppression de certains agents pathogènes des plantes. En revanche, l’impact des rotations de cultures de Brassicaceae sur la structure et biodiversité des communautés microbiennes résidentes est peu connu. Ainsi, des terrains agricoles des prairies canadiennes ayant des expériences de rotations de cultures en cours ont été utilisés pour modéliser l’impact des histoires de sol précédemment établies sur les futures communautés microbiennes. Les communautés microbiennes des racines, de la rhizosphère, et du sol éloigné des racines des Brassicaceae ont été étudiées grâce aux métabarcodes d’ARNr 16S ou ITS. La PCR quantitative et des méthodes phylogénétiques ont été utilisées pour améliorer l’analyse des communautés microbiennes. Cette thèse illustre comment différentes histories de sol établies par les cultures de l’année précédente ont continué à structurer les communautés microbiennes de la rhizosphère tout au long de la saison de croissance, à différents stades de croissance, jusqu’à un an après leur établissement. Cependant, le phénomène de rétroactions entre plantes et micro-organismes a permis de masquer cet héritage dans la rhizosphere de différentes espèces hôtes de Brassicacea pour lesquelles des communautés bactériennes phylogénétiquement similaires ont été retrouvées malgré diverses histoires du sol. Nos résultats montrent également que les différentes espèces hôtes de Brassicacea n’avaient pas d’impact sur la structure des communautés d’oomycètes et que le stress hydrique limitait également cette structuration pour les communautés bactériennes. Dans ces deux cas, l’effet de l’histoire du sol était donc encore visible sur la structure les communautés microbiennes durant l’année subséquente. Les découvertes selon lesquelles différentes histoires de sol persistent jusqu'à un an, même en présence de nouvelles plantes hôtes, et qu’elles peuvent continuer à façonner les communautés microbiennes ont des implications importantes pour la gestion agricole et les recherches futures sur les composants physiques de l'histoire du sol. Comprendre comment l'histoire du sol est impliquée dans la structure et la biodiversité des communautés microbiennes à travers le temps est une limitation de l'écologie microbienne et est nécessaire pour utiliser les technologies microbiennes à l'avenir pour une agriculture durable et dans toute la société. / A fundamental task of microbial ecology is determining which organisms are present, and when, in order to improve the predictive models of community assembly and functions. However, the heterogeneity of community assembly processes that underlie how microbial communities are formed and structured are makes assembly of taxonomic and functional profiles difficult. One reason for this challenge is the compounding effect temporal scales have on microbial communities. For example, historical events have been shown to condition future microbial community composition and biodiversity. Yet, how historical events structure microbial communities in the soil has not been well tested. Therefore, the objective of this thesis was to quantify how different soil histories influenced the structure and biodiversity of bacterial and oomycete communities associated with Brassicaceae host plants through time. Brassicaceae crop rotations are increasingly common globally, and have demonstrated benefits for the crops involved, such as retaining soil moisture, or suppressing certain plant pathogens. In contrast, there is a lack of knowledge surrounding how Brassicaceae crop rotations impact the structure and biodiversity of resident microbial communities. As such, on-going agricultural field experiments with crop rotations on the Canadian prairies were used to model how previously established soil histories impacted future microbial communities. The Brassicaceae microbial communities were inferred from the roots, rhizosphere and bulk soil using 16S rRNA or ITS metabarcodes. Quantitative PCR and phylogenetic methods were used to improve the analysis of the microbial communities. This thesis illustrates how different soil histories established by the previous year’s crops continued to structure the microbial rhizosphere communities throughout the growing season, at various growth stages, and up to a year after being established. However, active plant-soil microbial feedback allowed different Brassicaceae host species to mask the soil history in the rhizosphere and derive phylogenetically similar bacterial communities from these diverse soil histories. Furthermore, host plants were unable to structure the oomycete communities, and lost the ability to structure the bacterial rhizosphere communities under water stress. In both circumstances, the soil history continued to structure the microbial communities. The findings that different soil histories persist for up to a year, even in the presence of new host plants, and can continue to shape microbial communities has important implications for agricultural management and future research on the physical components of soil history. Understanding how soil history is involved in the structure and biodiversity of microbial communities through time is a limitation in microbial ecology and is required for employing microbial technologies in the future for sustainable agriculture and throughout society.

Aphanomyces euteiches est un oomycète parasite racinaire des légumineuses causant des pertes de rendement récurrentes. La paroi d'A.euteiches contient 10% de N-acétylglucosamine (NAG) sous la forme de chitosaccharides non cristallins, associés aux glucanes pariétaux. Afin de pouvoir étudier leur activité biologique, un bioessai d'élicitation du système racinaire de la plante hôte Medicago truncatula a été mis au point en utilisant une préparation de fragments de chitine comme éliciteur témoin. La purification de fractions de parois hydrolysées, enrichies en NAG, a donné des fragments de glycanes composés de glucose et de NAG. Ces hétéropolymères présentent une structure nouvelle jamais décrite à ce jour. Le bioessai d'élicitation racinaire a révélé une activité biologique des fractions de paroi différente de celle des fragments de chitine chez M.truncatula. De façon intéressante, l'une des fractions induit des oscillations calciques nucléaires dans les cellules épidermiques de cultures de racines de M.truncatula, qui sont différentes de la réponse provoquée par des chitotétramères purs.