As chaperonas moleculares são proteínas que auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células, motivo pelo qual elas têm sido alvo para o combate de várias doenças. As Hsp90 (82-96 kDa) são chaperonas abundantes que interagem com diversas proteínas-cliente. São constituídas por três domínios: N-terminal, intermediário ou central (M) e C-terminal, o qual é responsável pela dimerização da proteína. A atividade da Hsp90 está diretamente relacionada à sua atividade ATPásica. Durante o ciclo funcional, as Hsp90 podem interagir com inúmeras co-chaperonas. Uma delas é a co-chaperona p23 (18-22 kDa) que interage com o dímero da Hsp90 e algumas das suas funções são a inibição da atividade ATPásica e atividade chaperona. O objetivo do trabalho foi obter a proteína recombinante Hsp90 de Leishmania braziliensis e os domínios N e N+M, determinar fatores importantes que relacionam mudanças conformacionais e função da Hsp90 e as bases moleculares da inibição por GA. Também obter as co-chaperonas Lbp23A e Lbp23B e investigar a interação com a LbHsp90 e suas funções. As proteínas produzidas foram purificadas e caracterizadas por técnicas biofísicas. Em solução, a LbHsp90 foi caracterizada como dímero assimétrico e as demais proteínas como monômeros assimétricos.A interação da LbHsp90 e domínios com nucleotídeos foi analisada por fluorescência e as constantes de dissociação ficaram em torno de 150 µM. A afinidade por GA foi maior que a verificada para ATP e em ordem crescente para LbHsp90, LbHsp90_NM e LbHsp90_N. A LbHsp90 apresentou grande atividade chaperona em relação à citrato sintase, de maneira independente de ATP. A LbHsp90 mostrou baixa atividade ATPásica, a qual foi inibida pela GA com IC50 de 0,7 µM. Tanto a Lbp23A quanto a Lbp23B inibiram a atividade ATPásica da LbHsp90, porém a Lbp23A aproximou-se de 100% de inibição e a Lbp23B apenas 30%. A interação in vitro entre a LbHsp90 e a Lbp23B foi observada por pull-down na presença/ausência de nucleotídeos e essa técnica não se mostrou adequada para a Lbp23A.O pioneirismo do trabalho com a Hsp90/p23 de L. braziliensis oferece uma grande contribuição para futuros trabalhos que visam o entendimento das relações funcionais entre essas proteínas e o contexto das Hsp90 no desenvolvimento da leishmaniose. / Molecular chaperones are proteins involved in proper folding of other proteins, and others important cellular functions, why they have been targeted for combating various diseases. The Hsp90 (82-96 kDa) are ubiquitous chaperones that interact with a wide range of client proteins. They are formed by three domains: N-terminal, central or middle (M), and C-terminal, which is responsible by its dimerization. The Hsp90 activity is related to its ATPase activity. During the Hsp90 functional cycle, diverse co-chaperones. One of them is the p23 (18 kDa), that interacts with one Hsp90 dimer, and some p23 functions are the inhibition of Hsp90 ATPase activity and chaperone activity. The aim of this work was obtain the Hsp90 recombinant Leishmania braziliensis Hsp90, the N and N+M domains, to determine the important factors related to conformational changes and Hsp90 function, and the molecular basis of GA inhibition. Also, to obtain the Lbp23A and Lbp23B co-chaperones in order to establish relevant aspects for LbHsp90 interaction and its co-chaperones functions. The recombinant proteins were produced, purified and characterized by biophysics techniques. The LbHsp90 was identified as an asymmetric dimer for whereas the others were identified as asymmetric monomers. The interactions between LbHsp90 and domains with nucleotides were determined by fluorescence and the dissociation constants were about 150 µM. The GA-affinity was greater than ATP one, in increasing order for LbHsp90, LbHsp90_NM, and LbHsp90_N. The LbHsp90 showed large chaperone activity related to citrate synthase independently of ATP. The LbHsp90 presented low ATPase activity, which was inhibited by GA with a IC50 of 0,7. The Lbp23A and Lbp23B inhibited the ATPase activity with different values, the Lbp23A inhibition was closed to 100% whereas the Lbp23B one was 30%. The in vitro interaction between the LbHsp90 and Lbp23B was observed by pull-down, in the absence or presence of nucleotides, and for Lbp23A this technique was not appropriated. The pioneering work with Hsp90/p23 from L. braziliensis offers an important contribution to future studies aimed at understanding the functional relationships between these proteins and the context of Hsp90 in the development of leishmaniasis.

As chaperonas moleculares são ativas em muitos processos celulares envolvendo o enovelamento e a homeostase de proteínas. Essas características fazem das chaperonas alvos potenciais para o tratamento de diversas doenças. As Hsp70 e as Hsp90, em especial, são proteínas ubíquas altamente conservadas biologicamente que atuam no enovelamento de proteínas nascentes, prevenção da agregação proteica, recuperação de proteínas de agregados, sinalização e crescimento celular, dentre outros. Contudo, para que essas proteínas cumpram eficientemente suas funções, elas devem ser moduladas por co-chaperonas moleculares. A SGT é uma co-chaperona que pode ser dividida em três regiões: domínio N-terminal, domínio TPR e domínio C-terminal, sendo que a região do domínio TPR é a responsável pela interação com o motivo EEVD no C-terminal das Hsp90 e Hsp70 citoplasmáticas. A SGT é encontrada em vários organismos, dentre eles os protozoários do gênero Leishmania spp.. Estes organismos são responsáveis pela leishmaniose, uma doença negligenciada que afeta milhares de pessoas todos os anos, principalmente em países subdesenvolvidos. Evidências indicam que a SGT em protozoários é essencial para o crescimento e viabilidade da forma promastigota. Diante disso, nesse trabalho foi feito o estudo estrutural e funcional da co-chaperona SGT de Leishmania braziliensis (LbSGT). A LbSGT recombinante foi produzida e purificada. A caracterização estrutural indica que a LbSGT é uma proteína rica em estrutura secundária do tipo hélice α que se comporta como um dímero alongado em solução. Dados de estabilidade térmica e química indicam que a LbSGT é uma proteína formada por domínios com diferentes estabilidades. A LbSGT foi identificada in vivo e o western blotting indicou sua presença cognata nas formas promastigotas do protozoário. Os ensaios de interação indicam que as interações entre a LbSGT e a Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e a LbSGT e Hsp70-1A humana (usada como proteína modelo) são diferentes da interação da LbSGT com o peptídeo MEEVD. Sendo assim, esses dados sugerem que a interação da LbSGT com a Hsp70-1A e LbHsp90 envolvem mais regiões das proteínas do que somente o motivo de interação da Hsp70-1A e da LbHsp90 com o domínio TPR da LbSGT. Em conjunto, as propriedades estruturais e funcionais da LbSGT observadas estão de acordo com a possível função da SGT como proteína adaptadora entre os sistemas Hsp70 e Hsp90 no foldossoma. / The molecular chaperones are active in many cellular processes involving protein folding and homeostasis. These characteristics make the chaperones potential targets to the treatment of many diseases. Hsp70 and Hsp90, in special, are highly conserved ubiquitous proteins that act in the folding of nascent proteins, protein aggregation prevention, aggregate recovering, signaling and cellular growth, among others. However, for these proteins to effectively fulfill their function, they must be modulated by molecular co-chaperones. SGT is a co-chaperone that can be divided into three domains: a N-terminal domain, a TPR domain and a C-terminal domain, being the TPR domain responsible for the interaction with the EEVD motif at the C-terminus of cytoplasmic Hsp90 and Hsp70. SGT is found in various organisms; among they are the protozoans of Leishmania spp.. These organisms are responsible for leishmaniasis, a neglected disease that affects thousands people every year, mainly at underdeveloped countries. Evidences indicate that SGT in protozoans are essential to the growth and viability of promastigote form. Therefore, the structural and functional study of the Leishmania braziliensis SGT (LbSGT) is presented. Recombinant LbSGT was produced and purified. The structural characterization points that LbSGT is rich in α-helix secondary structure and behaves as an elongated dimer in solution. Chemical and thermal stability data suggest that LbSGT is formed by domains of different stabilities. LbSGT was identified in vivo and the western blotting indicates its cognate presence in the protozoan promastigote forms. The interaction assays show that the interaction between LbSGT and Hsp90 of L. braziliensis (LbHsp90) or human Hsp70-1A (used as model protein) were different from the interaction between LbSGT with MEEVD peptide. Moreover, these data suggests that the interaction between LbSGT and Hsp70-1A and LbHsp90 involves additional protein regions besides the Hsp70-1A and LbHsp90 interaction motif. Altogether, the observed functional and structural proprieties of LbSGT accord to the SGT possible function as an adapter protein between the Hsp70 and Hsp90 systems in the foldossome.

A Hsp70 mitocondrial humana (mtHsp70 ou mortalina) está envolvida em diversos processos celulares: na matriz mitocondrial atua na importação de proteínas produzidas no citoplasma; no citoplasma, pode atuar sequestrando a p53, estando assim envolvida na proliferação de alguns tipos de câncer. A literatura ainda aponta que a mortalina participa na manutenção de várias doenças causadas pelo envelhecimento, como mal de Parkinson e de Alzheimer. Desse modo, o estudo estrutural e a investigação das principais funções da mortalina in vivo e in vitro, além de sua interação com outras chaperonas e co-chaperonas é de grande relevância científica, podendo proporcionar um maior entendimento de seu papel celular e da maquinaria bioquímica nas doenças onde ela está inserida. Apesar de ser conhecida há bastante tempo, as tentativas de expressão heteróloga da mortalina recombinante resultam na sua produção na forma insolúvel, inviabilizando estudos estruturais e funcionas in vitro. Assim, as informações estruturais e funcionais desta proteína permaneceram limitadas até então. Em 2005, foi descrita uma co-chaperona da mortalina que atua auxiliando o seu enovelamento correto e em sua manutenção na fração solúvel, esta proteína mitocondrial foi denominada de hHep1 (Hsp70-escort protein 1) e por meio de sua co-expressão com a mortalina foi possível obter esta última na sua forma monomérica, solúvel e estável. Isso possibilitou realizar ensaios de caracterização estrutural e funcional da mortalina, sendo o foco principal deste trabalho de doutorado. Os resultados obtidos sugerem que a mortalina se apresenta como um monômero ligeiramente alongado em solução, sendo formada por 2 domínios com estabilidades distintas. Os ensaios funcionais revelaram uma constante de dissociação (KD) para interação com nucleotídeos adenosina da ordem de 1 µM. A mortalina apresenta atividade ATPásica com valores de Vmáx e KM da ordem de 0,21 pmol de ATP por min e 190 ± 20 µM, respectivamente. Este trabalho é pioneiro na caracterização estruturale funcional da mortalina humana e espera-se que estudos posteriores, elucidem mais detalhedamente os mecanismos de interação da mortalina com proteínas clientes nos diversos compartimentos celulares onde ela atua. / The human mitochondrial Hsp70 (mtHsp70 or mortalina) is involved in many cellular processes: in the mitochondrion matrix, mortalin acts in the process of protein importation from cytoplasm; in the cytoplasm may act by sequestering p53, protein involved in the proliferation of some kinds of cancer. The literature also shows that mortalin participates in the maintenance of various diseases caused by aging, such as Parkinson\'s and Alzheimer\'s. Thus, the structural study and research of the main functions of mortalin in vivo and in vitro, and its interaction with other chaperones and co-chaperones is of great scientific importance and may provide a greater understanding of their role and cellular biochemical machinery in diseases where it is inserted. Despite being known for a long time, the expression of heterologous mortalin resulted in an insoluble form of the protein, which precludes its in vitro structural and functional studies. Thus, structural and functional information of this protein, along with its interaction with chaperones, co-chaperones and client proteins, remained unknown. By 2005, it was described co-chaperone that acts on mortalin helping its correct folding and its maintenance in the soluble fraction, this mitochondrial protein was called hHep1 (Hsp70-escort protein 1) and through its co-expression with mortalin it was possible to obtain the recombinant mortalin in its monomeric, soluble and stable. With this protein, it was possible to perform tests of structural and functional characterization of recombinant mortalin, the main focus of this doctoral work. The results suggest that mortalin behaves as a slightly elongated monomer in solution, formed by two domains with different stabilities. Functional assays showed that the dissociation constant for interaction with adenosine nucleotide of the order of 1 µM. Mortalin has ATPase activity with Vmax and KM values of 0.21 pmol ATP per min and 190 ± 20 µM, respectively. It is expected that these results provide information for further studies, such as for elucidating the mechanisms that mortalin interacts with client proteins in various cellular compartments in which it operates.

As chaperonas moleculares são ativas em muitos processos celulares envolvendo o enovelamento e a homeostase de proteínas. Essas características fazem das chaperonas alvos potenciais para o tratamento de diversas doenças. As Hsp70 e as Hsp90, em especial, são proteínas ubíquas altamente conservadas biologicamente que atuam no enovelamento de proteínas nascentes, prevenção da agregação proteica, recuperação de proteínas de agregados, sinalização e crescimento celular, dentre outros. Contudo, para que essas proteínas cumpram eficientemente suas funções, elas devem ser moduladas por co-chaperonas moleculares. A SGT é uma co-chaperona que pode ser dividida em três regiões: domínio N-terminal, domínio TPR e domínio C-terminal, sendo que a região do domínio TPR é a responsável pela interação com o motivo EEVD no C-terminal das Hsp90 e Hsp70 citoplasmáticas. A SGT é encontrada em vários organismos, dentre eles os protozoários do gênero Leishmania spp.. Estes organismos são responsáveis pela leishmaniose, uma doença negligenciada que afeta milhares de pessoas todos os anos, principalmente em países subdesenvolvidos. Evidências indicam que a SGT em protozoários é essencial para o crescimento e viabilidade da forma promastigota. Diante disso, nesse trabalho foi feito o estudo estrutural e funcional da co-chaperona SGT de Leishmania braziliensis (LbSGT). A LbSGT recombinante foi produzida e purificada. A caracterização estrutural indica que a LbSGT é uma proteína rica em estrutura secundária do tipo hélice α que se comporta como um dímero alongado em solução. Dados de estabilidade térmica e química indicam que a LbSGT é uma proteína formada por domínios com diferentes estabilidades. A LbSGT foi identificada in vivo e o western blotting indicou sua presença cognata nas formas promastigotas do protozoário. Os ensaios de interação indicam que as interações entre a LbSGT e a Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e a LbSGT e Hsp70-1A humana (usada como proteína modelo) são diferentes da interação da LbSGT com o peptídeo MEEVD. Sendo assim, esses dados sugerem que a interação da LbSGT com a Hsp70-1A e LbHsp90 envolvem mais regiões das proteínas do que somente o motivo de interação da Hsp70-1A e da LbHsp90 com o domínio TPR da LbSGT. Em conjunto, as propriedades estruturais e funcionais da LbSGT observadas estão de acordo com a possível função da SGT como proteína adaptadora entre os sistemas Hsp70 e Hsp90 no foldossoma. / The molecular chaperones are active in many cellular processes involving protein folding and homeostasis. These characteristics make the chaperones potential targets to the treatment of many diseases. Hsp70 and Hsp90, in special, are highly conserved ubiquitous proteins that act in the folding of nascent proteins, protein aggregation prevention, aggregate recovering, signaling and cellular growth, among others. However, for these proteins to effectively fulfill their function, they must be modulated by molecular co-chaperones. SGT is a co-chaperone that can be divided into three domains: a N-terminal domain, a TPR domain and a C-terminal domain, being the TPR domain responsible for the interaction with the EEVD motif at the C-terminus of cytoplasmic Hsp90 and Hsp70. SGT is found in various organisms; among they are the protozoans of Leishmania spp.. These organisms are responsible for leishmaniasis, a neglected disease that affects thousands people every year, mainly at underdeveloped countries. Evidences indicate that SGT in protozoans are essential to the growth and viability of promastigote form. Therefore, the structural and functional study of the Leishmania braziliensis SGT (LbSGT) is presented. Recombinant LbSGT was produced and purified. The structural characterization points that LbSGT is rich in α-helix secondary structure and behaves as an elongated dimer in solution. Chemical and thermal stability data suggest that LbSGT is formed by domains of different stabilities. LbSGT was identified in vivo and the western blotting indicates its cognate presence in the protozoan promastigote forms. The interaction assays show that the interaction between LbSGT and Hsp90 of L. braziliensis (LbHsp90) or human Hsp70-1A (used as model protein) were different from the interaction between LbSGT with MEEVD peptide. Moreover, these data suggests that the interaction between LbSGT and Hsp70-1A and LbHsp90 involves additional protein regions besides the Hsp70-1A and LbHsp90 interaction motif. Altogether, the observed functional and structural proprieties of LbSGT accord to the SGT possible function as an adapter protein between the Hsp70 and Hsp90 systems in the foldossome.

A Hsp70 mitocondrial humana (mtHsp70 ou mortalina) está envolvida em diversos processos celulares: na matriz mitocondrial atua na importação de proteínas produzidas no citoplasma; no citoplasma, pode atuar sequestrando a p53, estando assim envolvida na proliferação de alguns tipos de câncer. A literatura ainda aponta que a mortalina participa na manutenção de várias doenças causadas pelo envelhecimento, como mal de Parkinson e de Alzheimer. Desse modo, o estudo estrutural e a investigação das principais funções da mortalina in vivo e in vitro, além de sua interação com outras chaperonas e co-chaperonas é de grande relevância científica, podendo proporcionar um maior entendimento de seu papel celular e da maquinaria bioquímica nas doenças onde ela está inserida. Apesar de ser conhecida há bastante tempo, as tentativas de expressão heteróloga da mortalina recombinante resultam na sua produção na forma insolúvel, inviabilizando estudos estruturais e funcionas in vitro. Assim, as informações estruturais e funcionais desta proteína permaneceram limitadas até então. Em 2005, foi descrita uma co-chaperona da mortalina que atua auxiliando o seu enovelamento correto e em sua manutenção na fração solúvel, esta proteína mitocondrial foi denominada de hHep1 (Hsp70-escort protein 1) e por meio de sua co-expressão com a mortalina foi possível obter esta última na sua forma monomérica, solúvel e estável. Isso possibilitou realizar ensaios de caracterização estrutural e funcional da mortalina, sendo o foco principal deste trabalho de doutorado. Os resultados obtidos sugerem que a mortalina se apresenta como um monômero ligeiramente alongado em solução, sendo formada por 2 domínios com estabilidades distintas. Os ensaios funcionais revelaram uma constante de dissociação (KD) para interação com nucleotídeos adenosina da ordem de 1 µM. A mortalina apresenta atividade ATPásica com valores de Vmáx e KM da ordem de 0,21 pmol de ATP por min e 190 ± 20 µM, respectivamente. Este trabalho é pioneiro na caracterização estruturale funcional da mortalina humana e espera-se que estudos posteriores, elucidem mais detalhedamente os mecanismos de interação da mortalina com proteínas clientes nos diversos compartimentos celulares onde ela atua. / The human mitochondrial Hsp70 (mtHsp70 or mortalina) is involved in many cellular processes: in the mitochondrion matrix, mortalin acts in the process of protein importation from cytoplasm; in the cytoplasm may act by sequestering p53, protein involved in the proliferation of some kinds of cancer. The literature also shows that mortalin participates in the maintenance of various diseases caused by aging, such as Parkinson\'s and Alzheimer\'s. Thus, the structural study and research of the main functions of mortalin in vivo and in vitro, and its interaction with other chaperones and co-chaperones is of great scientific importance and may provide a greater understanding of their role and cellular biochemical machinery in diseases where it is inserted. Despite being known for a long time, the expression of heterologous mortalin resulted in an insoluble form of the protein, which precludes its in vitro structural and functional studies. Thus, structural and functional information of this protein, along with its interaction with chaperones, co-chaperones and client proteins, remained unknown. By 2005, it was described co-chaperone that acts on mortalin helping its correct folding and its maintenance in the soluble fraction, this mitochondrial protein was called hHep1 (Hsp70-escort protein 1) and through its co-expression with mortalin it was possible to obtain the recombinant mortalin in its monomeric, soluble and stable. With this protein, it was possible to perform tests of structural and functional characterization of recombinant mortalin, the main focus of this doctoral work. The results suggest that mortalin behaves as a slightly elongated monomer in solution, formed by two domains with different stabilities. Functional assays showed that the dissociation constant for interaction with adenosine nucleotide of the order of 1 µM. Mortalin has ATPase activity with Vmax and KM values of 0.21 pmol ATP per min and 190 ± 20 µM, respectively. It is expected that these results provide information for further studies, such as for elucidating the mechanisms that mortalin interacts with client proteins in various cellular compartments in which it operates.

As chaperonas moleculares são proteínas que auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células, motivo pelo qual elas têm sido alvo para o combate de várias doenças. As Hsp90 (82-96 kDa) são chaperonas abundantes que interagem com diversas proteínas-cliente. São constituídas por três domínios: N-terminal, intermediário ou central (M) e C-terminal, o qual é responsável pela dimerização da proteína. A atividade da Hsp90 está diretamente relacionada à sua atividade ATPásica. Durante o ciclo funcional, as Hsp90 podem interagir com inúmeras co-chaperonas. Uma delas é a co-chaperona p23 (18-22 kDa) que interage com o dímero da Hsp90 e algumas das suas funções são a inibição da atividade ATPásica e atividade chaperona. O objetivo do trabalho foi obter a proteína recombinante Hsp90 de Leishmania braziliensis e os domínios N e N+M, determinar fatores importantes que relacionam mudanças conformacionais e função da Hsp90 e as bases moleculares da inibição por GA. Também obter as co-chaperonas Lbp23A e Lbp23B e investigar a interação com a LbHsp90 e suas funções. As proteínas produzidas foram purificadas e caracterizadas por técnicas biofísicas. Em solução, a LbHsp90 foi caracterizada como dímero assimétrico e as demais proteínas como monômeros assimétricos.A interação da LbHsp90 e domínios com nucleotídeos foi analisada por fluorescência e as constantes de dissociação ficaram em torno de 150 µM. A afinidade por GA foi maior que a verificada para ATP e em ordem crescente para LbHsp90, LbHsp90_NM e LbHsp90_N. A LbHsp90 apresentou grande atividade chaperona em relação à citrato sintase, de maneira independente de ATP. A LbHsp90 mostrou baixa atividade ATPásica, a qual foi inibida pela GA com IC50 de 0,7 µM. Tanto a Lbp23A quanto a Lbp23B inibiram a atividade ATPásica da LbHsp90, porém a Lbp23A aproximou-se de 100% de inibição e a Lbp23B apenas 30%. A interação in vitro entre a LbHsp90 e a Lbp23B foi observada por pull-down na presença/ausência de nucleotídeos e essa técnica não se mostrou adequada para a Lbp23A.O pioneirismo do trabalho com a Hsp90/p23 de L. braziliensis oferece uma grande contribuição para futuros trabalhos que visam o entendimento das relações funcionais entre essas proteínas e o contexto das Hsp90 no desenvolvimento da leishmaniose. / Molecular chaperones are proteins involved in proper folding of other proteins, and others important cellular functions, why they have been targeted for combating various diseases. The Hsp90 (82-96 kDa) are ubiquitous chaperones that interact with a wide range of client proteins. They are formed by three domains: N-terminal, central or middle (M), and C-terminal, which is responsible by its dimerization. The Hsp90 activity is related to its ATPase activity. During the Hsp90 functional cycle, diverse co-chaperones. One of them is the p23 (18 kDa), that interacts with one Hsp90 dimer, and some p23 functions are the inhibition of Hsp90 ATPase activity and chaperone activity. The aim of this work was obtain the Hsp90 recombinant Leishmania braziliensis Hsp90, the N and N+M domains, to determine the important factors related to conformational changes and Hsp90 function, and the molecular basis of GA inhibition. Also, to obtain the Lbp23A and Lbp23B co-chaperones in order to establish relevant aspects for LbHsp90 interaction and its co-chaperones functions. The recombinant proteins were produced, purified and characterized by biophysics techniques. The LbHsp90 was identified as an asymmetric dimer for whereas the others were identified as asymmetric monomers. The interactions between LbHsp90 and domains with nucleotides were determined by fluorescence and the dissociation constants were about 150 µM. The GA-affinity was greater than ATP one, in increasing order for LbHsp90, LbHsp90_NM, and LbHsp90_N. The LbHsp90 showed large chaperone activity related to citrate synthase independently of ATP. The LbHsp90 presented low ATPase activity, which was inhibited by GA with a IC50 of 0,7. The Lbp23A and Lbp23B inhibited the ATPase activity with different values, the Lbp23A inhibition was closed to 100% whereas the Lbp23B one was 30%. The in vitro interaction between the LbHsp90 and Lbp23B was observed by pull-down, in the absence or presence of nucleotides, and for Lbp23A this technique was not appropriated. The pioneering work with Hsp90/p23 from L. braziliensis offers an important contribution to future studies aimed at understanding the functional relationships between these proteins and the context of Hsp90 in the development of leishmaniasis.

A malária é uma doença tropical negligenciada causada por protozoários do gênero Plasmodium spp, afeta populações em mais de 100 países ao redor do globo, apresentando 219 milhões de novos casos por ano sendo, portanto, um grave problema de saúde pública. Apresenta um ciclo complexo e digenético, necessitando do mosquito vetor e do hospedeiro vertebrado para se completar - ciclo este que envolve etapas de transformação e adaptação, já que o patógeno passa por 28 formas diferentes ao longo do ciclo, além de enfrentar situações de stress térmico, no momento do contágio e durante os picos febris. Sendo assim, é necessário que o protozoário garanta sua sobrevivência e possibilite a infecção do hospedeiro. Isso é realizado com a assistência de chaperonas moleculares, proteínas estas que são superexpressas no estágio intra-eritrocitário. Uma dessas proteínas é a Hsp90, uma Heat shock protein com diferentes funções, entre elas, maturação de proteínas clientes, encaminhamento de proteínas para translocação por membranas e marcação de proteínas para degradação. Para cumprir adequadamente as diversas funções, as Hsp90 contam com o auxílio de co-chaperonas, como a Hsp70/Hsp90 Organizing Protein (Hop) que modulam sua função. A Hop é uma co-chaperona do sistema foldossoma formado pelas Hsp70 e Hsp90 citoplasmáticas e que atua como proteína adaptadora transferindo proteínas clientes da primeira para a segunda chaperona molecular. A interação da Hop com Hsp70 e Hsp90 ocorre via domínios TPR, que se ligam ao motivo EEVD presente na extremidade C-terminal de ambas as chaperonas citoplasmáticas. É encontrada em diversos organismos, incluindo Plasmodium falciparum, o agente etiológico da malária. Sendo assim, conhecer a Hop de P. falciparum (PfHop), estrutural e funcionalmente, é importante para o entendimento do funcionamento das Hsp90 e Hsp70, proteínas essenciais para a sobrevivência do patógeno e, portanto, possíveis alvos terapêuticos. A PfHop recombinante foi obtida com pureza superior a 95%. A caracterização biofísica da mesma foi feita através de diferentes técnicas. Como outras Hops, a PfHop é majoritariamente constituída por hélices alfa. Os parâmetros hidrodinâmicos determinados sugerem que a PfHop se comporta como um equilíbrio monômero-dímero quando em solução. Dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo mostram a PfHop como uma proteína dimérica e alongada. Este trabalho de dissertação de mestrado permitiu alcançar a caracterização estrutural da PfHop e com este conhecimento, espera-se avançar na caracterização funcional da mesma sobre a Hsp70 e Hsp90. / Malaria is a neglected tropical disease caused by protozoa of the genus Plasmodium spp, affects populations in more than 100 countries around the globe, presenting 219 million new cases per year and is therefore a serious public health problem. It presents a complex and digenetic cycle, necessitating the vector mosquito and the vertebrate host to complete - this cycle involves transformation and adaptation stages, since the pathogen goes through 28 different forms along the cycle, besides facing situations of thermal stress , At the time of the contagion and during the feverish peaks. Thus, it is necessary that the protozoan guarantees its survival and makes possible a host infection. This is accomplished with the assistance of molecular chaperones, proteins that are overexpressed in the intra-erythrocyte stage. A life of proteins and Hsp90, a protection of thermal shock with different functions, among them, maturation of client proteins, routing of proteins for membrane translocation and labeling of proteins for degradation. To comply properly, for example, as Hsp90 rely on the help of co-chaperones, such as Hsp70 / Hsp90 Organizing Protein (Hop) that modulate their function. The Hop is a co-chaperone system folded by Hsp70 and Hsp90 cytoplasmic and which acts as an adapter protein transferring client proteins from the first to the second molecular chaperone. The interaction of Hop with Hsp70 and Hsp90 occurs via TPR domains, which bind to the EEVD motif present at the C-terminus of both as cytoplasmic chaperones. It is found in several organisms, including Plasmodium falciparum, the etiologic agent of malaria. Therefore, knowing a Hop of P. falciparum (PfHop), structurally and functionally, is important for the understanding of the functioning of Hsp90 and Hsp70, essential proteins for a pathogen survival and, therefore, in all the therapeutic aspects. A recombinant PfHop was obtained in greater than 95% purity. The biophysical characterization by the same brand made through different techniques. As there is Hops, a PfHop is mostly constituted by alpha helices. The indicated parameters are a PfHop behaves as a monomer-dimer balance when in solution. Higher low-angle X-ray scattering data on PfHop as a dimeric and elongated protein. This work of master\'s dissertation allowed to reach a structural characterization of the PfHop and with this knowledge, it is expected to advance in the functional characterization of the same in Hsp70 and Hsp90.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / IntroduÃÃo: O cuidado prestado à mulher durante o processo de nascimento vem passando por mudanÃas com vistas à humanizaÃÃo da assistÃncia. Neste sentido, salta aos olhos à atual assistÃncia oferecida à mulher, marcada pela medicalizaÃÃo e dominaÃÃo do corpo, em detrimento do respeito ao fenÃmeno natural e fisiolÃgico do parto. O processo de nascimento consiste em momento frÃgil e vulnerÃvel, tornando imprescindÃvel a participaÃÃo do acompanhante no processo parturitivo.Objetivos: Analisar a influÃncia do apoio prestado pelo acompanhante na satisfaÃÃo de primÃparas e nas variÃveis do processo de parto e sobre os resultados maternos e neonatais, comparar os resultados maternos e neonatais acerca dos eventos do trabalho de parto e parto entre os grupos caso (com apoio por acompanhante de sua escolha) e controle (sem acompanhante) e comparar a satisfaÃÃo da parturiente com a experiÃncia do trabalho de parto e parto entre o grupo de caso e o grupo-controle. Metodologia: O estudo foi do tipo caso-controle, realizado com puÃrperas primÃparas internadas no perÃodo de maio a outubro de 2013 no alojamento conjunto da Maternidade Escola Assis Chateaubriand. O grupo caso foram puÃrperas primÃparas internadas que receberam acompanhante durante o parto e que nÃo receberam apoio durante o parto por doulas. O grupo controle foram puÃrperas primÃparas que nÃo receberam acompanhante durante a sala de parto. A coleta de dados foi realizada atravÃs de formulÃrio estruturado e formulÃrios organizados no mÃtodo auto-relato, que foram previamente testados com parturientes, e reformulados apÃs avaliaÃÃo. Foram incluÃdos na amostra 50 controles e 100 casos (total de 150 puÃrperas). Os dados foram analisados no programa estatÃstico SPSS, utilizando os testes adequados. O projeto foi aprovado pelo Comità de Ãtica em pesquisa da Maternidade Escola Assis Chateaubriand, segundo parecer de n 253671. Resultados: A amostra consta de 150 puÃrperas, das quais tinham uma idade mÃdia de 23 anos, a maioria estava entre 20 e 29 anos (64; 42,7%), era proveniente da capital (105; 70,0%), eram casadas/uniÃo estÃvel (100; 66,7%), com renda familiar de 1 a 2 salÃrios mÃnimos (60; 40,0%) e tinham atà 8 anos de estudo (67; 44,7%). Observou-se que a maioria das parturientes respondeu que o apoio do acompanhante foi muito importante (53,0%) tanto no trabalho de parto quanto tanto durante o parto (45,0%), a ajuda do companheiro foi bastante Ãtil tanto no trabalho de parto (65,0%) quanto no parto (66,0%). A presenÃa do acompanhante em sala de parto foi estatisticamente significante nas seguintes variÃveis: a presenÃa de um acompanhante durante a assistÃncia prÃ-natal (p=0,05), a duraÃÃo mÃdia do trabalho de parto das gestantes (p=0,01), a realizaÃÃo de anestesia epidural (p=0,01), a dor sentida durante o trabalho de parto (p=0,001) e parto(p=0,01), a confianÃa durante o trabalho de parto (p= 0,001) e parto(p = 0,001), o medo durante o trabalho de parto (p = 0,001), as expectativas da dor durante o trabalho de parto (p= 0,01) e parto (p= 0,02). ConclusÃo: O apoio por acompanhante escolhido pela parturiente associou-se a maior satisfaÃÃo global das parturientes com a experiÃncia do nascimento. Verifica-se, portanto, a importÃncia de garantir o direito de participaÃÃo do acompanhante durante o trabalho de parto e parto, respeitando assim a escolha de cada mulher durante o processo parturitivo.

A malária é uma doença tropical negligenciada causada por protozoários do gênero Plasmodium spp, afeta populações em mais de 100 países ao redor do globo, apresentando 219 milhões de novos casos por ano sendo, portanto, um grave problema de saúde pública. Apresenta um ciclo complexo e digenético, necessitando do mosquito vetor e do hospedeiro vertebrado para se completar - ciclo este que envolve etapas de transformação e adaptação, já que o patógeno passa por 28 formas diferentes ao longo do ciclo, além de enfrentar situações de stress térmico, no momento do contágio e durante os picos febris. Sendo assim, é necessário que o protozoário garanta sua sobrevivência e possibilite a infecção do hospedeiro. Isso é realizado com a assistência de chaperonas moleculares, proteínas estas que são superexpressas no estágio intra-eritrocitário. Uma dessas proteínas é a Hsp90, uma Heat shock protein com diferentes funções, entre elas, maturação de proteínas clientes, encaminhamento de proteínas para translocação por membranas e marcação de proteínas para degradação. Para cumprir adequadamente as diversas funções, as Hsp90 contam com o auxílio de co-chaperonas, como a Hsp70/Hsp90 Organizing Protein (Hop) que modulam sua função. A Hop é uma co-chaperona do sistema foldossoma formado pelas Hsp70 e Hsp90 citoplasmáticas e que atua como proteína adaptadora transferindo proteínas clientes da primeira para a segunda chaperona molecular. A interação da Hop com Hsp70 e Hsp90 ocorre via domínios TPR, que se ligam ao motivo EEVD presente na extremidade C-terminal de ambas as chaperonas citoplasmáticas. É encontrada em diversos organismos, incluindo Plasmodium falciparum, o agente etiológico da malária. Sendo assim, conhecer a Hop de P. falciparum (PfHop), estrutural e funcionalmente, é importante para o entendimento do funcionamento das Hsp90 e Hsp70, proteínas essenciais para a sobrevivência do patógeno e, portanto, possíveis alvos terapêuticos. A PfHop recombinante foi obtida com pureza superior a 95%. A caracterização biofísica da mesma foi feita através de diferentes técnicas. Como outras Hops, a PfHop é majoritariamente constituída por hélices alfa. Os parâmetros hidrodinâmicos determinados sugerem que a PfHop se comporta como um equilíbrio monômero-dímero quando em solução. Dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo mostram a PfHop como uma proteína dimérica e alongada. Este trabalho de dissertação de mestrado permitiu alcançar a caracterização estrutural da PfHop e com este conhecimento, espera-se avançar na caracterização funcional da mesma sobre a Hsp70 e Hsp90. / Malaria is a neglected tropical disease caused by protozoa of the genus Plasmodium spp, affects populations in more than 100 countries around the globe, presenting 219 million new cases per year and is therefore a serious public health problem. It presents a complex and digenetic cycle, necessitating the vector mosquito and the vertebrate host to complete - this cycle involves transformation and adaptation stages, since the pathogen goes through 28 different forms along the cycle, besides facing situations of thermal stress , At the time of the contagion and during the feverish peaks. Thus, it is necessary that the protozoan guarantees its survival and makes possible a host infection. This is accomplished with the assistance of molecular chaperones, proteins that are overexpressed in the intra-erythrocyte stage. A life of proteins and Hsp90, a protection of thermal shock with different functions, among them, maturation of client proteins, routing of proteins for membrane translocation and labeling of proteins for degradation. To comply properly, for example, as Hsp90 rely on the help of co-chaperones, such as Hsp70 / Hsp90 Organizing Protein (Hop) that modulate their function. The Hop is a co-chaperone system folded by Hsp70 and Hsp90 cytoplasmic and which acts as an adapter protein transferring client proteins from the first to the second molecular chaperone. The interaction of Hop with Hsp70 and Hsp90 occurs via TPR domains, which bind to the EEVD motif present at the C-terminus of both as cytoplasmic chaperones. It is found in several organisms, including Plasmodium falciparum, the etiologic agent of malaria. Therefore, knowing a Hop of P. falciparum (PfHop), structurally and functionally, is important for the understanding of the functioning of Hsp90 and Hsp70, essential proteins for a pathogen survival and, therefore, in all the therapeutic aspects. A recombinant PfHop was obtained in greater than 95% purity. The biophysical characterization by the same brand made through different techniques. As there is Hops, a PfHop is mostly constituted by alpha helices. The indicated parameters are a PfHop behaves as a monomer-dimer balance when in solution. Higher low-angle X-ray scattering data on PfHop as a dimeric and elongated protein. This work of master\'s dissertation allowed to reach a structural characterization of the PfHop and with this knowledge, it is expected to advance in the functional characterization of the same in Hsp70 and Hsp90.

mTOR is the central kinase in biochemical pathways that regulate cellular growth, protein synthesis and cell survival. Deregulation of mTOR signaling results in uncontrolled cell proliferation and hence is implicated in various cancers and autoimmune diseases. mTOR functions through two distinct signaling complexes, called mTORC1 and mTORC2. CCT is a cytosolic chaperonin that assists in folding of several protein substrates. In these studies, we have identified two components of the mTOR complexes, mLST8 and Raptor, as substrates of CCT. We have performed biochemical and signaling studies which indicate that CCT is involved in assembly and signaling of mTOR complexes by folding β-propeller domains of mLST8 and Raptor. We have also obtained high resolution structural information of the mLST8-CCT complex by cryo-EM and mass spectrometric cross-linking. Moreover, we have explored the role of PhLP1 as a co-chaperone for CCT in the assembly of mTOR complexes. Interestingly, we found that PhLP1 plays very different roles in the case of mLST8 and Raptor. While PhLP1 participate in assembly of mLST8 into mTOR complexes, it facilitates degradation of Raptor. These biochemical data, combined with structural information, can be used to design small molecules that modulate mTOR signaling by affecting the formation of intact mTOR complexes.