Memoria para optar el título de Bioquímico / La chirimoya (Annona cherimola Mill.) es uno de los candidatos más atractivos para su procesamiento por corte fresco en la nueva industria alimenticia. Sin embargo, este fruto presenta una marcada tendencia al pardeamiento, proceso en el que se ha descrito estar involucrada la enzima polifenol oxidasa (PPO). Resultados recientes nos han permitido definir la secuencia génica completa responsable de la síntesis de PPO en chirimoyas (Acppo). La proteína deducida desde esta secuencia (AcPPO) presentó dos codones de inicio candidatos (ATG), lo que llevó a un complejo análisis bioinformático sobre el significado de los aminoácidos encontrados en el extremo N-terminal de la proteína predicha. En este trabajo, se describe un análisis funcional detallado de las secuencias N-terminal de AcPPO y su importancia en los eventos post-traduccionales relacionados a la destinación sub-celular final de la proteína propuesta. Se fusionaron al gen reportero GFP, las dos zonas candidatas a señal (definidas por estas metioninas) encontradas en el extremo N-terminal de AcPPO, junto con la secuencia completa y los respectivos controles. Las construcciones desarrolladas se evaluaron por transformación vía Agrobacterium tumefaciens e infiltración de plantas de Nicotiana tabacum, para evaluar la emisión de fluorescencia debido a GFP a través de microscopía confocal. Los resultados indicaron que, efectivamente, el péptido definido como N-terminal de AcPPO posee la propiedad de dirigir GFP (y por lo tanto PPO) hacia cloroplastos, determinándose la existencia de una secuencia mínima necesaria para que esto ocurra (péptido CLORO). Esto demuestra experimentalmente, la idea previa de que AcPPO es destinada hacia cloroplasto / Cherimoya (Annona cherimola Mill.) fruit is an attractive candidate for food processing applications as fresh cut. However, it has a marked susceptibility to browning and this condition is mainly attributed to polyphenol oxidase activity (PPO). Recent work has allowed us the cloning, sequencing and experimental analysis of the full length Acppo gene. The predicted protein (AcPPO) presented two candidates ATG starting codons, generating a complex N-terminal analysis about the real compartmentalization of the enzyme by simple bionformatic processing of the sequences. A detailed functional analysis of the post-translational events involved in the final AcPPO sorting and cell distribution, was carried out by fusion of the two putative N-terminal signals found in AcPPO, to the green fluorescent protein (GFP) gene. Constructs either with the full-length (first ATG) or the second-half (second ATG) segment of the N-terminal peptide, were separately studied in transient expression assays. Agrobacterium tumefaciens infections with clones harboring these constructs on Nicotiana tabacum leaves were then evaluated by confocal microscopy. The existence of a minimal sequence in this N-terminal segment of the gene needed to direct AcPPO into chloroplasts was well established, supporting the idea that the cloned gene generates a protein that is sorted into these organelles

Se realizó una investigación en el marco del desarrollo de tecnologías que permitan prolongar el período de postcosecha de frutos de chirimoya que presentan elevada perecibilidad. Esta investigación tuvo como objetivo determinar la efectividad del inhibidor de la acción de etileno 1-metil-ciclopropeno (1-MCP) y del inhibidor de síntesis de etileno amino-etoxi-vinilglicina (AVG) para inducir retardo de madurez y senescencia en frutos de chirimoya var. Concha Lisa.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Durante la maduración de los frutos, existen cambios a nivel fisiológico y bioquímico, como son: variaciones en la respiración, textura, color y acidez; como consecuencia de la remodelación de la pared celular, síntesis y degradación de pigmentos y variaciones en la acumulación de azúcares y ácidos orgánicos. Los dos últimos, son utilizados por las células vegetales como sustratos respiratorios, y particularmente los ácidos orgánicos como el ácido cítrico y málico tienden a ser degradados a lo largo de la maduración. En contraposición a lo anterior, estudios previos realizados en nuestro laboratorio en frutos de Annona cherimola var. Concha Lisa, se encontró mayores niveles de ácido cítrico, mayor actividad citrato sintasa y una mayor acumulación de transcrito codificante para la enzima citrato sintasa (CS) en el estado de madurez de consumo en comparación con el estado analizado en cosecha. Considerando lo anterior, la enzima CS parece tener un rol importante en la acumulación de citrato en frutos de chirimoya. Como una primera aproximación al estudio de su posible función, este seminario de título tiene por objetivo general caracterizar Ac-mCS mediante su localización subcelular en N. tabacum y la transformación estable de S. lycopersicum, a través de dos estrategias enfocadas en la expresión heteróloga de la enzima mCS de A. cherimola var. Concha lisa. Se observó mediante microscopía confocal, que la enzima Ac-mCS posee localización mitocrondial en hojas de Nicotiana tabacum. Por otro lado, para la transformación de tomate se construyeron y utilizaron dos vectores para la expresión heterologa de Ac-mCS bajo el control del promotor CaMV 35S y de un fragmento del promotor de poligalacturonasa de tomate (PG), sometiéndose los explantes de tomate a la transformación y organogénesis somática, pero sin lograr obtener plantas transgénicas adultas. / During fruit ripening, biochemichal and phisiological changes occur, such as variations in respitarory rate, texture, colour, and acidity; as a consequence of the cell wall remodelation, pigments synthesis and degradation, and variations in the accumulation of sugar and organic acids. The latter ones, are vegetable cell metabolic substrates, and particularly organic acids such as citric and malic acid, tend to be degraded during ripening. However, previous studies held in our laboratory in Annona cheriloma cv Concha Lisa fruits, showed increased levels in citric acid, increased citrate synthase activity and large mitochondrial citrate synthase (Ac-mCS) transcript accumulation at consumption maturity compared to the analyses performed at harverst. Considering all these points, citrate synthase seems to account for an important role in the citrate accumulation in cherimola fruit. As a first approach to the potential function of this enzyme, the main objective of this work was to characterize Ac-mCS by subcellular localization in N. tabacum, and stable transformation of S. lycopersicum, using two strategies, both of them focused in the mCS enzyme heterologue expression from A. cherimola cv. Concha lisa. Confocal microscopy in Nicotiana tabacum leaves revealed that the Ac-mCS enzyme has a mitochondrial localization. On the other hand, two expression vectors were built and used to express Ac-mCS under the transcriptional control of the CaMV 35S promoter or the tomato polygalacturonase promoter fragment (PG).Tomato explants were, subjected to the transformation process, and somatic organogenesys, but no adult transgenic plants were obtained.