Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 117-153. Publié aussi en version électronique.

Les petites protéines de choc thermique (sHsps : small heat shock proteins) sont présentes en nombre variable dans tous les organismes. Le génome de Drosophila melanogaster encode 12 sHsps, avec une expression au cours de développement, une localisation intracellulaire et une spécificité de substrats différents. DmHsp27 est l’une des rares sHsps à avoir une localisation nucléaire avant et après un choc thermique. Cette localisation nucléaire est inhabituelle, d’autant plus qu’aucune fonction spécifique de cette protéine n’a encore été identifiée. Les mécanismes responsables de la localisation nucléaire de DmHsp27 ainsi que sa probable fonction dans le noyau restent peu connus. L’étude des orthologues de DmHsp27 chez les insectes a permis de déterminer que la localisation nucléaire n’est pas spécifique à DmHsp27 et d’autres sHsps chez les insectes présentent le même signal de localisation nucléaire que DmHsp27. Le réseau d’interaction de DmHsp27 nous laisse croire que cette protéine ne joue pas seulement le rôle de chaperon moléculaire, mais qu’elle est probablement impliquée dans différents processus nucléaires. Au niveau structurel, contrairement aux sHsps chez les métazoaires, DmHsp27 forme deux populations d'oligomères non en équilibre. Des mutations indépendantes de trois arginines hautement conservées au niveau du domaine alpha-cristallin (R122, R131 et R135) à la glycine affectent l’oligomérisation par formation d’une seule population de grand poids moléculaire. In vitro, l'activité de chaperon de DmHsp27WT est comparable à celle de ses deux populations isolées et à celle des mutants R122G, R131G et R135G utilisant la luciférase comme substrat. Cependant, dans un essai de protection contre l’aggrégation de l’insuline, l'activité de chaperon de DmHsp27 est inférieure à celle des mutants R122G et R131G. Une stratégie de délétion et mutation a été utilsée pour étudier le rôle de la région N-terminale sur l’oligomérisation et la fonction chaperon de DmHsp27. Tel que déterminé par chromatographie d'exclusion et gel natif, des mutations au niveau de F29, G30 et G32 présentent des structures oligomériques différentes de celle du type sauvage. Aucun de ces mutants sauf l'élimination complète de la région N-terminale n’a montré une perte d'activité chaperon, suggérant un rôle important dans la reconnaissance et liaison de substrat. Étonnamment, les deux glycines (G30 et G32) conservées chez les orthologues de DmHsp27 agissent comme régulateurs négatifs de l'activité chaperon; leurs mutations améliorent grandement la prévention d’agrégation d’insuline. La différence du rendement de la protéine sauvage et des mutants G30R et G32R à prévenir l’agrégation de l’insuline à 20 °C et à 42 °C a permis d’établir un lien entre la structure et la fonction chaperon de DmHsp27 et de définir le mode d’action de DmHsp27 suite au stress thermique. En résumé, cette étude a permis de caractériser DmHsp27 et ses mutants au niveau du domaine alpha cristallin et de la région N-terminale et a donné un aperçu d’un nouveau mécanisme de protection contre l’agrégation des sHsps. Le rôle de chaperon moléculaire joué par DmHsp27 et son induction durant le développement embryonnaire laisse cependant présumer que cette protéine remplit d’autres fonctions cellulaires importantes. / Small heat shock proteins are present in varying numbers in all organisms. In Drosophila melanogaster there are 12 sHsps, which have distinctive developmental expression patterns, intracellular localizations and substrate specificities. DmHsp27 is one of the very few sHsps that have a nuclear localization before and after heat shock. This nuclear localization is unusual, especially since no specific function has yet been identified. The mechanisms responsible for the nuclear localization of DmHsp27 and its function in the nucleus remain poorly understood. First, the study of DmHsp27 orthologs helped to determine that nuclear localization is not specific to DmHsp27 and other sHsps in insects have the same nuclear localization signal as DmHsp27. The DmHsp27 interaction network leads to believe that this protein does not only play the role of chaperone, but it is also involved in various nuclear processes. Second, unlike metazoan sHsps, DmHsp27 forms two populations of oligomers not in equilibrium. Mutations of highly conserved arginine residues in the ACD domain in mammalian sHsps has been reported to be associated with protein conformational defects and intracellular aggregation. Independent mutation of three highly conserved arginines (R122, R131 and R135) to glycine in DmHsp27 results in only one population of higher molecular weight form. In vitro, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was comparable with that of its two isolated populations and to the single population of the R122G, R131G and R135G using luciferase as substrate. However, using insulin, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was lower than that of R122G and R131G mutants. Finaly, we established the importance of the N-terminal region for oligomerization and we investigated the heat activation under in vitro experimental conditions using size exclusion chromatography and gradient native gels electrophoresis. By deletion strategy, we have examined the role of the N-terminal region and delineated a motif (FGFG) important for the oligomeric structure and chaperone-like activity of this sHsp. Deletion of the full N-terminal domain, resulted in total loss of chaperon-like activity; intriguingly deletion of the (FGFG) at position 29 to 32 or single mutation of G30R and G32R enhanced oligomerization and chaperoning capacity under non heat shock conditions using the insulin assay suggesting the importance of this site for chaperone activity. Unlike mammalian sHsps heat activation of DmHsp27 leads to enhanced dissociation/association of oligomers to form large structures about 1000 kDa. We suggest a new mechanism of heat activation for DmHsp27. In summary, this study characterized DmHsp27 and mutant in the alpha crystallin domain and the N-terminal region and provided an overview of a new protection mechanism. The role played by DmHsp27 as molecular chaperone and its induction during embryonic development, suggest that this protein may perform other important cellular functions

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Titre de l'écran-titre (visionné le 25 mars 2009). Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 61-76. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 57-73. Publié aussi en version électronique.

Les petites protéines de stress/Small heat shock proteins (sHsps) sont des chaperons moléculaires ATP-indépendants ubiquitaires retrouvées chez les procaryotes et eucaryotes. Elles sont dynamiques structurellement et la majorité d’entre elles possèdent la capacité de former de gros complexes oligomériques. Également, elles protègent les cellules du stress protéotoxique causé par divers facteurs de stress abiotiques en prévenant l’agrégation des protéines dénaturées et en promouvant leur repliement par les chaperons moléculaires ATP dépendants tels que Hsp70/DnaK. Récemment, la présence de gènes de sHsp (HspSP-ShM2) chez des virus marins et plus précisément chez des cyanophages infectant le genre Synechococcus sp. et Prochlorococcus sp ont été caractérisés in silico. Au niveau de sa séquence, la sHsp de 18 kDa de Synechococcus sp. montre un domaine alpha crystallin de 92 acides aminés hautement conservé au sein des sHsps, une région C-terminale contenant le motif CAM canonique de type (L-X-I/L/V) et une région N-terminale relativement courte. Nous avons établi grâce à la chromatographie par exclusion stérique (SEC) et le système de Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) sa capacité à former des complexes oligomériques de haut poids moléculaires (600 kDa et 200kDa). De plus, nous avons démontré qu’elle prévient l’agrégation de la citrate synthase, la malate dehydrogenase et la luciférase en condition de stress thermique suggérant qu’elle possède une faible spécificité et un large spectre de protéines clientes/substrats. La prévention complète de l’agrégation a été obtenue à différents ratios (sHsp:substrat) selon le substrat, ce qui indique qu’il y aurait possiblement des interactions différentes et uniques avec chacun d’eux. Nous avons ensuite mis en évidence la formation d’hétéro-oligomères stables et solubles entre HspSP-ShM2 et son substrat dans les mêmes conditions, ce qui est en accord avec les caractéristiques des sHsps en général. Quant à elle, la sHsp de la cyanobactérie Synechococcus WH7803 (HspS-WH7803) possède un poids moléculaire de 15 kDa et montre une capacité à former des tétramères (60 kDa) sur essai de SEC par FPLC en présence de Triton™X-100 pour le maintien de sa solubilité. Contrairement à HspS-ShM2, HspS-WH7803 ne démontre aucune activité protectrice sur l’agrégation des substrats mentionnés précédement à différents ratios molaires. Finalement, des analyses par SEC/FPLC suggèrent la formation de complexes hétéro-oligomériques entre HspSP-ShM2 et celle de son hôte, HspS-WH7803 de Synechococcus WH7803. Cette interaction entre les sHsps pourrait soit optimiser ou inhiber l’activité de chaperon moléculaire et la réponse au stress de son hôte dans le but de favoriser le cycle viral. / Small heat shock proteins (sHsps) are ubiquitous ATP-independent molecular chaperones found in prokaryotes and eukaryotes. They are structurally dynamic and most of them have the ability to form large oligomeric complexes and to protect cells from proteotoxic stresses by preventing aggregation of non-native proteins and promoting their refolding via ATP-dependent chaperones such as Hsp70/DnaK. Recently, the presence of a sHsp gene (HspSP-ShM2) in marine viruses has been reported using bioinformatics tools. More precisely, the gene has been found in cyanophages infecting cyanobacteria of the genre Synechococcus sp. and Prochlorococcus sp. The Synechococcus phage sHSP has a MW of 18 kDa and shows the highly conserved core alpha crystalline domain of 92 amino acids and relatively short N- and C-terminal arms, the later containing the classical CAM domain (L-X-I/L/V). We established its oligomeric profile using a size exclusion chromatography (SEC) and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system and demonstrated its ability to form large oligomeric complexes in native conditions (600 kDa and 200kDa). Furthermore, we report its capacity to prevent the aggregation of citrate synthase, malate dehydrogenase and luciferase suggesting that it has a weak specificity and wide range of protein substrates. The complete prevention of aggregation was achieved at different ratios (sHsp:substrate) depending on the substrate indicating that the sHSP may have different and unique interactions with each of its clients. We also showed the formation of a stable and soluble hetero-oligomeric complex of the phage sHSP and its substrates under heat stress, which is in accordance with the characteristics of sHSP in general. The cyanobacteria Synechococcus WH7803 15 kDa sHSP (HspS-WH7803) shows the ability to form tetramers in the presence of Triton™X-100 for the maintenance of its solubility using the SEC/FPLC method. For its capability to prevent the aggregation of different substrates, HspS-WH7803 demonstrates no chaperon like activity in all the assays and molar ratios used. Finally, SEC/FPLC results indicate the possible formation of a hetero-oligomeric complex between the sHSP of the phage and the one from its host Synechococcus WH7803 (HspS-WH7803). This interaction could either optimize the chaperone activity and the stress response of its host or inhibit the host sHSP to facilitate the viral life cycle.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 144-172. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 91-111. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1998. / Bibliogr.: f. 139-153. Publié aussi en version électronique.