Thèse (M.Sc.) -- Univesité Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 53-68. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 95-124. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Un jet d’azote à basse température et généré à haute pression est utilisé pour le décapage et le traitement de surfaces. Ce procédé est en cours de développement. Il se présente comme une écotechnologie au regard des procédés de décapage conventionnels. L’interaction jet/matière impactée dépend de nombreux paramètres : paramètres liés à la formation et à la nature physique du jet d’une part, paramètres mécaniques et thermiques de la cible d’autre part. Ces différents éléments se composent pour produire une grande variété de modes d’endommagement (rupture par clivage, fissuration, écaillage, fragmentation des grains, expansion de cavités, déformation plastique et rupture ductile). Pour comprendre les mécanismes physiques responsables de ces diverses formes d’endommagement, une étude expérimentale sur quatre matériaux métalliques est présentée. Cette étude a montré que le choc thermo-mécanique et l’effet de souffle dus à l’impact du jet peuvent expliquer la superposition de plusieurs modes d’endommagement dans le même test. Le mécanisme d’endommagement principal est la décohésion du matériau due aux contraintes thermo-élastiques de traction engendrées par le choc thermique. La fragmentation des grains et le transport ultrarapide de l'azote dans une couche profonde sous la surface impactée et leurs relations avec le durcissement de la couche superficielle sont explorés dans le cas de l’acier E24. Les résultats suggèrent qu'un tel traitement de surface pourrait être efficace pour le durcissement du matériau / Nitrogen jets have been used recently for matter removal as well as surface treatment. The process consists in projecting onto a surface a low temperature jet obtained from releasing the liquid nitrogen stored in a high pressure tank through a nozzle. This work is aimed at understanding the highly complex jet/material surface interaction mechanisms. Depending on the impacted material, the thermo-mechanical shock and blast effect induced by the jet can activate a wide range of damage mechanisms, including cleavage, crack nucleation and spalling, as well as plastic deformation, void expansion and localized ductile failure. The test parameters (standoff distance, dwell time, operating pressure) play a role in selecting the dominant damage mechanism, but combinations of these various modes are usually present. The main damage mechanism is the decohesion of the material due to thermo-elastic stress generated by the thermal shock. The fragmentation of grains and high-speed transport of nitrogen in a deep layer below the impacted surface and their relationship with the hardening of a surface layer are explored in the case of the steel E24. The results suggest that such surface treatment may be effective for the hardening of the material surface

Les protéines de choc thermique (HSP) jouent un rôle crucial dans le maintien de l’intégrité du protéome et le contrôle de qualité des protéines. BCL-2-associated athanogene 3 (BAG3) est un co-chaperon moléculaire particulier qui peut s’associer avec différents systèmes d’HSPs : les chaperons HSPA (HSC/HSP70) et HSPB, en particulier HSPB8. Bien que l’implication des HSPA dans les fonctions de BAG3 associées au contrôle de qualité soit caractérisée, le rôle d’HSPB8 demeure incompris. Ainsi l’objectif de cette thèse est de préciser l’implication d’HSPB8 dans le contexte du stress protéotoxique engendré par l’inhibition du protéasome qui conduit à la séquestration des protéines polyubiquitinées à l’agrésome et à leur dégradation par autophagie. Nous avons mis en évidence un rôle précoce d’HSPB8 dans la séquestration des protéines ubiquitinées, qui ne semble pas requérir sa liaison à BAG3 mais qui potentialiserait la formation de l’agrésome. Nos résultats suggèrent qu’HSPB8 favorise des modifications post-traductionnelles sur p62/SQSTM1, dont la phosphorylation sur la sérine 349, et son couplage au co-chaperon BAG3. Cela faciliterait la formation de micro-agrégats cytoplasmiques et de l’agrésome ainsi que l’activation de la voie de signalisation protectrice Nrf2 suite à la séquestration de la protéine adaptatrice Keap1. De plus, nous avons mis en évidence une déstabilisation des interactions entre BAG3, HSPB8 et p62/SQSTM1 avec le mutant BAG3 (P209L) dont la mutation est localisée sur un des motifs de liaison à HSPB8. L’expression de ce mutant s’accompagne d’une diminution de l’activation de la voie Nrf2 en réponse au stress qui pourrait contribuer au mécanisme pathologique dans les myopathies associées à cette mutation. Enfin, une analyse dynamique de la disparition de l’agrésome suggère que son élimination requiert une étape de désagrégation qui serait suivie par sa dégradation par voie autophagique. Nous avons montré un rôle de BAG3 dans la disparition de cette structure suggérant que le co-chaperon agit via sa fonction dans l’autophagie. En revanche, HSPB8 ne semble pas participer pas à cette activité de dégradation de l’agrésome, et pourrait au contraire l’inhiber. Ainsi, cette étude met en évidence un nouveau rôle d’HSPB8 dans la séquestration précoce de protéines dénaturées, grâce à laquelle HSPB8 pourrait participer à la formation d’une plateforme facilitant la signalisation aux voies de stress. HSPB8 coopère avec BAG3 au ciblage des protéines dénaturées à l’agrésome, en vue de leur dégradation par autophagie, en favorisant notamment le couplage de BAG3 à un de ses partenaires clé, l’adaptateur autophagique p62/SQSTM1. De plus, le complexe HSPB8-BAG3 prend part à l’activation de voies de signalisation protectrice en réponse au stress ce qui pourrait avoir des implications dans les maladies musculaires associées aux mutations de BAG3 ainsi que dans le contexte du cancer. / Heat shock protein (HSP) play crucial role in the maintenance of the proteome integrity and in protein quality control. BCL-2-associated athanogene 3 (BAG3) is a unique co-chaperone that interacts with different systems of chaperones, including the HSPA (HSC/HSP70) and HSPB families, in particular HSPB8. While the role of HSPA chaperones in BAG3-related functions in protein quality control has been well characterized, the exact contribution of HSPB8 remains incompletely understood. The objective of this thesis is to characterize HSPB8 function in BAG3-related activities in the context of cellular stress in response to proteasome inhibition, which lead to the sequestration of polyubiquitinated protein in a quality control deposit through the aggresome-autophagy pathway and in which BAG3 has previously been involved. Here we have discovered an early function of HSPB8 in response to stress that contributes to the controlled aggregation of polyubiquitinated proteins in a BAG3-independent manner, but that would facilitate efficient targeting of polyubiquitinated protein aggregates to the aggresome, which is BAG3-dependent. Our results suggest that HSPB8 functions in part, by modulating p62/SQSTM1 molecular assemblies and facilitating their coupling to BAG3. This, in turn, would promote microaggregate and aggresome formation and signaling to an important arm of the oxidative defense regulated by Nrf2. Besides, a BAG3 (P209L) mutant, located within an HSPB8-binding motif, appears to disturb the association between BAG3 and p62/SQSTM1, leading to down-modulation of stress-induced Nrf2 activation, a process that could contribute to the development of severe myofibrillar myopathies. Moreover, analyses of the dynamic of aggresome clearance during the recovery period suggest that it involves a first step of disaggregation followed by its catabolic degradation. We found that while BAG3 would contribute to aggresome clearance by a mechanism involving its autophagic function, HSPB8 appeared not to be involved and could rather slow down the process. In conclusion, this thesis highlight a novel role for HSPB8 in the spatial sequestration of harmful proteins, which could provide a platform to cross talk with stress signaling pathways. HSPB8 would uniquely cooperate with BAG3 in the targeting of microaggregates to the aggresome-autophagy pathway, in part, by favoring the coupling of BAG3 to the stress sensor p62/SQSTM1. Furthermore, this work has uncovered a novel role for the HSPB8-BAG3 chaperone complex in mounting of an efficient stress response, which may have implications in BAG3-related diseases, including myofibrillar myopathy and cancer.

Les petites protéines de choc thermique (sHsps) ont été découvertes initialement chez Drosophila. Les membres de cette famille sont des chaperons moléculaires sont présentsdans la plupart des organismes eucaryotes et procaryotes et certains virus. En plus d’être induites en réponse à la plupart des stresseurs dont un choc thermique, elles sont également exprimés en absence de stress. Les sHsps forment des structures dynamiques s'assemblant en oligomères et elles sont essentielles durant les conditions de stress en empêchant l'agrégation des protéines dénaturées et en favorisant leur repliement par des chaperons moléculaires dépendants de l'ATP. Le génome de Drosophila melanogastercode pour 12 sHsp, qui ont des profils d'expression développementaux, des localisations intracellulaires diverses et des spécificités de substrats distincts. DmHsp22 est jusqu'à présent la seule sHsp localisée dans les mitochondries avant et après un choc thermique. Elle est préférentiellement régulée lors du vieillissement et en réponse à la chaleur et aux stress oxydants. La surexpression de DmHsp22 augmente la durée de vie et la résistance au stress et sa régulation négative est préjudiciable. C'est un chaperon efficace, qui pourrait être impliqué dans la réponse mitochondriale au dépliement protéique (UPRMT). Cependant, le mécanisme exact de son action est mal compris. Structurellement, DmHsp22 forme une population d'oligomères semblable aux nombreux sHsps de métazoaires et différente deDmHsp27. L'alignement des séquences de la région ACDde DmHsp22 avec des sHsp de drosophile et d'autres organismes a démontré la présence de trois résidus d'arginine hautement conservés dans ce domaine. Une forte conservationde ces résidus suggère leur implication possible dans la structure et la fonction de DmHsp22. La substitution des résidus d'arginine hautement conservés dans les sHsps de mammifères est associée à certaines pathogenèses et déclenche des changements de conformation des protéines ainsi que l'agrégation des protéines intracellulaires. La mutation de l'arginine en glycine au niveau de trois résidus hautement conservés d'ACD dans DmHsp22 (R105, R109, R110) résulte en une population oligomérique qui, dans le cas de R110G, perturbe la structure et provoque la formation de petits oligomères. Bien que DmHsp22 ainsi que les mutants aient été caractérisés comme des chaperons efficaces in vitro, les mécanismes d'action exacts dans les mitochondries et l'information sur le comportement protecteur nécessitent la détermination du réseau d’interaction in vivo. Nous avons utilisé la technique capture d’immunoaffinité (CIA) pour récupérer 60 protéines qui interagissent spécifiquement avec DmHsp22 in vivo pendant le traitement normal et thermique, dans le surnageant des cellules de mammifères exprimant la DmHsp22. L’CIA effectuée sur la fraction mitochondriale a permis d’identifies 39 protéines qui interagissent spécifiquement avec DmHsp22. La combinaison de l’IAC avec l'analyse par spectroscopie de masse de mitochondries de cellules HeLa transfectées avec DmHsp22 a conduit à l'identification de partenaires de liaison à DmHsp22 dans des conditions de normales et de choc thermique. L'interaction entre DmHsp22 et deux autres chaperons mitochondriaux a été validée par immunobuvardage. Notre approche a montré que les cellules HeLa exprimant DmHsp22 augmentent la consommation d'oxygène mitochondrial et les teneurs en ATP, ce qui confère un nouveau rôle à DmHsp22 dans les mitochondries. En outre, l'activité d’une luciférase exogène a légèrement augmenté dans les cellules HeLa exprimant DmHsp22 après que l'activité enzymatique ait été réduite à la suite de l'exposition à la chaleur. En résumé, ce projet a permis de caractériser la structure oligomérique de DmHsp22 et un certain nombre de mutants dans le domaine alpha cristallin tout en fournissant un rôle potentiel mécanistique dans l’homéostase mitochondriale. La détermination du réseau mitochondrial de DmHsp22 suggère son importance dans cette organelle non seulement en tant que chaperon moléculaire, mais aussi en tant que protéine impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires significatives. / The small heat shock proteins (sHsps) were first discovered in Drosophila. Members of this family are molecular chaperones and are present in most eukaryotic and prokaryotic. Although, they are induced in response to most of the stressors including heat shock, they are also expressed in absence of stress. SHsps for mdynamic structures that assemble into oligomers which are essential during stress conditions by preventing aggregation of denatured proteins and promoting their folding by ATP dependent molecular chaperones. Drosophila melanogaster genome encodes 12 sHsps, that have developmental expression patterns, diverse intracellular localizations and distinct substrate specificities. DmHsp22 is up to now the only sHsp localized in mitochondria before and after heat shock. It is preferentially regulated during ageing and in response to heat and oxidative stresses. Over-expression of DmHsp22 increases lifespan and resistance to stress and its down-regulation is detrimental. It is an efficient chaperone and could be involved in the mitochondrial unfolding protein response (UPRMT). However, the exact mechanism of its action is poorly understood. Structurally, DmHsp22 forms one population of oligomers similar to the many metazoan sHsps but DmHsp27. Sequence alignment of DmHsp22 with sHsps in Drosophilaand other organisms at the alpha crystalline domain (ACD) region demonstrated the presence of three highly conserved arginine residues in this domain. Strong conservation of these residues suggest their possible involvement in structure and function of DmHsp22. Substitution of highly conserved arginine residues in mammalian sHsps is associated with some pathogenesis and triggers protein conformational changes as well as intracellular protein aggregation. Mutation of arginine to glycine at three highly conserved residues of ACD in DmHsp22 (R105, R109, R110) results in one oligomeric population as well which in the case of R110G disrupts the structure and causes formation of smaller oligomers. Although DmHsp22 as well as mutants have been characterized as effective in vitro chaperones, the exact mechanism(s) of action in mitochondria and information about protective behavior requires defining of in vivoprotein interacting network. We have used immunoaffinity conjugation (IAC) technique to recover 60 proteins that specifically interact with DmHsp22 in vivo during normal and heat treatment using cell extract of mammalian cells expressing DmHsp22. The IAC performed on mitochondrial fraction identified 39 proteins that specifically interact with DmHsp22. Combination of IAC with mass spectroscopy analysis of mitochondria of HeLa cells transfected with DmHsp22 resulted in identification of DmHsp22-binding partners under normal andunder heat shock conditions. Interaction between DmHsp22 and two other mitochondrial chaperones was validated by immunoblotting. Our approach showed that HeLa cells expressing DmHsp22 increase maximal mitochondrial oxygen consumption and ATP contents which provides a new mechanistic role for DmHsp22 in mitochondria. Further more, exogenous luciferase activity slightly increased in HeLa cells expressing DmHsp22 after the enzyme activity reduced as a result of exposure to heat. In summary, this project has characterized the oligomeric structure of DmHsp22 and a number of mutants inthe alpha crystalline domain while providing a potential mechanistic role in mitochondrial homeostasis. Determining mitochondrial network of DmHsp22 suggest its importance in this organelle not only as a molecular chaperone but also as a protein involved in several significant cellular functions.

La petite protéine de choc thermique Hsp27 chez Drosophila melanogaster est localisée au noyau. Dans le but d'identifier la séquence peptidique responsable de cette localisation, la mutagenèse dirigée d'un signal potentiel de localisation nucléaire bipartite situé entre les acides aminés 42 et 59 a été effectuée, et les vecteurs obtenus ont été transfectés dans des cellules de mammifères HeLa. Il s'est avéré que la mutation des arginines 54, 55 et 56 de la protéine occasionne une diminution importante de la localisation nucléaire, bien qu'on observe toujours des résidus nucléaires localisés au niveau de structures granulaires. La localisation au niveau de structures granulaires est également observée avec la protéine sauvage. Des analyses avec des marqueurs de corps nucléaires ont donc été effectuées afin de déterminer si ces granules contenant Hsp27 correspondaient à des corps nucléaires connus. Il a été observé que la protéine colocalise avec le facteur d'épissage SC35 au niveau des "speckles" nucléaires. Ces observations s'avéreront utiles dans l'identification de fonctions pour la protéine Hsp27.

Une faible exposition à des stress tels qu'un choc thermique, du stress oxydatif ou des radiations peut induire une réponse adaptative qui permet aux cellules et aux organismes qu'elles constituent de continuer à fonctionner normalement lorsqu'ils sont confrontés à un stimulus négatif. Ces réponses adaptatives impliquent de nombreux changements dans l'expression de gènes et de protéines, dont l'induction de défenses cellulaires (antioxydants, protéines de choc thermique (heat shock proteins (Hsps)), etc.) qui permettront à la cellule de survivre. Si une réponse adaptative ne parvient pas à contrer les effets de l'exposition au stress, les cellules sont éliminés via des processus de mort cellulaire comme l'apoptose ou la nécrose. Une exposition préalable à des températures modérées, de l'ordre de 40°C, induit une réponse adaptative (la thermotolérance) qui permet aux cellules de résister à une agression toxique ultérieure. La thermotolérance induite par des températures modérées de l'ordre de 39-40°C (ce qui correspond physiologiquement à un état fiévreux) a été peu étudiée et est mal comprise. Les deux objectifs principaux de cette étude sont : (i) d'évaluer si l'induction d'un système de défense par une température modérée et non-létale (40°C) peut permettre de protéger la cellule contre l'activation de la cascade apoptotique par le stress oxydatif, et (ii) de comprendre les mécanismes moléculaires détaillés de l'apoptose induite par le stress oxydatif. L'apoptose est évaluée au niveau des voies de signalisation médiées par les mitochondries, des récepteurs de mort et le réticulum endoplasmique (RE) dans des cellules HeLa. L'objectif premier est de déterminer si un choc thermique modéré peut induire un mécanisme de défense cellulaire autre que les Hsps. En effet, une thermotolérance modérée (40°C, 3h) induit une augmentation du taux de plusieurs antioxydants et protéines de stress du RE. L'expression protéique et l'activité enzymatique de la manganèse superoxyde dismutase (MnSOD) et de la catalase sont augmentées dans les cellules thermotolérantes, comparées aux contrôles (37°C). Les niveaux intracellulaires de glutathion et de y-glutamylcysteine synthétase, l'enzyme qui synthétise le glutathion, sont aussi augmentés. Ceci peut être expliqué par l'augmentation de la production de dérivés réactifs de l'oxygène (reactive oxygen species, ROS) dans les cellules thermotolérantes. De plus, l'expression des protéines de stress du RE, PERK, p-PERK, eIF2α et p-eIF2α, est accrue dans ces cellules. Cela démontre que la thermotolérance modérée accroit les effets pro-survie de la voie PERK/eIF2α de réponse aux mauvais repliements de protéines (unfolded protein response, UPR). Le second objectif a pour but de déterminer les mécanismes de l'apoptose induite par le stress oxydatif. Lorsqu'elles sont exposées à du peroxyde d'hydrogène (H2O2), les cellules entrent en apoptose via les voies des mitochondries, des récepteurs de mort et du RE. L'activation de la cascade mitochondriale de l'apoptose implique la translocation de Bax à la mitochondrie, la dépolarisation de la membrane mitochondriale, la libération du cytochrome c, l'activation des caspases -9 et -3 et la condensation de la chromatine du noyau. De plus, H2O2 cause l'activation de p53 et l'induction de sa protéine cible PUMA, ainsi que l'apoptose caspase-indépendante impliquant le facteur d'induction de l'apoptose (AIF). Ces évènements sont tous inhibés dans les cellules thermotolérantes, ce qui suggère qu'une exposition préalable à des températures modérées et physiologiques peut protéger les cellules contre l'apoptose mitochondriale déclenchée par le stress oxydatif, qu'elle soit caspase-dépendante ou -indépendante. De plus, H2O2 active la voie d'apoptose du Fas récepteur de mort par l'induction du ligand FasL, le recrutement de la protéine FADD à la membrane plasmique et l'activation des caspases -8 et -2. Ceci mène au clivage de Bid et à la voie mitochondriale de l'apoptose. Tous ces évènements sont diminués dans les cellules thermotolérantes, ce qui démontre une fois de plus le rôle anti-apoptotique de cette réponse adaptative. L'induction de FasL, l'activation des caspases -8 et -2 et l'apoptose sont inhibées par pifithrin-α, un inhibiteur de p53, ce qui suggère que p53 agit en amont dans l'activation de la voie des death receptors par H2O2. Une exposition courte (15 min) des cellules au H2O2 donne lieu à l'activation de l'UPR, comme le confirment l'augmentation de l'expression de p-PERK, p-eIF2α, p-IRE1α et du clivage de ATF6. Une exposition plus longue (1-3 h) au H2O2 induit l'apoptose liée au RE, durant laquelle l'expression de CHOP ainsi que l'activité enzymatique de la calpaïne et des caspase -7, -4, -12 et -3 augmentent. Tous ces évènements pro-apoptotiques sont diminués dans les cellules thermotolérantes. Il a été montré que le calcium, la calpaïne et la caspase -7 agissent en amont de l'activation de l'apoptose liée au RE par H2O2. De plus, la réponse adaptative (UPR) prédomine lors d'expositions courtes au H2O2 (stress léger) tandis que lors d'expositions plus longues (stress sévère), c'est l'apoptose liée au RE qui est la plus fréquente. En conclusion, cette étude permet d'ajouter aux connaissances sur l'effet anti-apoptotique et protecteur de la réponse adaptative induite par un stress modéré, tel une fièvre, sur le stress oxydatif. Cette étude améliore également notre compréhension de l'activation de la cascade apoptotique par le pro-oxydant H2O2, cascade qui a d'importantes répercussions sur la santé humaine si l'on considère le rôle des ROS dans les pathologies majeures que sont le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires ou encore les maladies neurodégénératives. ______________________________________________________________________________

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [191]-231. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Thèse présentée en cotutelle: Programme de biologie cellulaire et moléculaire, Faculté de médecine, Université Laval et L'École doctorale du Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris, France. Bibliogr.: f. 147-177. Publié aussi en version électronique.