Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les réseaux périneuronaux (PNN) sont des régulateurs clé de la plasticité et de la régénération des neurones au niveau du système nerveux central chez l’adulte. Le PNN est une matrice extracellulaire hautement organisée, qui entoure des populations spécifiques de neurones, enrichie en protéoglycanes à chondroïtine sulfate (CSPG). La chondroïtine sulfate (CS) est un polysaccharide linéaire, appartenant à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui peut être sulfaté à différentes positions et donner lieu à plusieurs isoformes. Ces isoformes interagissent de manière spécifique avec de nombreuses molécules de signalisation dont la semaphorine 3A (Sema3A). Sema3A est une protéine secrétée, qui interagit avec les CS et s’accumule ainsi dans les PNN. Elle est impliquée dans la guidance des neurones sur lesquels elle agit par chemorepulsion. Les aspects structuraux et fonctionnels de l’ interaction entre Sema3A et CS sont encore mal connus, mais celle-ci pourrait être requise pour renforcer la liaison de la Sema3A avec ses récepteurs et déclencher une voie de signalisation qui aboutit à l’inhibition de la plasticité synaptique. Le but du projet est donc de caractériser biochimiquement l’interface d’interaction Sema3A-CS. Il a pour perspective d’élaborer des molécules interférant avec cette interaction qui pourraient permettre une amélioration de la plasticité neuronale après une maladie neurodégénérative ou une lésion de la moelle épinière.Pour ce faire, la Sema3A est exprimée dans un système hétérologue de cellules eucaryotes pour être purifiée. Deux formes ont été purifiées: une forme complète de 90 kDa qui reste accrochée à la surface cellulaire et une forme clivée de 65 kDa secrétée dans le milieu de culture. La Sema3A-90 interagit d’une manière sélective et avec une très haute affinité avec la CS-E (chondroitine disulfatée en position 4 et 6) et l’héparane sulfate,alors que, la forme clivée n’interagit avec aucun GAG, comme observé par résonance plasmonique de surface (SPR). Quatre sites, situés dans le domaine C-terminal de la protéine, susceptibles d’interagir avec les GAG ont été identifiés et analysés par mutagenèse. Deux d’entre eux sont impliqués dans la reconnaissance des GAG et sont nécessaires à la Sema3A pour inhiber la croissance de neurites sur des cultures de neurones issus de ganglion de la racine dorsale de rats. En parallèle, nos travaux montrent qu’un tetrasaccharide de CS-E est la taille minimale requise pour l’interaction avec la Sema 3A. Enfin, des analyses réalisées en utilisant une microbalance à cristal de quartz avec dissipation ont montré que la Sema3A pourrait réticuler les chaines de GAGs, participant ainsi à la stabilisation du réseau périneuronal. / Perineuronal nets (PNNs) are the key regulators of neuronal plasticity and regeneration in the mature central nervous system (CNS). They are a unique and highly organised extracellular matrix (ECM) structure, found around sub-population of neurons, composed mainly of chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG). Chondroitin sulfate (CS) is a linear polysaccharide belonging to glycosaminoglycans (GAGs) family. The sulphation pattern defines different types of CS, which interact with different signalling proteins including those regulating axonal outgrowth and guidance such as semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a secreted chemorepulsive protein found accumulated in the PNNs through its interaction with CS. This process is believed to potentiate Sema3A signalling through plexin A1 (PlxnA1) and Neuropilin 1 (Nrp1) and regulate plasticity and regeneration. The aim of the thesis project is to characterise the interface of Sema3A- CS interaction.For this purpose, Sema3A is expressed in eukaryote cells and purified. Interestingly, two major forms were obtained: a full length Sema3A (90 kDa) which remains attached to the cell surface GAGs and a truncated form without the C-ter part (65 kDa) which is released to the culture medium. With the use of surface plasmon resonance (SPR), we observed that full length Sema3A binds selectively to CS-E (4,6-disulfated chondroitin) and heparan sulfate with a high affinity (KD in the sub pM range), while the truncated Sema3A does not bind to any GAG. Four putative GAG binding sequences were identified in the C-ter of Sema3A and mutated using site directed mutagenesis. SPR analysis then revealed that two out of these four sites are required for the binding to CS-E. The importance of these GAG-binding sequences in inhibition of neurites outgrowth of dorsal root ganglion neurons in culture was also reported, indicating thus the importance of GAG-binding in Sema3A signalling. In parallel, the minimal required sequence of Sema3A-binding of CS-E was determined as being a tetrasaccharide. The Sema3A-CS interface was thus characterized. Furthermore, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring analysis suggested that Sema3A could crosslink GAG chains. This suggests Sema3A could be involved in stabilising the PNN network and induces mechanical changes on neuronal surface.The detail characterization of Sema3A-CS interaction may enable the design of new strategies aiming at enhancing plasticity and regeneration for neurodegenerative diseases or spinal cord injury.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les carbohydrates font partie des trois grandes classes de biopolymères présents dans la nature. Ils représentent 75% de la biomasse. Les glycosaminoglycanes font partie des carbohydrates, ils sont présents à la surface des cellules et sont responsables de la signalisation cellulaire. Ils sont importants dans de nombreux processus biologiques. Vu leur importance en biologie et en santé, il est nécessaire de comprendre leur fonctionnement. Dans cette thèse nous avons étudié deux types de tétrasaccharides de glycosaminoglycanes (chondroïtine sulfate et dermatane sulfate) avec une nouvelle méthode qui couple la spectrométrie de masse à la spectroscopie vibrationnelle (MS/IR). Nous avons montré qu’avec cette méthode la signature de l’empreinte OH fonctionne pour les glycosaminoglycanes qui présentent des groupements Coo- et des groupements sulfate contrairement aux oses simples. Cette méthode a également validé la pertinence du séquençage pour l'élucidation de profils de sulfate et la nature de l’hexuronique dans les oligosaccharides de glycosaminoglycanes. L’approche du séquençage améliore considérablement la résolution structurelle par rapport à la simple analyse spectroscopique de l'ion précurseur. Elle permet d’avoir plus d’information sur les oligosaccharides. Et pour finir nous avons proposé un protocole pour l’analyse de mélanges afin de déterminer le ratio des différents éléments présents dans le mélange / Carbohydrates are among the three major classes of biopolymers found in nature. They represent 75% of the biomass. Glycosaminoglycans are carbohydrates, they are present on the surface of cells and are responsible for cell signaling. They are important in many biological processes. Given their importance in biology and health, it is necessary to understand their mechanism. In this thesis we studied two types of glycosaminoglycan tetrasaccharides (chondroitin sulfate and dermatan sulfate) with a new method that combines mass spectrometry with vibrational spectroscopy (MS / IR). We have shown that with this method the signature of the OH-fingerprint works for glycosaminoglycans which have COO- groups and sulfate groups in contrast to simple carbohydrates. This method also validated the relevance of sequencing for the elucidation of sulfate profiles and the nature of hexuronic in oligosaccharides of glycosaminoglycans. The sequencing approach significantly improves the structural resolution compared to the simple spectroscopic analysis of the precursor ion. It provides more information on oligosaccharides. And finally we proposed a protocol for the analysis of mixtures to determine the ratio of the different elements present in the mixture

Les maladies cardiovasculaires continuent à être parmi les principales sources de morbidité et de mortalité dans le monde [1, 2]. Malgré les avancées importantes dans le traitement médical et endovasculaire de ces pathologies, le besoin en revascularisations artérielles par pontage ne cesse de prendre de l’ampleur. Les conduits vasculaires synthétiques actuels performent bien lorsqu’utilisés pour des vaisseaux de calibre moyen, mais ceux de petit diamètre (< 6 mm) démontrent encore à ce jour des taux de perméabilité beaucoup trop bas [3-11]. Deux hypothèses pouvant expliquer ce phénomène sont le manque d’endothélialisation et de compliance des conduits synthétiques actuels [12-18]. Le but de cette étude était de créer et d’évaluer la performance d’un nouveau conduit de petit diamètre avec un potentiel d’endothélialisation supérieur et une compliance similaire aux vaisseaux natifs. Cette étude présente deux aspects distincts : l’élaboration et l’évaluation in vitro d’un conduit électrofilé de petit diamètre (5 mm) composé d’une structure de polyuréthane/polycaprolactone (PU/PCL) et d’un revêtement bioactif de sulfate de chondroïtine (CS) par une équipe spécialisée en biomatériaux, puis l’élaboration et l’évaluation d’un essai in vivo mettant à l’épreuve la performance du néo-conduit dans un modèle de grand animal par une seconde équipe. Les conduits à l’étude (eVG-CS) ont démontré une compliance 10 fois supérieure à celle des conduits de polytétrafluoroéthylène expansé (ePTFE) actuellement utilisés en clinique, ainsi qu’une bonne stabilité au vieillissement in vitro. L’évaluation in vivo, sous forme de pontages carotidiens bilatéraux chez le mouton, a par contre démontré l’infériorité des conduits à l’étude comparativement aux contrôles en ePTFE en termes de perméabilité et de par l’absence d’endothélialisation significative des greffons à l’étude. L’infériorité in vivo de ces nouveaux pontage électrofilés bioactifs par rapport aux résultats favorables in vitro fut attribuée principalement à la trop faible porosité des greffons à l’étude ainsi qu’à l’incapacité du revêtement de CS à favoriser un processus d’endothélialisation rapide. L’établissement d’un greffon plus poreux avec un revêtement bioactif différent représente une piste d’amélioration future de cette structure prometteuse de PU/PCL. / Cardiovascular diseases present a growing burden of morbidity and mortality worldwide [1, 2]. Despite significant advances in medical and endovascular treatments of these pathologies, the need of revascularization by arterial bypass is increasing. Actual synthetic vascular conduits perform well when used on large-diameter arteries, but small-diameter conduits (<6 mm) still show unacceptably low medium- and long-term permeability rates [3-11]. Two hypotheses can explain this phenomenon – the inability of synthetic bypasses to create a neo-endothelium and compliance mismatch between the graft and the native artery [12-18]. The goal of this study was to create and evaluate the performance of a novel small-diameter vascular conduit with superior endothelialization properties and a compliance similar to native vessels. This study presents two distinct aspects : the in vitro elaboration and evaluation of an electrospun, small-diameter (5 mm) vascular conduit made up of a scaffold of polyurethane/polycaprolactone (PU/PCL) combined with a chondroitin sulfate (CS) bioactive coating by a team specialized in biomaterials, and the elaboration and evaluation of an in vivo trial testing the performance of the novel vascular graft in a large animal model by a second team. The experimental conduits (eVG-CS) showed an in vitro compliance 10-times superior to their commercially-available expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) counterparts, while remaining stable after aging trials. However, in vivo evaluation, as bilateral interposition carotid bypasses in sheep, showed the novel bypasses to be inferior to ePTFE controls in terms of permeability and by the absence of significant endothelialization. The in vivo inferiority of these novel bioactive electrospun grafts despite favorable in vitro results was attributed to the low porosity of the grafts and to the inability of the CS coating to promote the endothelialization process. Establishment of a more porous graft with a different bioactive coating represents the future of the evaluation of this promising PU/PCL structure.

Ce travail est consacré à l'élaboration de nano-complexes polyélectrolytes (CPEs) ayant une stabilité améliorée en milieux physiologiques et à l'exemplification de leur fort potentiel d'application comme système de délivrance de (macro) molécules bioactives. Le chitosane comme polycation a été compléxé avec quatre polyanions naturels ayant différents densités de charges et groupements fonctionnels(-COO- et SO3-) à savoir l'acide hyaluronique (HYA), le chondroïtine sulfate (ChonS), le sulfate de dextrane (DS) et l'héparine (HEP). Les facteurs qui influent sur la formation et les propriétés physico-chimiques des nano-complexes chitosane-HYA ont été étudiés. Ces nanovecteurs perdent leur caractère colloïdal en milieux physiologiques. Pour améliorer leur stabilité dans ces conditions, une stratégie innovante qui implique l'ajout de zinc a été conçue. Cette stratégie de stabilisation a été démontrée comme étant polyvalente et a été étendue aux complexes polyélectrolytes (CPEs) chitosane-ChonS. Même si de cette manière une stabilité à long terme a été observée, cette stratégie reste uniquement applicable aux CPEs cationiques. Pour cette raison, une approche alternative permettant l'amélioration de la stabilité des colloïdes à charges positives ou négatives a été mise en oeuvre en concevant des nano-complexes de type coeur-couronne ternaires composés de polyacides forts c'est-à-dire de DS ou d'HEP associés au chitosane en coeur et un complexe chitosane-HYA en couronne. Tous les nano-complexes stables obtenus peuvent encapsuler le ténofovir, une molécule antirétrovirale et être fonctionnalisés par des IgAs de ciblage. En in vitro, ces nanovecteurs montrent une inhibition de l'infection des PBMC par le virus VIH-1 supérieure à l'antirétrovirale seule / This work is devoted to the elaboration of nano-polyelectrolyte complexes (PECs) systems with improved stability in physiological media and to the establishment of their high potential of applications as bioactive (macro) molecule delivery systems. Chitosan as polycation were complexed with four natural polyanions of different charged groups and densities (-COO- and SO3 - as negative charges), namely hyaluronan (HYA), chondroitin sulfate (ChonS), dextran sulfate (DS) and heparin (HEP). The factors impacting the formation and physical-chemical properties of chitosan-HYA nanocomplexes were investigated. However, these nanovectors lost their colloidal character in physiological media. To improve their colloidal stability in physiological conditions, an innovative stabilization strategy was designed, involving zinc ion. This stabilization strategy proved versatile and was extended to chitosan-ChonS PECs. Though a long-term stability was achieved, this strategy was only applicable to cationic PECs. Therefore, an alternate approach enabled the improvement of the colloidal stability in physiological media of both positive and negative colloids by designing core-shell ternary polyelectrolyte nanocomplexes composed of strong polyacid (DS or HEP)-chitosan PECs as core and a chitosan-HYA complex as shell. Furthermore, all of the stabilized nanocomplexes allowed the encapsulation of active molecules anti-retroviral drug tenofovir and surface functionalization with targeting IgAs. In vitro, these nanovectors exhibited an inhibition of infection of PBMCs by HIV-1 virus which could be superior to the free drug

La réparation endovasculaire (EVAR) est une technique minimalement invasive permettant de traiter l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) par l’entremise d’un stent- graft (SG). L’utilisation d’EVAR est actuellement limitée par de fréquentes complications liées à une guérison inadéquate autour de l’implant. Ce manque de guérison est principalement dû au type de recouvrement polymérique des SG, au milieu pro-apoptotique des AAA et à l’accès réduit aux nutriments et à l’oxygène après EVAR. L’objectif de cette thèse consistait à concevoir un revêtement bioactif permettant d’inhiber l’apoptose et stimuler la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), pour ainsi favoriser la guérison des tissus vasculaires autour des SG. La chondroïtine-4-sulfate (CS) a d’abord été choisie, car elle a été identifiée comme un médiateur important de la réparation vasculaire. Il a été démontré que la CS en solution influence directement la résistance à l’apoptose des CMLV, en plus de favoriser la différenciation myofibroblastique chez les fibroblastes. Dans le cadre de ce projet, un premier revêtement à base de CS et de collagène a été créé. Bien que le revêtement permettait d’induire une résistance à l’apoptose chez les CMLV, il se désintégrait trop rapidement dans des conditions aqueuses. Une nouvelle méthodologie a donc été adaptée afin de greffer la CS directement sur des surfaces aminées, à l’aide d’un système utilisant un carbodiimide. Dans le but d’accroître la croissance des CMLV à la surface des revêtements, le facteur de croissance de l’épiderme (EGF) a ensuite été sélectionné. En plus de ses propriétés mitogéniques et chimiotactiques, l’EGF stimule la production d’éléments de la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine. De plus, l’activation du récepteur de l’EGF inhibe également l’apoptose des CMLV. L’EGF a donc été greffé sur la CS. Le revêtement de CS+EGF a démontré une bonne uniformité et bioactivité sur des surfaces de verre aminé. iii iv Dans une 3ème étape, afin de permettre de transposer ce revêtement bioactif sur des implants, plusieurs méthodes permettant de créer des groupements d’amines primaires sur les biomatériaux polymériques comme le PET ou le ePTFE ont été étudiées. La polymérisation par plasma a été choisie pour créer le revêtement CS+EGF à la surface de PET. Une fois de plus, celui-ci a permis d’inhiber l’apoptose des CMLV, dans des conditions pro-apoptotiques, et de favoriser la croissance des cellules. Le revêtement de CS et d’EGF, déposé sur des surfaces aminées, possède des caractéristiques biologiques intéressantes et semble donc prometteur pour favoriser une meilleure guérison autour des SG. / Endovascular aneurysm repair (EVAR) is a minimally invasive technique performed to treat abdominal aortic aneurysm (AAA) through the use of a stent-graft (SG). The usage of EVAR is presently limited by postoperative complications related to an incomplete healing of the surrounding tissues. The materials currently used in SG, the pro- apoptotic phathophysiology of AAA and the limited access to nutrients and oxygen, all limit the wound healing process and proper tissue ingrowth around the implant. The main objective of this thesis was to create of a bioactive coating inhibiting cell apoptosis and increasing vascular smooth muscle cells (VSMC) growth, to promote healing of the vascular tissues surrounding SG. Chondroitin sulfate (CS) was chosen since recent findings have shown that this polysaccharide triggers key mechanisms involved in vascular repair. CS in solution was shown to inhibit apoptosis of VSMC, as well as stimulate myofibroblast differentiation. A coating of CS and collagen was first created for the purpose of this work. Although the coating was shown to increase cell resistance to apoptosis with VSMC, it was not stable enough, since it rapidly disintegrated in aqueous solutions. A new methodology was thus proposed, where CS was grafted right on aminated surfaces, through carbodiimide chemistry. Epidermal growth factor (EGF) was then chosen to increase VSMC growth on the coatings. EGF is a known mitogenic and chemotactif growth factor for VSMC. It also stimulates the production of extracellular matrix elements, such as collagen and fibronectin. The activation of EGF receptor (EGFR) also triggers various cell signalling pathways modulating VSMC resistance to apoptosis. EGF was thus grafted on CS. CS+EGF coating on aminated glassed slides was shown to be uniform and bioactive. Finally, several methodologies to produce primary amines on polymeric biomaterials, such as PET and ePTFE, were studied in order to eventually transfer the v vi coating on implants. Plasma polymerization was chosen to create the CS+EGF coating. Once again the coating was shown to decrease VSMC apoptosis, in apoptotic conditions, and favour cell growth. Overall, the CS and EGF coating on aminated surfaces possesses interesting biological features and is a promising avenue to stimulate vascular healing around SG.

En janvier 2008, une éclosion de réactions anaphylactoïdes (RA) potentiellement mortelles associées à l’injection intraveineuse d’héparine manufacturées en Chine et contaminée par le chondroïtine sulfate hypersulfaté (CSHS) a forcé le rappel de ces dernières par la U.S. Food and Drug Administration. Ces RA ont rapidement été attribuées à la libération de la bradykinine (BK) suite à l’activation du système de contact par le CSHS. Cependant, aucune évidence expérimentale définitive n’est à ce jour venue appuyer directement cette hypothèse. En se basant sur le nombre de morts déclaré et associé à la contamination (>150 morts au niveau mondial) ainsi qu’aux données épidémiologiques, qui stipulent que 25% des patients ayant développés une RA aux États-Unis étaient essentiellement des insuffisant rénaux en dialyse traités au moyen d’un inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (iECA), nous avons émis l’hypothèse suivante : les RA causées par l’injection intraveineuse d’héparine contaminée au CSHS sont de nature multifactorielle et complexe. Le but de notre travail est donc, dans un premier temps, d’évaluer le pouvoir kininoformateur du CSHS en présence d’un iECA et de le comparer à celui du sulfate de dextran, un activateur de référence du système de contact. Comme les RA associées à l’injection intraveineuse d’héparine contaminée par le CSHS se produisent généralement dans les premières minutes des séances de dialyse, nous allons étudier l’effet de la dilution du plasma sur la quantité de BK libérée en présence ou en absence d’un iECA. Nous allons également mesurer les profils cinétiques de la libération de la BK sur un plasma stimulé par différents lots d’héparine contaminée, et associée à des RA, et nous comparerons cette cinétique avec celles d’une héparine de référence complémentée ou non avec différentes concentrations de CSHS synthétique. Enfin, nous allons caractériser le profil de libération de la BK et de son métabolite actif, la des-Arg9-BK, dans le plasma de patients dialysé ayant présenté une RA associée à une membrane de dialyse chargée négativement. L’application de méthodes expérimentales développées dans notre laboratoire nous a permis de montrer, pour la première fois, que l’héparine contaminée au CSHS a la capacité de libérer la BK à des concentrations susceptibles d’expliquer le rôle de ce peptide inflammatoire dans la physiopathologie des RA causées par l’injection intraveineuse d’héparine d’origine chinoise contaminée au CSHS. / In January 2008, fatal anaphylactoid reaction (AR) has been associated to oversulfated chondroitin sulphate (OSCS) contaminated heparin. Although attributed to bradykinin (BK) released during contact system activation by OSCS, no definitive evidence exists until now for a BK release during incubation of contaminated heparin with human plasma. While looking at the number of death associated with OSCS (>150 worldwide) and at the epidemiologic fact, who state that 25% of the cases of AR associated to OSCS in United-States were treated with an angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEi), we hypothesis that: AR associated with bolus injection of OSCS contaminated heparin are bind to a complex and multi-factorial aspect. The first objective of our study is to measure the kinetics of BK release in human plasma incubated with OSCS in presence of an ACEi and to compare it to the kinetics profile of the reference activator dextran sulfate. As the AR associated with OSCS contaminated heparin occurred mainly in the first minutes of dialysis session, we also studied the effect of the plasma dilution on the amount of BK released when treated or not with an ACEi. We also quantify the BK forming capacity of different batches of OSCS contaminated heparin responsible for AR and we compare this effect with reference heparin spiked or not with increasing concentrations of synthetic OSCS. Finally, we measure the kinetics of BK and des- Arg9-BK, its active metabolite, release in human plasma collected from patients who developed an AR associated to negatively charged dialysis membrane. The application of experimental method developed in our laboratory show, for the first time, that OSCS contaminated heparin incubated with human plasma has the capacity to liberate BK at a concentration that could explain the role of this inflammatory peptide in the pathophysiology of AR associated with OSCS contaminated Chinese heparins.