Polytäne Chromosomen von Drosophila sind in eine Abfolge von Banden und Interbanden unterschiedlichen Kompaktionsgrades gegliedert. Das Protein Z4 ist notwendig, um dieses Muster aufrecht zu erhalten (Eggert et al., 2004). Durch Koimmunpräzipitation mit Z4 wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Chromodomänen Protein identifiziert, das von uns als Chriz bezeichnet wurde (Gortchakov et al., 2005). In meiner Arbeit testete ich die Interaktion zwischen den vollständigen Proteinen Chriz und Z4. Ich konnte dabei zeigen, dass beide Proteine in vivo direkt miteinander interagieren. Die kartierten Interaktionsdomänen am N-Terminus von Z4 und am C-Terminus von Chriz sind hinreichend für die wechselseitige Interaktion beider Proteine. Chriz ist wie Z4 in vielen Interbanden polytäner Interphasechromosomen gebunden. Die überexpression verschiedener Domänen von Chriz zeigte, dass sowohl der N- als auch der C-Terminus von Chriz für die Interbandenbindung von Chriz ausreichend sind. Der Chriz C-Terminus ist dar Über hinaus notwendig, um das überleben von Tieren mit einer Chriz Null Mutation bis in das larvale Stadium zu gewährleisten. Tiere mit induziertem Chriz RNAi knock down zeigten eine verringerte DNA Kondensation polytäner Chromosomen. Die Ähnlichkeit des chromosomalen Phänotyps von Z4 und Chriz Mutationen legt nahe, dass beide Proteine in einem gemeinsamen Komplex in Interbanden vorkommen. Unter Ausnutzung von Chriz RNAi bzw. Z4 RNAi konnte ich zeigen, dass die chromosomale Bindung von Z4 von Chriz abhängt. Weiterhin sind die Proteinkinase Jil-1 und an Serin 10 phosphoryliertes H3 (H3pS10), beides Marker für dekondensiertes Chromatin, in Chriz RNAi Tieren verringert. Aus meinen Daten schliesse ich, dass Chriz/Z4/Jil-1 in einem gemeinsamen Komplex an Interbanden gebunden sind. Chriz ist dabei fundamental wichtig für die zielgerichtete Bindung und Stabilität des Komplexes. Der Komplex selbst ist erforderlich, um die lokale Chromatinstruktur aufrecht zu erthalten. / Drosophila polytene chromosomes are compacted into a series of bands and interbands. Z4 is a protein to keep this pattern, since Z4 mutant larvae show a decompaction of chromosomes and a loss of banding pattern (Eggert et al., 2004). By coimmuno-precipitation, we identified a chromodomain protein, which we named Chriz, for chromodomain protein interacting with Z4 (Gortchakov et al., 2005). In my PhD thesis, I tested the interactions between the full length proteins and different fragments of Chriz and Z4 which showed that Chriz could directly interact with Z4 in vivo. The interaction domains were mapped and it was determined that the N terminus of Z4 and the C terminus of Chriz are sufficient for mutual interaction. GST pull down confirmed these data and more precisely localized the interaction domains. Chriz, like Z4, is present in many interbands of interphase polytene chromosomes. The overexpression of different domains of Chriz demonstrated that both the N and C terminus are sufficient for targeting of Chriz to interbands. The C terminus was shown to be sufficient for rescue of Chriz null mutations into larva stage. Chriz full length proteins, with site directed mutations within the chromodomain, could still partially rescue the null mutant. Chriz RNAi knock down resulted in a loss of structure of polytene chromosome. The similar chromosomal phenotype of Z4 and Chriz indicate that they cooperate in the formation of chromosomal structure. Using the Chriz RNAi, I showed that Z4 chromosomal binding is dependent on Chriz. However, by a similar assay I showed that Chriz binding did not depend on Z4. Finally, the decondensed interphase chromatin marker Jil-1, a H3S10 histone kinase, and H3pS10 are decreased in Chriz RNAi line. From these data, I conclude that Chriz/Z4/Jil-1 form an interband binding complex. Chriz is the fundamental factor for the chromosomal targeting and stabilitation of the complex that is required to maintain locally chromatin structure.

Die Chromatinstruktur spielt eine bedeutende Rolle bei der Stadien- und Gewebs-spezifischen Genexpression. Der epigenetische Status von Chromatindomänen wird mit Hilfe einer Anzahl von Proteinen und Histonmodifikationen etabliert und aufrechterhalten. Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Bedeutung und Funktion des Chriz Protein Komplexes bei Drosophila, der spezifisch in dekondensierten Regionen von Interphase Chromosomen gebunden ist. Meine RNAi Experimente an embryonalen S2 Zellen zeigten, dass die Rekrutierung von Z4 und der Kinase Jil-1 an das Chromatin sowie dessen H3S10 Phosphorylierung während der Interphase von Chriz abhängt. Diese Ergebnisse lieferten einen starken Hinweis auf eine Ähnlichkeit bei der Bildung des Komplexes in polytänen Zellen und diploiden S2 Zellen. Ich führte eine vergleichende Analyse der Bindungsprofile von Proteinen des Chriz Komplex zwischen Speicheldrüsen im 3.Larvenstadium und S2 Zellen im chromosomalen Intervall 61C7-8 durch. Ich fand heraus, dass die Chriz Bindungsprofile im proximalen Teil der Domäne konserviert waren. Dagegen beobachtete ich eine veränderte Chriz Bindung im distalen Teil, die mit einem veränderten Transkriptionsprofil in dieser Region übereinstimmte. Chriz und Z4 RNAi Experimente in S2 Zellen führten zu einer Veränderung der Expression vieler Chriz- und Z4- bindender Gene. Mittels Co-Immunpräzipitation und Protein „Pull-down“ konnte ich die Bindung der Insulator Proteine BEAF-32 und CP190 im Chriz-Komplex nachweisen und die für die Protein-Protein Interaktion notwendigen Proteinabschnitte grob kartieren. Schließlich überprüfte ich die Möglichkeit einer Rekrutierung des Chriz Komplexes durch BEAF-32 durch Induktion von Punktmutationen in bekannten BEAF-32 Bindemotiven. Meine Ergebnisse wiesen eine Wechselwirkung zwischen Chriz und Insulator Proteinen nach und zeigten, dass der Chriz-Komplex eine wichtige Bedeutung bei der strukturellen Organisation von Chromatin Domänen besitzt. / Chromatin structure is important for the correct stage and tissue-specific expression of the genetic material. The epigenetic state of chromatin domains is established and maintained by a number of proteins and histone modifications. The aim of current thesis is to investigate the role and function of Chriz protein complex, specifically bound to decondensed regions of interphase chromosomes in Drosophila. Several proteins were known to compose Chriz complex - chromodomain protein Chriz, zinc finger protein Z4 and H3S10 kinase Jil-1. I performed RNAi experiments on S2 cells which demonstrated that recruitment of Z4 and Jil-1 kinase to chromatin and interphase H3S10 phosphorylation are dependent on the presence of Chriz. I accomplished the comparative analysis of binding profiles of Chriz complex components between 3rd instar larvae salivary glands and S2 cell culture within 61C7-8 chromosomal interval. I found that Chriz binding profiles between two tissues are conserved at proximal part, however variant Chriz binding in distal part of 61C7-8 domain coincides with differences in transcription profile in the same region. Publicly available genome-wide data shows a tendency of Chriz to bind near Transcription Start Sites (TSS) and promoter regions of active genes. Chriz and Z4 RNAi experiments, performed in S2 cells resulted in expression changes of many Chriz- and Z4-binding genes. Using co-immunoprecipitation and pull-down assays, I identified insulator proteins BEAF-32 and CP190 to be present in the Chriz complex and performed rough mapping of interacting domains. Using BEAF-32 RNAi and introduced point mutations to BEAF-32 binding motifs I examined the possibility for recruitment of Chriz complex by BEAF-32. The obtained results revealed the interplay between Chriz and insulator proteins and point to important architectural role of Chriz complex in organizing chromatin domains.

Polytäne Riesenchromosomen von Drosophila melanogaster bieten ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der Mechanismen zur strukturellen Bildung chromosomaler Domänen. Über Manipulation und Rekonstruktion des chromosomalen Bandenmusters polytäner Chromosomen können artifiziell kondensierte als auch dekondensierte Domänen etabliert werden. Diese Eigenschaft habe ich in meiner Arbeit genutzt für die Etablierung eines experimentellen Systems zur Analyse der strukturellen Vorraussetzungen zur Bildung offener Chromatindomänen. Dafür wurde eine transgene kondensierte Chromatindomäne ektopisch innerhalb offenen Chromatins generiert. Diese kondensierte „Modellbande“ bietet einen definierten genetischen Hintergrund für die gezielte Insertion von DNA-Sequenzen unter Ausschluss variabler Positionseffekte und ermöglicht dadurch eine vergleichende Analyse dieser Sequenzen auf ihr Vermögen offenes Chromatin zu bilden. Zu diesem Zweck wurde über Sequenz-spezifische Rekombination die 61C7/8 Interbandensequenz gezielt in die „Modellbande“ eingefügt. Die zytogenetische Untersuchung dieser Insertion zeigt, dass infolge der Insertion offenes Chromatin gebildet wird, was in einer Aufsplittung der kondensierten „Modellbande“ resultiert. Molekulare Analysen weisen darauf hin, dass auch die epigenetischen Charakteristika wie z.B. die Rekrutierung typischer Proteine oder transkriptionelle Eigenschaften zur endogenen Domäne immitiert werden. Über Deletionsanalysen konnte von mir die essentielle DNA-Sequenz zur Bildung offenen Chromatins auf ein ~490bp großes Fragment im proximalen Bereich der 61C7/8 Sequenz kartiert werden. Dieses Fragment überlappt mit Bindungsstellen spezifischer Proteine, welche dafür bekannt sind eine Rolle in der chromosomalen Domänenbildung zu spielen wie z.B. das Chromatin-Protein Chriz, die Histon-Kinase Jil1 oder das Insulator-Protein CP190. Desweiteren überlappt es mit einer Promoterregion, welche zwischen den Genen Rev1 und Med30 lokalisiert ist. / Polytene chromosomes of Drosophila melanogaster provides an ideal model-system for the analysis of the mechanisms needed for chromosomal domain formation. Condensed as well as decondensed chromosomal domains can be formed by manipulating and reconstructing the polytene banding pattern. This possibility i ha-ve used for the establishment of an experimental system to study the structural requirements for open chromatin formation. Therefor i have generated a condensed chromatin domain at ectopic positions. This condensed „model“ domain provides a defined genetic context for the targeted insertion of sequences of interest, excluding any variable position effects. This allows comarative analysis of different sequences in order to identify the structural requirements for open chromatin formation. For this purpose the 61C7/8 interband sequence was targetly integrated into the condensed „model“ domain by site-specific recombination. Thereby i could show that the 61C7/8 interband sequence maintains the capacity to form open chromatin cognizable by the splitting of the condensed „model“ domain. Furthermore the newly formed open chromatin domain also keeps epigenetic characteristica like transcriptional activity or the recruitment of typical proteins. By deletion analysis, i have mapped the essential region needed for open chromatin formation to a ~490bp fragment located in the proximal part of the 61C7/8 interband sequence. This fragment overlaps binding sites for characteristic proteins known to be involved in chromosomal domain formation like the chromatin protein Chriz, the histone kinase Jil1 or the insulator protein CP190. Furthermore the fragment overlaps a promoter region that locates between the Rev1 and Med30 genes.