Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito. / Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.

FERNANDES, P. H. P. D. Biomarcadores de lesão renal em praticantes de musculação em uso de anabolizantes. 2017. 60 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-06-21T15:49:51Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_phpdf.pdf: 1832002 bytes, checksum: ebd82697ce90839219ef50b99367b19d (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-21T16:27:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_phpdf.pdf: 1832002 bytes, checksum: ebd82697ce90839219ef50b99367b19d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T16:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_phpdf.pdf: 1832002 bytes, checksum: ebd82697ce90839219ef50b99367b19d (MD5) Previous issue date: 1207-01-13 / To analyze new biomarkers of renal function in bodybuilders who use androgenic anabolic steroids. Method. A cross-sectional study was conducted between April and July 2016 involving individuals who practice weight training in an anabolic group (n = 28) and a non-anabolic group (n = 29). In both groups, a questionnaire containing personal data, training intensity, use of stimulant / anabolic supplements and clinical history was applied. Afterwards, blood and urine samples were collected for analysis of renal injury biomarkers Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1) and Monocyte Chemoatactic Protein-1 (MCP-1). Serum levels of creatinine, urea, cystatin, sodium, potassium and chlorine, proteinuria, and glomerular filtration rate were also measured. Results. The participants of the anabolic group were younger (26 ± 5 years, p = 0.006), predominantly male (n = 25, p = 0.004) did more intense training (Borg Scale 7.9 ± 1.7, p = 0.010), they used more caffeine (n = 20, p <0.001), the most frequent ergogenic anabolic steroids (EAA) were testosterone (89.3%) and boldenone (50%). The most commonly reported clinical histories were anxiety (39.3%) and hypertension (17.9%). Regarding the biomarkers, there were significant differences in the anabolic group related to creatinine (1.04 ± 0.17 vs 0.88 ± 0.14 mg / dl, p <0.001), sodium (137 ± 1.4 vs 139 ± 1 , P <0.001), potassium (5.1 ± 0.4 vs 4.6 ± 0.4 mEq / L, p <0.001), serum chlorine (99 ± 1.2 vs 101 ± 1, 6 mEq / L, p <0.001) and MCP-1 levels (50.6 vs. 33 pg / mg-cr, p = 0.039). There was no significant difference regarding KIM-1, glomerular filtration rate, urea and proteinuria. Conclusion. Despite the limitations of the study, the findings of MCP-1 levels point to an incipient renal injury and inflammation in the anabolic group. Further investigation of the chronic use of anabolic steroids is necessary in view of the early detection of renal diseases and correlation with other risk factors. / Analisar novos biomarcadores de função renal em praticantes de musculação que fazem uso de anabolizantes. Método. Foi realizado um estudo transversal, no período de abril a julho de 2016 envolvendo indivíduos que praticam musculação alocados em um grupo anabolizante (n=28) e um grupo sem anabolizante (n=29). Em ambos os grupos foi aplicado um questionário contendo dados pessoais, intensidade de treino, uso de suplementos estimulantes/anabolizantes e história clínica. Em seguida, amostras de sangue e urina, em jejum, foram coletadas para análise de biomarcadores de lesão renal “Kidney Injury Molecule- 1” (KIM-1) e “Monocyte Chemoatactic Protein- 1” (MCP-1) Para avaliação da função foram feitas dosagens de creatinina, uréia,cistatina, sódio, potássio e cloro séricos, proteinúria e taxa de filtração glomerular. Resultados. Os participantes do grupo anabolizante eram mais jovens (26± 5 anos, p=0,006), predominantemente do sexo masculino (n=25, p=0,004) faziam treinos mais intensos (Escala de Borg de 7,9 ±1,7, p=0,010), utilizavam mais cafeína (n=20, p < 0,001), os esteróides anabólicos ergogênicos (EAA) mais frequentes foram a testosterona (89,3%) e boldenona (50%) e as histórias clínicas mais referenciadas foram a ansiedade (39,3%) e hipertensão (17,9%). Em relação aos biomarcadores houve diferença significativa no grupo anabolizante com relação a creatinina (1,04±0,17 vs 0,88±0,14 mg/dl, p <0,001), sódio (137±1,4 vs 139±1,7 mEq/L, p<0,007), potássio (5,1±0,4 vs 4,6±0,4 mEq/L , p <0,001), cloro séricos (99±1,2 vs 101±1,6 mEq/L, p <0,001) e dosagem de MCP-1 (50,6 vs 33 pg/mg-cr, p=0,039). Não houve diferença significante com relação ao KIM-1, taxa de filtração glomerular, uréia e proteinúria. Conclusão. Apesar das limitações do estudo, os achados dos níveis de MCP-1 apontam para uma lesão renal incipiente e inflamação no grupo anabolizante. É necessária uma maior investigação do uso crônico de anabolizantes na perspectiva da detecção precoce de doenças renais e correlação com outros fatores de risco.

Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito. / Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.

Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito. / Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-20T15:45:34Z No. of bitstreams: 1 2010_RafaeladoSocorrodeSouzaeSilvaMoura.pdf: 957775 bytes, checksum: 59461723f79620cde77821717b9b643b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-06-21T16:47:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_RafaeladoSocorrodeSouzaeSilvaMoura.pdf: 957775 bytes, checksum: 59461723f79620cde77821717b9b643b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-21T16:47:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_RafaeladoSocorrodeSouzaeSilvaMoura.pdf: 957775 bytes, checksum: 59461723f79620cde77821717b9b643b (MD5) / Introdução: O acometimento renal em hipertensos é considerado um fator de risco para eventos cardiovasculares adversos e progressão para doença renal crônica. A cistatina C parece identificar disfunções renais precocemente. Estudos sugerem que a cistatina C também pode ser considerada um fator de risco cardiovascular independente da função renal. Métodos: Realizou-se um estudo transversal com 117 pacientes com diagnóstico de hipertensão arterial primária. Foram excluídos pacientes diabéticos e com creatinina sérica igual ou superior a 1,5 mg/dL. Os pacientes foram submetidos a dosagem de cistatina C, creatinina, ácido úrico, perfil lipídico, proteína C reativa, microalbuminúria e depuração de creatinina endógena (DCr). A taxa de filtração glomerular (TFG) foi estimada por equações baseadas na creatinina, na cistatina C e na combinação de ambas. Sessenta e dois pacientes foram submetidos a exame ecocardiográfico para estimativa do índice de massa ventricular esquerda. Foi realizada uma análise comparativa entre a depuração de creatinina e as equações para estimativa da TFG por meio do coeficiente de correlação intraclasse e da análise gráfica de Bland-Altman. A cistatina foi correlacionada aos outros fatores de risco cardiovascular por meio do coeficiente de correlação de Pearson. Foram considerados significativos valores de p<0,05 e marginalmente significativos valores de p entre 0,05 e 0,10. Resultados: Doze pacientes (10,26%) apresentaram TFG < 60ml/min/1,73m2 estimada pela equação MDRD, e, quarenta e três pacientes (36,7%) apresentaram cistatina C superior a 0,95mg/L. Na análise comparativa entre as diversas equações e a DCr, observou-se que a melhor concordância foi apresentada pela equação MDRD (ICC = 0,42; IC95% = 0,26 – 0,56). A equação de Rule apresentou uma concordância estatisticamente igual zero com a DCr (ICC = 0,11; IC95% = -0,08 – 0,29). A equação de Rule também não apresentou concordância com as equações baseadas na creatinina. Na análise de Bland-Altman a menor diferença observada foi entre a fórmula combinada e a equação MDRD, com uma diferença média de 3,78. A cistatina C, diferentemente da creatinina, correlacionou-se positivamente com a microalbuminúria (r = 0,22; p = 0,02) e apresentou uma correlação marginal com o log TG/HDL (r = 0,18; p = 0,07). Conclusões: A equação MDRD e a equação que combina creatinina e cistatina apresentaram maior concordância com a depuração de creatinina. A cistatina C, diferentemente da creatinina, apresentou correlação com a microalbuminúria, portanto parece ser um marcador de dano renal precoce em pacientes com diagnóstico de hipertensão arterial primária. Estudos prospectivos na população de hipertensos brasileiros devem ser estimulados para comprovar se a cistatina C é um fator de risco cardiovascular independente da função renal. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Renal injury in hypertensive subjects is a risk factor cardiovascular events and kidney failure development. Cystatin C seems to detect early renal damage. Recent reports suggest that cystatin could be a risk factor for cardiovascular events independently of renal function. Methods: A transversal study with 117 hypertensive subjects was made. Diabetics and patients with creatinine values _ 1,5mg/dL were excluded. Cystatin C, creatinine, uric acid, cholesterol, triglycerides, C - reactive protein, microalbuminuria and creatinine clearance was evaluated. Glomerular filtration rate (GFR) was calculated by creatinine-based and cystatin-based equations. Left ventricular mass index (LVMI) was calculated in 62 patients by echocardiography. Intraclass correlation coefficient (ICC) and Bland-Altman graphic was used to compare creatinine clearance and RFG equations. For correlation between cystatin C and other cardiovascular risk factors it was used Pearson’s coefficient. Values of p < 0.05 were considered statistically significant and those between 0.05 and 0.10 were considered marginally significant. Results: Twelve patients (10,26%) had GFR < 60ml/min/1,73m2 estimated by MDRD equation and 43 (36,7%) had cystatin C > 0,95mg/L. Comparing with creatinine clearance, MDRD shows the best agreement (ICC = 0,42; CI 95% = 0,26 – 0,56). Rule equation shows the worst agreement (ICC = 0,11; CI 95% = -0,08 – 0,29). Bland-Altman analysis demonstrate better agreement between creatinine and cystatin combined equation and MDRD (average difference of 3,78). Serum cystatin C level, differently from creatinine, was positively correlated with microalbuminuria (r = 0,22; p = 0,02) and showed a correlation of marginal significance with the atherogenic index log TG/HDLc (r = 0,18; p = 0,07). Conclusions: MDRD and creatinine and cystatin combined equation shows the best agreement with creatinine clearance. Cystatin C, but not creatinine, correlates with microalbuminuria so it seems to be an early marker of renal damage in hypertensive subjects. Prospective studies should be done in Brazilian hypertensive population to evaluate whether cystatin C is a cardiovascular risk factor independently of renal function.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4145.pdf: 3961758 bytes, checksum: 03f9f6459289842cf630d2dd53be5ba6 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant legumains, also termed vacuolar processing enzymes (VPEs), are cysteine peptidases that play key roles in seed maturation, germination, senescence, stress response, programmed cell death during development and defense against pathogens. Despite the increasing number of reports on VPEs, most of studies are on dicotyledonous legumain and their role in seeds. In this study, it was performed the characterization of sugarcane legumain, named CaneLEG. Kinetic characterization of the recombinant CaneLEG expressed in Pichia pastoris revealed that this enzyme has the main characteristics of VPEs, such as self-activation and activity under acidic pH. CaneLEG activity was strongly inhibited by the sugarcane cystatin named CaneCPI-3. In vivo interaction between legumain and cystatin was observed to barley proteins, indicating that legumains might be inhibited by cystatins in the plant. Furthermore, the CaneLEG and CaneCPI-3 gene expression was analyzed throughout sugarcane development and in plantlets treated with phytohormones. From these results, it was observed that these genes showed a tissue-specific expression pattern, with the strong accumulation of CaneLEG transcripts throughout the internode development. The up-regulation of CaneLEG and CaneCPI-3 genes in plantlets treated with ABA suggests that these proteins encoded by these genes may be involved in stress response and CaneCPI-3 may act on endogenous cysteine peptidase regulation. Our results suggest the CaneCPI-3 as the endogenous inhibitor of CaneLEG and the involvement of these proteins on the ABA-regulated stress response. Further, the gradual increase on CaneLEG expression in internode suggests the action of this enzyme on the development of this storage tissue. The results obtained in this work will serve as an initial tool to understand the roles played by CaneLEG and CaneCPI-3 on sugarcane. / As legumaínas de plantas, também denominadas enzimas de processamento vacuolar (VPEs), são cisteíno-peptidases que atuam nos processos de maturação de sementes, germinação, senescência, resposta a estresse e morte celular programada durante o desenvolvimento da planta ou em resposta a patógenos. Apesar do crescente número de estudos com legumaínas de plantas, a maioria dos estudos está relacionada às legumaínas de dicotiledôneas e suas funções em sementes. No presente trabalho, foi realizada a caracterização de uma legumaína de cana-de-açúcar, denominada CaneLEG. A caracterização cinética da CaneLEG recombinante produzida em Pichia pastoris mostrou que esta enzima possui as características comuns de legumaínas de plantas, como a auto-ativação e atividade ótima em pH ácido. Além disso, a atividade da CaneLEG foi fortemente inibida pela cistatina de cana-de-açúcar denominada CaneCPI-3. A interação in vivo legumaínacistatina foi observada para as proteínas de cevada, indicando que as legumaínas podem ser inibidas por cistatinas na planta. Além disso, foi analisada a expressão dos genes da CaneLEG e CaneCPI-3 durante o desenvolvimento da cana e em plântulas tratadas com fitohormônios. A partir destes resultados, foi observado que estes genes apresentam um padrão de expressão temporal tecido-específica, com forte acúmulo de transcritos da CaneLEG durante o desenvolvimento do entrenó. A superexpressão dos genes CaneLEG e CaneCPI-3 em plântulas tratadas com ABA sugere que as proteínas por eles codificadas devem estar envolvidas na resposta a estresse, sendo possível que a CaneCPI-3 atue na regulação de cisteíno-peptidases endógenas. Nossos resultados sugerem a CaneCPI-3 como um inibidor endógeno da CaneLEG e o possível envolvimento dessas proteínas na resposta a estresse regulada por ABA. Além disso, o aumento gradual na expressão da CaneLEG em entrenó sugere a atuação desta enzima no desenvolvimento deste tecido de reserva. Os resultados obtidos neste trabalho servirão como base inicial para auxiliar no entendimento das funções desempenhadas pela CaneLEG e CaneCPI-3 na canade- açúcar.

Os rins desempenham um papel fundamental no sistema urinário e sua principal função é a filtração do sangue. Uma das causas que podem comprometer o funcionamento dos rins é a Insuficiência Renal Aguda (IRA) que é definida como a diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) de forma rápida e inesperada, causando a perda da função renal. Essa doença apresenta um número significativo de internações e também óbitos. O marcador padrão usado nos exames laboratoriais é a creatinina sérica, no entanto, a concentração da creatinina sérica pode variar dependendo de vários fatores, como idade, sexo, nutrição, entre outros. Além disso, sua concentração não varia consideravelmente nas primeiras indicações da lesão renal. Dessa forma, o diagnóstico é tardio e a função renal já pode estar comprometida. A proteína cistatina C (CST3) vem sendo indicada como um novo marcador para a doença, mostrando superioridade especialmente para detectar pequenas variações da TFG. A concentração da cistatina C não varia significativamente com a idade, sexo e massa muscular. Assim, foi desenvolvido um imunossensor para detectar a cistatina C, usando a configuração de transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET). Os eletrodos foram caracterizados por várias técnicas como MEV, microscopia de força atômica, técnicas eletroquímicas e também foi analisada a sensibilidade do ouro. As etapas de construção do imunossensor, e a interação do anticorpo com concentrações crescentes da proteína foram verificadas através de técnicas eletroquímicas, na faixa de concentração de 3 a 100 ng.mL-1. Nas medidas no SEGFET observou-se uma mudança significativa da corrente após a adição da cistatina C e para as substâncias interferentes não. O imunossensor apresentou alta sensibilidade detectando concentrações bem baixas da proteína alvo. A curva analítica &#916;IDS% x [CST3] obteve-se L.D. = 0,75 ng.mL-1, L.Q. = 2,27 ng.mL-1 e r = 0,98122. A curva analítica &#916;VGS% x [CST3] obteve-se L.D. = 0,28 ng.mL-1, L.Q. = 0,87 ng.mL-1 e r = 0,99846. Embora tenha algumas limitações o imunossensor é inovador e apresenta muitas vantagens podendo ser aplicado futuramente para o diagnóstico da doença. / The kidneys play a key role in the urinary system and its main function is the filtration of blood. One of the causes that can compromise the functioning of the kidneys is the Acute Kidney Injury (AKI), which is defined as the quickly and unexpected decrease in Glomerular Filtration Rate (GFR), causing the loss of kidney function. This disease presents a significant number of hospitalizations and also deaths. The standard marker used in laboratory tests is serum creatinine, however, serum creatinine concentration may vary depending on a number of factors, such as age, sex, nutrition, and so on. In addition, its concentration does not vary considerably in the first indications of renal injury. Thus, the diagnosis is delayed and renal function may already be compromised. The cystatin C protein (CST3) has been indicated as a new marker for the disease, showing superiority especially for detecting small variations in GFR. The concentration of cystatin C does not vary significantly with age, sex and muscle mass. Thus, an immunosensor was developed to detect cystatin C using the extended and a separate gate field effect transistor (SEGFET) configuration. The electrodes were characterized by several techniques such as SEM, atomic force microscopy, electrochemical techniques and also the sensitivity of gold was analyzed. The construction of the immunosensor, and the interaction of the antibody with increasing concentrations of the protein were verified by electrochemical techniques, in the concentration range of 3 to 100 ng.mL-1. In the measurements in the SEGFET a significant change of the current was observed after the addition of cystatin C and for the interfering substances there was no difference. The immunosensor showed high sensitivity detecting very low concentrations of the target protein. The analytical curve &#916;IDS% x [CST3] was obtained L.D. = 0,75 ng.mL-1, L.Q. = 2,27 ng.mL-1 and r = 0,98122. The analytical curve &#916;VGS% x [CST3] was obtained L.D. = 0,28 ng.mL-1, L.Q. = 0,87 ng.mL-1 and r = 0,99846. Although it has some limitations the immunosensor is innovative and presents many advantages and can be applied in the future to diagnose the disease.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1677.pdf: 3237644 bytes, checksum: 05775a00384d5ed86dce49771ff93425 (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / ABSTRACT Tumor metastasis is usually a major cause of death among cancer patients. Degradation and invasion of the extracellular matrix and basement membrane, key steps in the metastatic process, rely on the activity of proteolytic enzymes. The levels and activities of cathepsins B and L are considerably increased in cancer cells, and have been related to the invasive potential of these cells. Moreover, the levels of their endogenous inhibitors, the cystatins, are decreased, which results in an imbalance that contributes to the development of the metastatic phenotype. Thus, the potential use of cystatins as therapeutic agents in novel anti cancer strategies has been suggested. The sugarcane genome project (SUCEST FAPESP) allowed the identification of about 20 putative cystatins in this plant. In the present study, we describe the heterologous expression, purification and characterization of three cystatins from sugarcane, dubbed as CaneCPI-2, CaneCPI-3 and CaneCPI-4, which showed different inhibitory activities against human cathepsins B and L. While the three recombinant cystatins inhibited cathepsin L activity with Ki values of 0.17, 0.6 and 0.021 nM, respectively, only CaneCPI-4 was capable of efficiently inhibiting cathepsin B activity (Ki = 0.83 nM). Considering the involvement of these cathepsins in tumor cell invasion, the effect of the cystatins on the invasive ability of human breast cancer MDA-MB-231 cells was assessed after the addition of the recombinant cystatins to the cells, and in cell clones expressing the sugarcane cystatins. Overall, the Ki values correlated with the ability of the cystatins to inhibiting the cysteine cathepsin activity of the tumor cells as well as the cell invasion through a Matrigel&#63720; matrix. A slight reduction in the invasive ability was observed in the MDA-MB-231 cells expressing CaneCPI-4. In addition, a substantial reduction of ~ 60% in the cell invasion was obtained in the presence of 2 µM recombinant CaneCPI-2 or CaneCPI- 3, or 0.2 µM of CaneCPI-4. Finally, the cystatins showed negligible effects on the adhesion and proliferation of the cells. Our results open the possibility of considering these as well as other phytocystatins as therapeutics agents in anti-cancer strategies. / A principal causa de mortalidade em pacientes com câncer está associada ao estabelecimento de metástases pelo organismo. A degradação e invasão da matriz extracelular e lâmina basal, etapas chave no processo da metástase, envolvem a ação de enzimas proteolíticas. Em linhagens de células cancerosas as quantidades e a atividade das catepsinas B e L estão consideravelmente aumentadas, e têm sido correlacionadas ao potencial invasivo destas células. Ao mesmo tempo, as quantidades de seus inibidores endógenos, as cistatinas, estão consideravelmente diminuídas, gerando um desequilíbrio que contribui para o desenvolvimento do fenótipo metastático. Assim, no sentido de restabelecer o equilíbrio existente na célula normal, o uso das cistatinas como possíveis agentes terapêuticos em novas estratégias anti-câncer tem sido sugerido. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST FAPESP) possibilitou a identificação de cerca de 20 possíveis cistatinas nesta planta. No presente trabalho, descreve-se a expressão heteróloga, purificação e caracterização de três cistatinas da cana-de-açúcar, denominadas CaneCPI-2, CaneCPI-3 e CaneCPI-4, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra as catepsinas B e L humanas. Enquanto as três cistatinas inibiram a catepsina L com valores de Ki de 0,17, 0,6 e 0,021 nM, respectivamente, somente a CaneCPI-4 foi capaz de inibir eficientemente a catepsina B (Ki = 0,83 nM). Considerando o envolvimento das catepsinas B e L na invasão das células tumorais, o efeito das cistatinas da cana-de-açúcar sobre a habilidade invasiva da linhagem celular de câncer mamário humano MDA-MB-231 foi avaliado por meio da adição das cistatinas recombinantes às células, e também utilizando células transfectadas com os genes das cistatinas. De modo geral, os valores de Ki correlacionaram-se com a capacidade das cistatinas de inibir a atividade de cisteíno catepsinas das células tumorais, assim como, a invasão celular através de uma matriz de Matrigel. As células que expressavam a cistatina CaneCPI-4 apresentaram uma pequena redução na habilidade invasiva. Por outro lado, uma redução de ~ 60% na invasão celular foi obtida com 2 µM das cistatinas recombinantes CaneCPI-2 ou CaneCPI-3, ou 0,2 µM de CaneCPI-4. Entretanto, as cistatinas não apresentaram nenhum efeito sobre a adesão e a proliferação destas células. Nossos resultados abrem a possibilidade de considerar estas, assim como outras fitocistatinas, como possíveis agentes terapêuticos em estratégias anti-câncer.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMMS.pdf: 957649 bytes, checksum: 26153578cc56d59b9fd242494f3cd28d (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Financiadora de Estudos e Projetos / Due to the great economic importance of sugarcane crop in Brazil, the occurrence of infections by phytopathogens leading to decreased productivity and quality remains a serious problem. As the plants have natural mechanisms of defense against the attack of fungi and insects, amongst which the inhibitors of proteases are distinguished, the use of these substances in the development of resistant plants or in pesticide production may be an interesting alternative. One of the major classes of protease inhibitors acting against the attack of pathogens is the cystatins, proteins that inhibit cysteine proteases specifically. Canecystatin was the first cysteine protease inhibitor characterized from sugarcane. This gene codes for a ~ 14 kDa protein that contains conserved regions common to the cystatin family. Although the protein has previously been produced in a bacterial system of expression, in this work we use this sugarcane cystatin as a model for the implementation of a heterologous protein expression system in insect cells. This system has some advantages relatively to the prokaryotic system such as the possibility of posttranslational modifications. The recombinant protein was expressed in this system in a soluble form and purified using affinity chromatography in a nickel column, rendering approximately 23 mg/L of pure protein. The activity of the protein was assayed against papain, being capable of inhibiting the activity of this cysteine protease efficiently. Furthermore, the stability of the protein was analyzed in different conditions of pH and temperature. We conclude that the canecystatin is a good model for the implementation of the Baculovirus Expression System at the Molecular Biology Laboratory of the UFSCar / Devido à grande importância da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, a ocorrência de infecções por fitopatógenos constitui um grave problema que acarreta queda na produtividade e na qualidade da lavoura canavieira. Uma vez que as plantas têm mecanismos naturais de defesa contra o ataque de fungos e insetos, dentre os quais se destacam os inibidores de proteases, a utilização dessas substâncias no desenvolvimento de plantas resistentes ou na produção de pesticidas seria uma alternativa interessante. Um tipo de inibidor de protease que atua na proteção contra o ataque de patógenos e como proteínas de reservas em algumas sementes são as cistatinas, proteínas que inibem especificamente cisteínoproteases. A Canacistatina foi o primeiro inibidor de cisteíno-protease caracterizado originado da cana-de-açúcar. Apesar de já ter sido anteriormente produzida em sistema bacteriano de expressão, a Canacistatina foi utilizada, nesse trabalho, como modelo de estudo para implementação do sistema de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. Esse sistema apresenta algumas vantagens sobre o sistema procariótico como a possibilidade de realizarem modificações pós-traducionais. A proteína recombinante foi expressa nesse sistema na forma solúvel e purificada em cromatografia de afinidade em coluna de níquel, resultando em um rendimento de 23 gramas por litro de cultura. A proteína purificada foi submetida a testes de inibição enzimática contra a papaína, sendo capaz de inibir satisfatoriamente a atividade dessa cisteíno-protease. Também foram realizados testes de estabilidade desse inibidor em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando-se estável. A Canacistatina foi um modelo de estudo adequado para a implementação do sistema de expressão de proteínas no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCWR.pdf: 2377767 bytes, checksum: 22e5ef2553191133e9dfe9a15fc8707a (MD5) Previous issue date: 2007-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / Sugarcane is a plant of great economical importance, mainly in Brazil, which is currently the largest producer of this crop in the world. However, sugarcane farming has suffered attacks from pests and pathogens, leading to considerable economical losses. Therefore, a number of studies have focused on the development of more resistant sugarcane varieties. Our laboratory has been working on a sugarcane protein (CaneCPI- 1), which is a cystein-protease inhibitor protein. Based on studies that indicate that insects belonging to the order Coleoptera possess cystein-proteases in their mid-gut and with the knowledge that some species of Coleoptera are sugarcane pests, a transgenic sugarcane plant overexpressing the CaneCPI-1 gene was developed under the control of maize ubiquitin promoter. CaneCPI-1 was fused to a His-tag to facilitate further purification through affinity chromatography. The calli transformation was performed through biobalistics. The transformed plants were then selected by polymerase chain reaction. Positive plants were further selected by Semi-quantitative PCR and Western blotting. A transformed plant expressing a His-tagged CaneCPI-1 was selected for purification of the recombinant protein in a nickel column, enabling purification of HISCaneCPI-1 from plant leaves in a single step. The yield was about 6mg of pure protein per kilogram of sugarcane leaves. The HISCaneCPI-1 purified from the transformed sugarcane demonstrated inhibitory activity on the human cysteine protease cathepsin L. These studies demonstrate that the sugarcane can be a safe and viable expression system for recombinant protein production, and are the first step in the establishment of a sugarcane plant that is more resistant to pathogens. / A cana-de-açúcar é uma planta de grande importância econômica, principalmente no Brasil, que hoje é o maior produtor mundial desta cultura. Porém, as lavouras de canade- açúcar estão cada vez mais sendo atacadas e destruídas por pragas e patógenos, causando grandes perdas econômicas para os produtores. Assim, vários estudos estão focados no desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais resistentes. Nosso laboratório tem trabalhado com a proteína CaneCPI-1, uma proteína inibidora de cisteíno-protease. Baseado em estudos que indicam que insetos pertencentes à ordem Coleoptera possuem enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases em seu trato digestivo e, sabendo que algumas espécies de Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar e que causam sérios danos aos canaviais, foi desenvolvida uma cana-de-açúcar transgênica superexpressando o gene da CaneCPI-1 sobre controle do promotor da ubiquitina do milho. A CaneCPI-1 foi também fusionada a uma his-tag para facilitar a posterior purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Para a transformação genética dos calos foi utilizado o método de biobalística e, após isto, foi feita uma seleção das plantas transformadas através de uma reação de PCR. As plantas que apresentaram resultado positivo foram selecionadas por PCR Semi-quantitativo e ensaios de Western blotting. Uma planta transformada expressando a proteína CaneCPI- 1 com his-tag foi selecionada para a purificação da proteína recombinante em coluna de afinidade ao níquel, possibilitando a purificação da HISCaneCPI-1 em um único passo. O rendimento foi de 6mg de proteína pura por kilograma de folhas de cana-de-açúcar. A HISCaneCPI-1 purificada demonstrou atividade inibitória contra a enzima catepsina L, uma cisteíno-protease humana. Estes resultados mostram que a cana-de-açúcar pode ser usada como um sistema de expressão seguro e viável para a produção de proteínas recombinantes e é o primeiro passo para o estabelecimento de uma cana-de-açúcar resistente à pragas.