Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_3091_.pdf: 5412006 bytes, checksum: be06859c7e88c331680518d5ac8e82fa (MD5) Previous issue date: 2009-03-25 / Neste trabalho estudou-se a síntese, caracterização e algumas propriedades dos filmes de Poliacrilonitrila (PAN), quando adsorvidas cargas orgânicas de metaloporfirinas naturais, no caso específico moléculas orgânicas de propriedades químicas muito conhecidas, as clorofilas (Chl) e o citocromo c (Cyt-c) e também cargas inorgânicas: sais de Fe (II), Fe (III) e K+. Nos experimentos para obtenção dos dados, foram utilizadas as técnicas de espectroscopia no infravermelho (FTIR); Ultravioleta-Vísivel (UV-VIS); de fluorescência (EF); Mössbauer (EM); e também difração de raios-X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), analise térmica (TG e DSC), análise elementar, viscosimetria, voltametria, e medidas de resistividade. A síntese da PAN realizada em quatro repetições apresentou um rendimento acima de 77%. A massa molar da PAN foi obtida através de viscosimetria e o grau de cristalinidade foi obtido através de DRX, sendo estes dados comparáveis ao da literatura. No processo de adsorção de citocromo c, clorofilas, e sais de Fe(II), Fe(III) e K+ foram obtidos produtos com características próprias que foram analisadas através de FTIR, TG, DSC, UV-VIS e EF, o que demonstrou alterações significativas nas propriedades físicas e químicas destes materiais. Além das analises convencionais foram efetuadas analises de Mössbauer e medidas de condutividade dos materiais. As isotermas e a cinética de adsorção foram realizadas para os sais de Fe(III) e citocromo c mostrando resultados da adsorção destes substâncias na PAN.

A associação lipídio/citocromo c é importante e deve ser estudada, pois repercute na atividade peroxidática da proteína abordada e pode contribuir para o processo apoptótico, ou morte programada da célula, e também desempenha um papel significativo na cadeia respiratória. A natureza e a especificidade da interação do citocromo c com bicamadas lipídicas têm sido bastante investigadas ultimamente, mas informações detalhadas e precisas sobre tais assuntos ainda não existem. É aceito que ocorre primeiramente uma interação eletrostática entre a proteína citocromo c e as membranas fosfolipídicas. Em seguida, há uma interação hidrofóbica. Entretanto, ainda não é bem compreendido o papel da cadeia fosfolipídica. A associação do citocromo c com membranas lipídicas induz mudanças no estado de spin do átomo de ferro. A interação entre as vesículas carregadas e o citocromo c induz mudanças estruturais na proteína, as quais são refletidas no seu centro ativo, ou grupo heme. As mudanças do campo cristalino no sítio do ferro hemínico de forte para fraco são acompanhadas por mudanças do estado de spin de baixo para alto, respectivamente. Neste trabalho, estuda-se sistematicamente a natureza da interação entre o citocromo c e a cadeia fosfolipídica. As mudanças estruturais no grupo heme foram correlacionadas com a natureza do lipídio, ou seja, com a carga da cabeça e com o tamanho e o tipo da cadeia fosfolipídica. Foram utilizados treze lipídios diferentes, naturais e sintetizados, com cabeças polares negativas e neutras e com cadeias carbônicas saturadas e insaturadas de diferentes comprimentos. Para tal investigação, utilizamos as técnicas: Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) Onda Contínua (CW) e Pulsada (PW) e Dicroísmo Circular Magnético (MCD). As técnicas enunciadas avaliam as mudanças de estado de spin e a simetria do citocromo c nos seus estados férrico e ferroso. A interação lipoprotéica lipídio/citocromo c foi avaliada com lipídios diferentes, inclusive com o lipossomo PCPECL, que mimetiza a membrana interna da mitocôndria nos eucariontes. A partir dos resultados experimentais, sugerimos um modelo para esse tipo de associação. / This association lipid/cytochrome c is interesting to study in order to understand the peroxidase activity of this protein, that plays an important role in the respiratory chain and in the apoptosis process or the programmed cell death. The nature and specificity of the interaction of cytochrome c with lipid bilayers have been major goals in recent studies, but detailed information on that issue is not yet widely available. In this regard, it is generally accepted that the electrostatic interaction is an important factor in the association of cytochrome c with phospholipid membranes, followed by a hydrophobic interaction. However, the role played by the phospholipid chain is not well understood. The association of cytochrome c with negative membranes induces a change in the heme iron spin state. The interaction between the charged vesicles and cytochrome c leads to structural changes in the active central or heme group. The changing of the crystalline field of the heme iron from strong to weak is accompanied by spin states changes from low to high spin, respectively. These facts concerned us to investigate more systematically the nature of the interaction between cytochrome c and the phospholipid chains. The lipid-induced effects in the heme iron crystalline field are correlated to the nature of the charged head group and to the size and type of the phospholipid chain. Thirteen different lipids, nature and synthetic, were used, with negative and neutra1 polar head group and saturated and unsaturated acyl chains with different length. This work investigates the change of heme iron spin state and symmetry of ferric cytochrome c using Continuous Wave (CW) and pulsed (PW) Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Magnetic Circular Dichroism (MCD) techniques. These techniques analyze the spin state change and the symmetry of the iron cytochrome c in its ferric and ferrous states. The effect of the different lipids were analyzed, including PCPECL membrane that mimetics the inner mitocondrial membrane in eukaryotes.

A interação do citocromo c com a cardiolipina ocorre por interações eletrostáticas e hidrofóbicas. A formação do complexo citocromo c/ cardiolipina promove uma pequena mudança estrutural na proteína, que proporciona atividade peroxidásica ao citocromo c e consequentemente capacidade de oxidar substratos orgânicos, incluindo a cardiolipina. A oxidação da cardiolipina acompanhada da inserção de um grupo peróxido vem sendo relacionada à perda da interação hidrofóbica entre o complexo citocromo c/cardiolipina, que resulta no desligamento do citocromo c da membrana e na sua saída do espaço intermembranas para o citosol, onde essa proteína induz a cascata de apoptose. Neste trabalho foi avaliada a ligação do citocromo c a lipossomos contendo cardiolipina oxidada e a reatividade desta proteína com o mono-hidroperóxido da cardiolipina (TLCL(OOH)1) presente na membrana. Nossos dados mostraram que ocorre uma diminuição significativa na ligação do citocromo c a membrana oxidadas apenas quando 100% da cardiolipina presente na membrana está na forma de TLCL(OOH)1, condição que extrapolaria o que seria esperado para o sistema biológico. Análises por SDS-PAGE revelaram que o citocromo c sofre agregação na presença de membranas contendo TLCL(OOH)1, indicando que a proteína reage com este peróxido. De fato, determinamos a velocidade de reação do citocromo c com o TLCL(OOH)1 e com hidroperóxido do ácido linoléico, inseridos em membrana contendo cardiolipina (9,58 ± 0,16 x 102 M-1.s-1 e 6,91 ± 0,30 x 102 M-1.s-1, respectivamente). As velocidades de reação com os peróxidos de lipídio foram pelo menos 10 vezes superiores à velocidade medida com o peróxido de hidrogênio (5,91 ± 0,18 x101 M-1.s-1). Assim, mostramos que o citocromo c liga-se à membrana contendo hidroperóxido de cardiolipina e que reage com o mesmo promovendo a formação de agregado protéico de alto peso molecular / The interaction of cytochrome c with cardiolipin is promoted by electrostatic and hydrophobic interactions. The cytochrome c / cardiolipin complex formation causes structural changes in the protein that activates cytochrome c peroxidase activity, giving it the ability to oxidize organic substrates, including cardiolipin. The oxidation of cardiolipin coupled with a peroxide group insertion has been related to the loss of hydrophobic interactions between the cytochrome c / cardiolipin complex, resulting in cytochrome c release from the membrane and in its translocation from intermembranes space to cytosol, where this protein induces apoptosis cascade. In this work the binding of cytochrome c to liposomes containing oxidized cardiolipin and its reactivity with the membrane mono-hydroperoxides (TLCL(OOH)1) were evaluated. Our data showed a significant decrease in cytochrome c binding to oxidized membranes only when 100% of the membrane cardiolipin is in the TLCL(OOH)1 form, a condition that would extrapolate the expected concentrations that would be found in a biological system. SDS-PAGE analysis revealed that cytochrome c undergoes aggregation in the presence of membranes containing TLCL(OOH)1, indicating that this protein reacts with the peroxide. In fact, we determined the rate of cytochrome c reaction with TLCL(OOH)1 and linoleic acid hydroperoxide inserted into cardiolipin containing membranes (9.58 ± 0.16 x 102 M-1s-1 and 6.91 ± 0.30 x 102 M-1s-1,respectively). The reaction rates obtained with lipid peroxides were at least 10 times higher than that obtained with hydrogen peroxide (5.91 ± 0.18 x 101 M-1s-1).Thus we show that cytochrome c binds to membrane containing cardiolipin hydroperoxides and reacts with it promoting the formation of high molecular weight protein aggregates.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O emprego das tÃcnicas de eletroquÃmica, microbalanÃa de cristal quartzo (QCM â Quartz Crystal Microbalance) e ressonÃncia de plÃsmons de superfÃcie (SPR â Surface Plasmon Resonance) mostram que as espÃcies 1,4-ditiano (1,4-dt), 4-mercaptopiridina (pyS), 5-(4-piridil)-1,3,4-oxadiazol-2-tiol (Hpyt), tionicotinamida (TNA) e isotionicotinamida (iTNA) experimentam adsorÃÃo espontÃnea formando SAMs (Self-Assembled Monolayers) como resultado da imersÃo de substratos de ouro em soluÃÃo contendo estas espÃcies. As imagens obtidas por microscopia de varredura por tunelamento (STM â Scanning Tunneling Microscopy) indicam um arranjo prÃximo do hexagonal com exceÃÃo da iTNA cujas imagens nÃo foram conclusivas. Adicionalmente, as imagens indicam a existÃncia de defeitos nas SAMs mesmo apÃs longos perÃodos de imersÃo (24 h). Os estudos termodinÃmicos e cinÃticos dos processos de adsorÃÃo foram realizados por desorÃÃo redutiva em meio alcalino e QCM. Os valores dos potenciais de desorÃÃo redutiva, Edr, foram observados em −0,9, −0,8 e −0,5 V vs. Ag/AgCl/Cl- para a desorÃÃo de iTNA, TNA e Hpyt, respectivamente. Comparativamente Ãs espÃcies 1,4-dt (−0,8 V) e pyS (−0,5 V), o valor de Edr da SAM de Hpyt indica uma interaÃÃo sigma ao passo que aqueles observados para iTNA e TNA sugerem uma contribuiÃÃo pi adicional. Os valores de quantidade de material adsorvido (gama) e da taxa de recobrimento da superfÃcie (teta), calculados por desorÃÃo redutiva e impedÃncia eletroquÃmica, respectivamente, foram consistentes com as imagens de STM. Comparativamente aos resultados de desorÃÃo, os maiores valores de gama determinados por QCM foram atribuÃdos à presenÃa de molÃculas de Ãgua co-adsorvidas visto que foi observada uma relaÃÃo linear entre o excesso de massa e o momento de dipolo das espÃcies modificadoras. As curvas de desorÃÃo obtidas para pyS indicam a decomposiÃÃo da monocamada nÃo possibilitando, portanto, a determinaÃÃo dos parÃmetros termodinÃmicos e cinÃticos de adsorÃÃo. A correlaÃÃo com os resultados obtidos apÃs imersÃo do eletrodo de ouro em soluÃÃo de Na2S sugere que este processo està associado à quebra da ligaÃÃo C─S com formaÃÃo de uma camada de enxofre atÃmico e/ou oligomÃrico. As isotermas de adsorÃÃo obtidas para os processos de formaÃÃo das SAMs de Hpyt, TNA e iTNA, adequaram-se ao modelo de Langmuir permitindo a determinaÃÃo da variaÃÃo da energia livre de adsorÃÃo, ΔGads, como −35,9, −38,5 e −34,9 kJ mol−1, respectivamente. Estes valores sÃo indicativos de interaÃÃo forte sendo caracterÃsticos de processos de quimissorÃÃo. Para o modelo de Frumkin, os dados apresentaram melhores correlaÃÃes quando o parÃmetro de interaÃÃo (g) foi fixado em −0,45, −0,30 e −0,10, respectivamente, para as SAMs de Hpyt, TNA e iTNA indicando interaÃÃes repulsivas entre as molÃculas adjacentes. Os valores de pKa das SAMs de Hpyt (4,2), TNA (5,0 e 8,5) e iTNA (4,5 e 7,9) foi determinado por voltametria utilizando-se o Ãon complexo [Fe(CN)6]3−. Neste estudo, foram sugeridas modificaÃÃes, uma vez que o mÃtodo proposto na literatura dificulta a determinaÃÃo de mais de um valor de pKa como observado para as molÃculas de TNA e iTNA. As reaÃÃes de transferÃncia de elÃtrons (TE) das metaloproteÃnas citocromo c (cyt c) e mioglobina (Mb) foram estudadas utilizando-se as SAMs de Hpyt, TNA, iTNA, pyS e 1,4-dt. Para as SAMs de TNA e iTNA, o deslocamento positivo de 0,2V no valor do potencial de meia-onda do cyt c (pH~7,0) em relaÃÃo a forma nativa, foi atribuÃdo à densidade de carga positiva resultante da protonaÃÃo do grupo NH2 (pKa ~ 8,0). Resultados de QCM e SPR indicaram que hà a formaÃÃo de uma monocamada de cyt c sobre as SAMs estudadas. Esta monocamada, embora nÃo sendo redox ativa, permite o estudo da reaÃÃo de TE das molÃculas de cyt c em soluÃÃo sugerindo que este processo pode envolver os orbitais das molÃculas modificadoras. Para a metaloproteÃna Mb, utilizou-se uma SAM formada pelo aminoÃcido L-cisteÃna (cys), uma vez que nenhuma das SAMs estudadas acessou a reaÃÃo de TE. O processo redox foi observado em 0,086 V o que sugere a forma nativa. Os dados de QCM e SPR indicaram, tambÃm, a formaÃÃo de uma monocamada sobre a SAM de cys (Au/cys/Mb). Valores de â49,67 kJ mol−1 e −0,15 para ΔGads e g, respectivamente, foram calculados para a formaÃÃo da monocamada de Mb sobre a SAM de cys. O eletrodo Au/cys/Mb apresentou atividade catalÃtica em relaÃÃo a reaÃÃo de oxidaÃÃo do Ãcido ascÃrbico com uma diminuiÃÃo de 400 mV no sobrepotencial e uma reaÃÃo cineticamente controlada com uma constante de velocidade, kf, de ~2,0 x 10^4 L mol-1 s-1. / Electrochemical techniques, quartz crystal microbalance (QCM) and surface plÃsmons resonance (SPR) were used to study the formation of self-assembled monolayers (SAMs) of 1,4-ditiano (1,4-dt), 4-mercaptopyridine (pyS), 5-(4-piridinyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol (Hpyt), thionicotinamide (TNA) and thioisonicotinamide (iTNA) as a result of the immersion of gold substrates into the respective solutions. STM (Scanning Tunneling Microscopy) images indicate the sulfur atom as the adsorption site of these molecules and a hexagonal conformation on surface. For the iTNA molecule, the images were not conclusive. In addition, the images indicated the existence of defects even after longer immersion times (24 h). Thermodynamic and kinetic aspects of the adsorption process were evaluated by reductive desorption in alkaline media and QCM. The reductive desorption potentials, Edr, were observed at −0.9, −0.8, and −0.5 V vs. Ag/AgCl for the desorption of iTNA, TNA and Hpyt, respectively. In comparison to 1,4-dt (−0.8 V) and pyS (−0.5 V) species, the Edr value of Hpyt indicates a sigma interaction whereas those of iTNA and TNA indicate an additional pi contribution. The values of the concentration of adsorbed material, gama, and fractional coverage (teta ~ 0.9), determined, respectively, by reductive desorption and impedance are consistent with the STM images. In comparison to the desorption data, the higher values of gama calculated by QCM were assigned to the presence of water molecules since a linear relation was observed between the dipole moment and the mass change calculated by QCM. The desorption curves acquired for the pyS SAM indicated the decomposition of the monolayer thus not allowing the determination of the thermodynamic and kinetic parameters of adsorption. In comparison with the results obtained for the electrode modified after immersion in Na2S solution, it was suggested that this process is associated to the cleavage of the C─S bond which results in the formation of an adlayer composed of atomic and/or oligomeric sulfur species. The adsorption isotherms for Hpyt, TNA and iTNA fitted the Langmuir model of adsorption allowing the determination of the free energy of adsorption, ΔGads, as −35.9, −38.5 and −34,9 kJ/mol, respectively. These values are indicative of strong interaction being typical of chemisorption. For the Frumkin model, the best correlation was found when the interaction parameter, g, was established as −0.45, −0.20 and −0.10 for Hpyt, TNA and iTNA, respectively, indicating repulsive interactions between the adjacent molecules. Cyclic voltammetry was used to determinate the pKa of the SAMs of Hpyt (4.2), TNA (5.0 and 8.5) and iTNA (4.5 and 7.9) by using [Fe(CN)6]3− as a probe molecule. For this study, some changes were suggested since in the method proposed in the literature the existence of more than one protonation site was not considered thus not allowing the determination of more than one pKa value as was observed for TNA and iTNA molecules. Electron transfer reactions (TE) of cytochrome c (cyt c) and myoglobin (Mb) metalloproteins were studied by using the SAMs of Hpyt, TNA, iTNA, pyS and 1,4-dt. For the SAMs formed with TNA and iTNA, the positive shift of 0.2V on the half-wave potential of cyt c in relation to that of the native protein, was assigned to the positive charge density on surface in consequence of the protonation of NH2 groups (pKa~8.0) since these measurements were carried out in physiological medium. QCM and SPR data indicated the formation of a monolayer of cyt c on the studied SAMs. This monolayer, although not being electroactive, allows the study of the TE reaction of the cyt c molecules in solution suggesting that this process involves the orbitals of the modifier molecules. For the Mb metalloprotein, a SAM of L-cysteine amino acid was used since none of the studied sulfur molecules was able to access the TE reaction. The redox process was observed at 0.086 V suggesting the native form of Mb. QCM and SPR data indicated, also, the formation of a monolayer of Mb on the cys SAM (Au/cys/Mb). Values of â49.67 kJ mol−1 and −0.15 for ΔGads and g, respectively, were calculated for the formation of the monolayer of Mb on the cys SAM. The electrode Au/cys/Mb presented catalytic activity toward the oxidation reaction of ascorbic acid presenting a decrease of 400 mV in the overpotential and a kinetic controlled with a rate constant, kf, of 2.0 x 104 L mol-1 s-1.

Orientadora: Profa. Dra. Iseli Lourenço Nantes / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / Citocromo c é uma proteína formada por uma única cadeia polipeptídica, e em humanos, possui 104 resíduos de aminoácidos, estando associada à membrana interna mitocondrial, sintetizada no citosol como uma apoproteina. Os principais papeis biológicos de citocromo c são, atuação na cadeia de transporte de elétrons, papel oxidante e contribuição na apoptose, quando liberado no citosol. O citocromo c esta sujeito a modificações pós-traducionais que podem estar relacionados à sinalização, como, fosforilação ou agentes pró-oxidantes como é o caso da nitração. O SIN-1 é o principio ativo da Molsidomine (SIN-10), uma droga vasodiladora, estudos demonstraram que a incubação de SIN-1 com citocromo c produz uma espécie modificada de citocromo c. O superóxido reage com o óxido nítrico produzindo peroxinitrito, podendo, portanto, mimetizar essas condições. Os objetivos do trabalho foram investigar melhor essas espécies modificadas e caracterizar sua atividade através de técnicas espectroscópicas. Nas condições estudadas no presente trabalho é possível inferir que a presença da histidina 26 é fundamental para a formação da espécie modificada. A fosforilação das tirosinas 48 e 97 podem ter contribuído para a proteção contra o estresse nitroativo. Houve o desaparecimento da banda de absorção em 695 nm, o que pode indicar que o átomo de Fe perdeu a sexta coordenação com a metionina 80. Estudos posteriores devem ser realizados com o objetivo de avaliar a atividades biológicas dessas espécies modificadas.

A interação do citocromo c com a cardiolipina ocorre por interações eletrostáticas e hidrofóbicas. A formação do complexo citocromo c/ cardiolipina promove uma pequena mudança estrutural na proteína, que proporciona atividade peroxidásica ao citocromo c e consequentemente capacidade de oxidar substratos orgânicos, incluindo a cardiolipina. A oxidação da cardiolipina acompanhada da inserção de um grupo peróxido vem sendo relacionada à perda da interação hidrofóbica entre o complexo citocromo c/cardiolipina, que resulta no desligamento do citocromo c da membrana e na sua saída do espaço intermembranas para o citosol, onde essa proteína induz a cascata de apoptose. Neste trabalho foi avaliada a ligação do citocromo c a lipossomos contendo cardiolipina oxidada e a reatividade desta proteína com o mono-hidroperóxido da cardiolipina (TLCL(OOH)1) presente na membrana. Nossos dados mostraram que ocorre uma diminuição significativa na ligação do citocromo c a membrana oxidadas apenas quando 100% da cardiolipina presente na membrana está na forma de TLCL(OOH)1, condição que extrapolaria o que seria esperado para o sistema biológico. Análises por SDS-PAGE revelaram que o citocromo c sofre agregação na presença de membranas contendo TLCL(OOH)1, indicando que a proteína reage com este peróxido. De fato, determinamos a velocidade de reação do citocromo c com o TLCL(OOH)1 e com hidroperóxido do ácido linoléico, inseridos em membrana contendo cardiolipina (9,58 ± 0,16 x 102 M-1.s-1 e 6,91 ± 0,30 x 102 M-1.s-1, respectivamente). As velocidades de reação com os peróxidos de lipídio foram pelo menos 10 vezes superiores à velocidade medida com o peróxido de hidrogênio (5,91 ± 0,18 x101 M-1.s-1). Assim, mostramos que o citocromo c liga-se à membrana contendo hidroperóxido de cardiolipina e que reage com o mesmo promovendo a formação de agregado protéico de alto peso molecular / The interaction of cytochrome c with cardiolipin is promoted by electrostatic and hydrophobic interactions. The cytochrome c / cardiolipin complex formation causes structural changes in the protein that activates cytochrome c peroxidase activity, giving it the ability to oxidize organic substrates, including cardiolipin. The oxidation of cardiolipin coupled with a peroxide group insertion has been related to the loss of hydrophobic interactions between the cytochrome c / cardiolipin complex, resulting in cytochrome c release from the membrane and in its translocation from intermembranes space to cytosol, where this protein induces apoptosis cascade. In this work the binding of cytochrome c to liposomes containing oxidized cardiolipin and its reactivity with the membrane mono-hydroperoxides (TLCL(OOH)1) were evaluated. Our data showed a significant decrease in cytochrome c binding to oxidized membranes only when 100% of the membrane cardiolipin is in the TLCL(OOH)1 form, a condition that would extrapolate the expected concentrations that would be found in a biological system. SDS-PAGE analysis revealed that cytochrome c undergoes aggregation in the presence of membranes containing TLCL(OOH)1, indicating that this protein reacts with the peroxide. In fact, we determined the rate of cytochrome c reaction with TLCL(OOH)1 and linoleic acid hydroperoxide inserted into cardiolipin containing membranes (9.58 ± 0.16 x 102 M-1s-1 and 6.91 ± 0.30 x 102 M-1s-1,respectively). The reaction rates obtained with lipid peroxides were at least 10 times higher than that obtained with hydrogen peroxide (5.91 ± 0.18 x 101 M-1s-1).Thus we show that cytochrome c binds to membrane containing cardiolipin hydroperoxides and reacts with it promoting the formation of high molecular weight protein aggregates.

A associação lipídio/citocromo c é importante e deve ser estudada, pois repercute na atividade peroxidática da proteína abordada e pode contribuir para o processo apoptótico, ou morte programada da célula, e também desempenha um papel significativo na cadeia respiratória. A natureza e a especificidade da interação do citocromo c com bicamadas lipídicas têm sido bastante investigadas ultimamente, mas informações detalhadas e precisas sobre tais assuntos ainda não existem. É aceito que ocorre primeiramente uma interação eletrostática entre a proteína citocromo c e as membranas fosfolipídicas. Em seguida, há uma interação hidrofóbica. Entretanto, ainda não é bem compreendido o papel da cadeia fosfolipídica. A associação do citocromo c com membranas lipídicas induz mudanças no estado de spin do átomo de ferro. A interação entre as vesículas carregadas e o citocromo c induz mudanças estruturais na proteína, as quais são refletidas no seu centro ativo, ou grupo heme. As mudanças do campo cristalino no sítio do ferro hemínico de forte para fraco são acompanhadas por mudanças do estado de spin de baixo para alto, respectivamente. Neste trabalho, estuda-se sistematicamente a natureza da interação entre o citocromo c e a cadeia fosfolipídica. As mudanças estruturais no grupo heme foram correlacionadas com a natureza do lipídio, ou seja, com a carga da cabeça e com o tamanho e o tipo da cadeia fosfolipídica. Foram utilizados treze lipídios diferentes, naturais e sintetizados, com cabeças polares negativas e neutras e com cadeias carbônicas saturadas e insaturadas de diferentes comprimentos. Para tal investigação, utilizamos as técnicas: Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) Onda Contínua (CW) e Pulsada (PW) e Dicroísmo Circular Magnético (MCD). As técnicas enunciadas avaliam as mudanças de estado de spin e a simetria do citocromo c nos seus estados férrico e ferroso. A interação lipoprotéica lipídio/citocromo c foi avaliada com lipídios diferentes, inclusive com o lipossomo PCPECL, que mimetiza a membrana interna da mitocôndria nos eucariontes. A partir dos resultados experimentais, sugerimos um modelo para esse tipo de associação. / This association lipid/cytochrome c is interesting to study in order to understand the peroxidase activity of this protein, that plays an important role in the respiratory chain and in the apoptosis process or the programmed cell death. The nature and specificity of the interaction of cytochrome c with lipid bilayers have been major goals in recent studies, but detailed information on that issue is not yet widely available. In this regard, it is generally accepted that the electrostatic interaction is an important factor in the association of cytochrome c with phospholipid membranes, followed by a hydrophobic interaction. However, the role played by the phospholipid chain is not well understood. The association of cytochrome c with negative membranes induces a change in the heme iron spin state. The interaction between the charged vesicles and cytochrome c leads to structural changes in the active central or heme group. The changing of the crystalline field of the heme iron from strong to weak is accompanied by spin states changes from low to high spin, respectively. These facts concerned us to investigate more systematically the nature of the interaction between cytochrome c and the phospholipid chains. The lipid-induced effects in the heme iron crystalline field are correlated to the nature of the charged head group and to the size and type of the phospholipid chain. Thirteen different lipids, nature and synthetic, were used, with negative and neutra1 polar head group and saturated and unsaturated acyl chains with different length. This work investigates the change of heme iron spin state and symmetry of ferric cytochrome c using Continuous Wave (CW) and pulsed (PW) Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Magnetic Circular Dichroism (MCD) techniques. These techniques analyze the spin state change and the symmetry of the iron cytochrome c in its ferric and ferrous states. The effect of the different lipids were analyzed, including PCPECL membrane that mimetics the inner mitocondrial membrane in eukaryotes.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os complexos trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+ (CNpy = 4-Cianopiridina, 1,4- dt = 1,4-ditiano), trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+ (pyS = 4-mercaptopiridina) e trans- [Ru(CNpy)(NH3)4(Tio)]2+ (Tio = tionicotinamida) foram sintetizados e caracterizados por Cromatografia LÃquida de Alta EficiÃncia, anÃlise elementar, eletroquÃmica e espectroscopias eletrÃnica e vibracional. Os espectros de absorÃÃo eletrÃnica e os resultados de eletroquÃmica evidenciaram uma interaÃÃo do tipo π back-bonding do centro metÃlico RuII para os ligantes piridÃnicos. Os valores dos potenciais formais de meia onda (E1/2) observados para os complexos trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+, trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+ e trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(Tio)]2+: 1,00, 0,67 e 1,03 V vs ENH, respectivamente, indicam a estabilizaÃÃo do estado reduzido do centro metÃlico em relaÃÃo ao complexo de partida trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(OH2)]2+ (E1/2 = 0,35 V vs ENH). Esse resultado indica, tambÃm, a forte capacidade π retiradora do ligante CNpy que, no caso do complexo trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+, à tÃo intensa que facilita comparativamente o processo de oxidaÃÃo do centro metÃlico. Podese concluir, portanto, que a capacidade π retiradora dos ligantes CNpy, pyS e Tio à similar. O deslocamento na freqÃÃncia de estiramento da ligaÃÃo C≡N do ligante Cnpy livre de 2239 para ∼2200 cm-1 apÃs coordenaÃÃo ao centro metÃlico [Ru(NH3)4]2+ nos espectros vibracionais indica que a coordenaÃÃo do ligante CNpy ocorre pelo grupamento nitrila. Para os ligantes pyS e Tio, a observaÃÃo das bandas atribuÃdas aos νC=S e νSH, respectivamente, indica que a coordenaÃÃo ocorre pelo Ãtomo de nitrogÃnio do anel piridÃnico. Os espectros SERS ex situ das superfÃcies modificadas com os compostos isolados permitem a classificaÃÃo destes como molÃculas modificadoras bifuncionais, onde o Ãtomo de enxofre dos ligantes pyS, 1,4-dt e Tio atuam como sÃtio de adsorÃÃo e o Ãtomo de nitrogÃnio piridÃnico do ligante CNpy atua como grupo funcional terminal. AlÃm disso, os resultados SERS sugerem uma conformaÃÃo trans para o complexo trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+ e gauche para os complexos trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+ e trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(Tio)]2+ sobre ouro. A dependÃncia nas intensidades das bandas com o potencial aplicado aos eletrodos modificados ilustra o efeito π back-bonding dos Ãons metÃlicos dos adsorbatos inorgÃnicos, uma vez que observa-se uma relaÃÃo direta com os valores dos potenciais formais de meia onda dos complexos estudados. Os valores dos potenciais de dessorÃÃo redutiva observados para as SAMs dos complexos isolados refletem a capacidade π retiradora do ligante CNpy que se encontra na posiÃÃo para em relaÃÃo ao sÃtio de adsorÃÃo. Esse efeito à bem mais intenso no complexo trans- [Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+, uma vez que a capacidade de interaÃÃo π back-bonding do ligante 1,4-dt à significativamente menor que as dos ligantes pyS e Tio. Sugere-se, para esse complexo, uma oxidaÃÃo parcial do centro metÃlico o que implica em uma intensificaÃÃo da interaÃÃo σ com o ligante 1,4-dt (RuII-S) e, conseqÃentemente, um enfraquecimento da ligaÃÃo Au-S. A reaÃÃo hTE da metaloproteÃna cyt c foi observada em valor consistente com seu estado in natura indicando que as SAMs estudadas acessam satisfatoriamente o processo hTE do cyt c alÃm de evitar a desnaturaÃÃo desta proteÃna. A forma das curvas voltamÃtricas, entretanto, apresentou uma dependÃncia com a configuraÃÃo dos complexos sobre a superfÃcie. Curvas de melhor definiÃÃo foram obtidas com a SAM do complexo trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+ que apresenta uma configuraÃÃo trans em relaÃÃo à superfÃcie. / Trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(L)]2+ type complexes, where CNpy (4- Cyanopyridine), L= 1,4-dt (1,4-dithiane), pyS (4-mercaptopyridine), and Tio (thionicotinamide), were synthesized and characterized by HPLC, microanalysis, eletrochemistry and vibrational and eletronic spectroscopies. The eletrochemical and eletronic absorption results are indicative of a π back-bonding interaction, L(nπ*) ← RuII(dπ) for which L is the pyS, CNpy and Tio ligands. The half-wave formal potentials (E1/2) observed for the trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+, trans- [Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+ and trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(Tio)]2+ complexes: 1.00, 0.67 and 1.03 V vs NHE, respectively, are indicative of the stabilization of the metal in the reduced state comparatively to the start complex, trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(OH2)]2+ (E1/2 = 0.35 V vs NHE). This result indicates, also, the strong π withdraw capability of the CNpy ligand. The shift observed for the νC≡N mode from 2239 cm-1 in the vibrational spectra of the CNpy free ligand to ∼2200 cm-1 upon coordination suggests that the coordination occurs through the nitrile fragment. For the pyS and Tio ligands, the observation of the signals assigned to the νC=S and νSH modes, respectively, in the vibrational spectra os the complexes indicates that the coordination occurs through the nitrogen atom os the pyridine ring. The SERS ex situ spectra of the gold surfaces modified with the isolated complexes allow the classification of these species as binfunctional molecules in which the sulfur atom of the pyS, 1,4-dt and Tio ligands is the adsorption site and the nitrogen atom of the CNpy pyridine ring is the functional terminal group. Also, the SERS results point for a trans conformation for the trans- [Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+ complex and for a gauche configuration for the trans- [Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+ and trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(Tio)]2+ complexes on gold. The intensity dependence of some signals in the SERS spectra with the applie potential reflects the π back-bonding effect on surface since this behavior is observed to be strongly related to the E1/2 values of the complexes. The reductive desorption potentials of the SAMs formed with the isolated compounds reflects the π withdraw capability of the CNpy ligand. This effect is much more intense for the trans-[Ru(CNpy)(NH3)4(1,4-dt)]2+ complex since the π back-bonding interaction of the 1,4-dt ligand is lower than the CNpy, pyS and Tio ligands. The heterogeneous electron transfer reaction of the cytochrome c metalloprotein was satisfactorily assessed with the SAMs formed by the isolated complexes (E1/2 = 0.05 V vs Ag⏐AgCl⏐Cl-). The Best voltammetric response was observed with the SAM of the trans- [Ru(CNpy)(NH3)4(pyS)]2+ complex due to the trans conformation on surface.

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos. Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima. Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico, como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade. / The aim of this work is to study the electrochemical behavior of biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor, methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also studied. Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and viscosity.

Orientador: Daniel Zanetti de Flório. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2013