As leishmanioses são um conjunto de doenças infecto parasitárias, de caráter zoonótico, que acometem os seres humanos, animais domésticos e silvestres, causadas por protozoários do gênero Leishmania. O presente trabalho objetivou comparar o desempenho de testes moleculares empregados no diagnóstico da leishmaniose visceral canina, em cães classificados em diferentes estágios clínicos da doença. Foram coletadas amostras biológicas, sangue e suabe conjuntival, em 215 cães, das cidades de Pirassununga, Santa Cruz das Palmeiras, Andradina e Ilha Solteira, todas localizadas no Estado de São Paulo, e foram separados e classificados em quatro estágios clínicos: assintomáticos, doença leve, moderada e severa, conforme os sinais clínicos, além da sorologia, hemograma e perfil bioquímico. Além disso, os animais foram submetidos a testes moleculares de PCR convencional com os primers 13A/13B, MC1/MC2, Nested-PCR ITS1, com os primers LITSR e L58S, PCR em tempo real com os primers LEISH-1 e LEISH-2 e sonda TaqMan-MGB. Nos resultados foi observado que os primers 13A e 13B, direcionados a amplificar fragmentos de kDNA de Leishmania spp., possuem uma maior capacidade em detectar animais positivos no sangue em estágio inicial de sintomatologia clínica, quando comparados aos outros (p<0,05). Utilizando amostras de suabe conjuntival não houve diferença significativa na detecção de animais positivos entre as diferentes fases clínicas e diferentes testes moleculares avaliados (p>0,05), exceto com relação aos primers MC1 e MC2, que foram significativamente menos capazes de detectar cães positivos na fase inicial da doença que os outros (p<0,05). As amostras positivas ao ITS1 sequenciadas apresentaram 99 a 100% de similaridade com Leishmania infantum. Podemos concluir que a PCR com os primers MC1 e MC2 não é indicada na detecção de cães com leishmaniose e que a PCR de sangue com os primers 13A e 13B é mais eficiente na detecção de animais no início da doença. Os resultados reforçam a necessidade de se aprimorar as ferramentas de diagnóstico e de se associar mais de uma técnica e/ou tipo de amostra para a detecção eficiente da leishmaniose canina. / Leishmaniasis is a group of parasitic infectious diseases with zoonotic potential that affect humans, domestic, and wild animals caused by protozoa of the genus Leishmania. The present study aimed to compare the performance of molecular tests used in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in dogs classified in different clinical stages of the disease. Biological samples, blood and conjunctival swab, were collected from 215 dogs from cities of Pirassununga, Santa Cruz das Palmeiras, Andradina, and Ilha Solteira, all of them located in the State of São Paulo. The animals were separated into four clinical stages: asymptomatic, mild disease, moderate disease, and severe disease according to the clinical signs, serology, hemograma, and biochemical profile. In addition, the animals were submitted to conventional PCR molecular tests with primers 13A / 13B, MC1 / MC2, Nested-PCR ITS1, with primers LITSR and L58S, real-time PCR with LEISH-1 and LEISH-2 primers, and TaqMan-MGB probe. In the results, it was observed that primers 13A and 13B directed to amplify fragments of Leishmania spp. kDNA have greater capacity to detect positive animals in blood and initial stage of clinical symptomatology, when compared to others (p<0.05). There was no significant difference in the detection of positive animals between the different clinical phases and different molecular tests evaluated using conjunctival swab samples (p>0.05), except for primers MC1 and MC2, which were significantly less able to detect positive dogs in the initial phase of the disease than the others (p<0.05). Sequenced positive samples by ITS1 showed 99 to 100% similarity to Leishmania infantum. We can conclude that PCR with the primers MC1 and MC2 is not indicated in the detection of dogs with leishmaniasis, and the PCR of blood with the primers 13A and 13B is more efficient in the detection of animals at the beginning of the disease than others. The results reinforce the necessity to improve diagnostic tools and to associate more than one technique and/or type of sample for efficient detection of canine leishmaniasis.

O comprometimento do trato gastrintestinal pela endometriose em 40 pacientes com endometriose pélvica foi avaliado pelo método da COPE. A coorte estudada compreendeu 21 pacientes com sinais e sintomas gastrintestinais e 19 pacientes sem sinais e sintomas gastrintestinais, visando a estabelecer: 1. associações e correlações entre os parâmetros clínicos que sinalizam a presença de endometriose e as localizações das lesões em cada segmento do trato gastrintestinal; 2. correlação entre o estadiamento da endometriose (ASRM, 1996) e o comprometimento gastrintestinal e 3. correlação entre a classificação histológica da endometriose e o comprometimento gastrintestinal. Através da COPE, o diagnóstico e as correlações entre sinais e sintomas ginecológicos, ultra-sonografia vaginal, classificação da ASRM e histologia, com as características distributivas da doença no trato gastrintestinal, demonstraram que: 1. A idade foi significativamente mais elevada nas pacientes com sinais e sintomas no TGI; 2. A detecção de lesões no TGI ocorreu em 70% das pacientes; 3. A dismenorréia em intensidade severa ou incapacitante e dispareunia em intensidade severa correlacionaram-se com a endometriose ginecológica e a endometriose do trato gastrintestinal na presença de sinais e sintomas no TGI; 4. Os sinais e sintomas gastrintestinais correlacionados com a endometriose ginecológica e do TGI, foram o puxo e o tenesmo cíclico, a dor em cólica cíclica, a obstipação cíclica, a diarréia cíclica, a dor pélvica acíclica, as fezes afiladas e o sangramento intestinal cíclico; 5. A endometriose que provoca sinais e sintomas no TGI está localizada no segmento retossigmóide e/ou no íleo. A dispareunia e a dismenorréia apontam para o acometimento do íleo. A infertilidade sinaliza para a endometriose no apêndice; 6. Nas correlações do toque vaginal com os achados da COPE, o aumento anexial correlaciona-se com retossigmóide e íleo, o espessamento ou nódulo ligamentar, correlaciona-se com o reto e a presença de nódulo no fundo de saco ou lesão no septo reto-vaginal, sinaliza para o acometimento do cólon sigmóide; 7. A COPE aplicada a pacientes com suspeita de endometriose no segmento retossigmóide levantada pela ultra-sonografia transvaginal mostra que a doença se estende em associação significante ao reto, ao cólon sigmóide, cólon ascendente e íleo; 8. A COPE demonstrou que a endometriose acomete mais freqüentemente o íleo, o apêndice, o segmento retossigmoideano e o cólon ascendente na existência ou não de sinais e sintomas do TGI; 9. Os padrões histológicos distribuíram-se igualmente pelas lesões endometrióticas do TGI exceto nas lesões do mesentério; 10. O estádio IV da ASRM, 1996, é fator de risco significativo para o acometimento do reto, sigmóide e íleo. / The importance of the laparoscopic procedure padronization to the run in the peritoneal organs was established in 40 patients with pelvic endometriosis through the observation of its efficient in the characterization of the gastrointestinal tract endometriosis distribution and in the establishment of the meaningful correlations among the most important aspects of the gynecological clinic, vaginal ultrasonagraphic exam, ASRM and histology with gastrointestinal signs and symptoms. The run in the peritoneal organs in the endometriosis has permitted the diagnosis of the endometriosis disease real extension if compared to the competing methods previously described in the pertinent literature

O comprometimento do trato gastrintestinal pela endometriose em 40 pacientes com endometriose pélvica foi avaliado pelo método da COPE. A coorte estudada compreendeu 21 pacientes com sinais e sintomas gastrintestinais e 19 pacientes sem sinais e sintomas gastrintestinais, visando a estabelecer: 1. associações e correlações entre os parâmetros clínicos que sinalizam a presença de endometriose e as localizações das lesões em cada segmento do trato gastrintestinal; 2. correlação entre o estadiamento da endometriose (ASRM, 1996) e o comprometimento gastrintestinal e 3. correlação entre a classificação histológica da endometriose e o comprometimento gastrintestinal. Através da COPE, o diagnóstico e as correlações entre sinais e sintomas ginecológicos, ultra-sonografia vaginal, classificação da ASRM e histologia, com as características distributivas da doença no trato gastrintestinal, demonstraram que: 1. A idade foi significativamente mais elevada nas pacientes com sinais e sintomas no TGI; 2. A detecção de lesões no TGI ocorreu em 70% das pacientes; 3. A dismenorréia em intensidade severa ou incapacitante e dispareunia em intensidade severa correlacionaram-se com a endometriose ginecológica e a endometriose do trato gastrintestinal na presença de sinais e sintomas no TGI; 4. Os sinais e sintomas gastrintestinais correlacionados com a endometriose ginecológica e do TGI, foram o puxo e o tenesmo cíclico, a dor em cólica cíclica, a obstipação cíclica, a diarréia cíclica, a dor pélvica acíclica, as fezes afiladas e o sangramento intestinal cíclico; 5. A endometriose que provoca sinais e sintomas no TGI está localizada no segmento retossigmóide e/ou no íleo. A dispareunia e a dismenorréia apontam para o acometimento do íleo. A infertilidade sinaliza para a endometriose no apêndice; 6. Nas correlações do toque vaginal com os achados da COPE, o aumento anexial correlaciona-se com retossigmóide e íleo, o espessamento ou nódulo ligamentar, correlaciona-se com o reto e a presença de nódulo no fundo de saco ou lesão no septo reto-vaginal, sinaliza para o acometimento do cólon sigmóide; 7. A COPE aplicada a pacientes com suspeita de endometriose no segmento retossigmóide levantada pela ultra-sonografia transvaginal mostra que a doença se estende em associação significante ao reto, ao cólon sigmóide, cólon ascendente e íleo; 8. A COPE demonstrou que a endometriose acomete mais freqüentemente o íleo, o apêndice, o segmento retossigmoideano e o cólon ascendente na existência ou não de sinais e sintomas do TGI; 9. Os padrões histológicos distribuíram-se igualmente pelas lesões endometrióticas do TGI exceto nas lesões do mesentério; 10. O estádio IV da ASRM, 1996, é fator de risco significativo para o acometimento do reto, sigmóide e íleo. / The importance of the laparoscopic procedure padronization to the run in the peritoneal organs was established in 40 patients with pelvic endometriosis through the observation of its efficient in the characterization of the gastrointestinal tract endometriosis distribution and in the establishment of the meaningful correlations among the most important aspects of the gynecological clinic, vaginal ultrasonagraphic exam, ASRM and histology with gastrointestinal signs and symptoms. The run in the peritoneal organs in the endometriosis has permitted the diagnosis of the endometriosis disease real extension if compared to the competing methods previously described in the pertinent literature

As leishmanioses são um conjunto de doenças infecto parasitárias, de caráter zoonótico, que acometem os seres humanos, animais domésticos e silvestres, causadas por protozoários do gênero Leishmania. O presente trabalho objetivou comparar o desempenho de testes moleculares empregados no diagnóstico da leishmaniose visceral canina, em cães classificados em diferentes estágios clínicos da doença. Foram coletadas amostras biológicas, sangue e suabe conjuntival, em 215 cães, das cidades de Pirassununga, Santa Cruz das Palmeiras, Andradina e Ilha Solteira, todas localizadas no Estado de São Paulo, e foram separados e classificados em quatro estágios clínicos: assintomáticos, doença leve, moderada e severa, conforme os sinais clínicos, além da sorologia, hemograma e perfil bioquímico. Além disso, os animais foram submetidos a testes moleculares de PCR convencional com os primers 13A/13B, MC1/MC2, Nested-PCR ITS1, com os primers LITSR e L58S, PCR em tempo real com os primers LEISH-1 e LEISH-2 e sonda TaqMan-MGB. Nos resultados foi observado que os primers 13A e 13B, direcionados a amplificar fragmentos de kDNA de Leishmania spp., possuem uma maior capacidade em detectar animais positivos no sangue em estágio inicial de sintomatologia clínica, quando comparados aos outros (p<0,05). Utilizando amostras de suabe conjuntival não houve diferença significativa na detecção de animais positivos entre as diferentes fases clínicas e diferentes testes moleculares avaliados (p>0,05), exceto com relação aos primers MC1 e MC2, que foram significativamente menos capazes de detectar cães positivos na fase inicial da doença que os outros (p<0,05). As amostras positivas ao ITS1 sequenciadas apresentaram 99 a 100% de similaridade com Leishmania infantum. Podemos concluir que a PCR com os primers MC1 e MC2 não é indicada na detecção de cães com leishmaniose e que a PCR de sangue com os primers 13A e 13B é mais eficiente na detecção de animais no início da doença. Os resultados reforçam a necessidade de se aprimorar as ferramentas de diagnóstico e de se associar mais de uma técnica e/ou tipo de amostra para a detecção eficiente da leishmaniose canina. / Leishmaniasis is a group of parasitic infectious diseases with zoonotic potential that affect humans, domestic, and wild animals caused by protozoa of the genus Leishmania. The present study aimed to compare the performance of molecular tests used in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in dogs classified in different clinical stages of the disease. Biological samples, blood and conjunctival swab, were collected from 215 dogs from cities of Pirassununga, Santa Cruz das Palmeiras, Andradina, and Ilha Solteira, all of them located in the State of São Paulo. The animals were separated into four clinical stages: asymptomatic, mild disease, moderate disease, and severe disease according to the clinical signs, serology, hemograma, and biochemical profile. In addition, the animals were submitted to conventional PCR molecular tests with primers 13A / 13B, MC1 / MC2, Nested-PCR ITS1, with primers LITSR and L58S, real-time PCR with LEISH-1 and LEISH-2 primers, and TaqMan-MGB probe. In the results, it was observed that primers 13A and 13B directed to amplify fragments of Leishmania spp. kDNA have greater capacity to detect positive animals in blood and initial stage of clinical symptomatology, when compared to others (p<0.05). There was no significant difference in the detection of positive animals between the different clinical phases and different molecular tests evaluated using conjunctival swab samples (p>0.05), except for primers MC1 and MC2, which were significantly less able to detect positive dogs in the initial phase of the disease than the others (p<0.05). Sequenced positive samples by ITS1 showed 99 to 100% similarity to Leishmania infantum. We can conclude that PCR with the primers MC1 and MC2 is not indicated in the detection of dogs with leishmaniasis, and the PCR of blood with the primers 13A and 13B is more efficient in the detection of animals at the beginning of the disease than others. The results reinforce the necessity to improve diagnostic tools and to associate more than one technique and/or type of sample for efficient detection of canine leishmaniasis.

Inactivation of tumor supressor gene BRCA1 causes a life-long risk of breast carcinoma development. Genetic screenings of indicated individuals from high-risk families help to identify large number of sequence variants in known predisposing genes. Majority of discovered variants doesn't have clinical significance yet which causes a big problem for diagnostics. Some of these variants are found within regulatory non-coding regions of gene. A part of the clinical classification of variants is their functional characterization. The goal of this thesis was to create a model system for functional characterization of variants in non-coding regions and to verify its function. Model system was based on targeted gene manipulation by co-transfecting CRISPR-Cas9 construct and donor construct that contained a portion of BRCA1 gene sequence with analyzed modifications, into U2 OS cells. The cells have stably integrated DR-GFP system which allows the activity of homologous recombination (HR) to be determined. Monoallelic modifications were induced into U2 OS cells. These modifications were in a Kozak sequence region of BRCA1 gene. Expression level of BRCA1 mRNA was determined by qRT-PCR, which showed the same levels of mRNA in all cells with analyzed alterations. Next, expression level of BRCA1 protein was...