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<p> The most uncommon form of tetracycline resistance is enzymatic inactivation of the drug. The first protein characterized that was shown to have this ability was TetX, a 44-kDa cytoplasmic protein responsible for inactivating tetracycline in E. coli. The associated gene, tetX, was found on a transposon in the bacterium Bacteroides fragilis, and encodes an NADP-requiring, FAD-dependent monooxygenase. TetX modifies the structure of tetracycline by the addition of a hydroxyl to the C-11a position, altering the β-diketone system of the tetracycline that is responsible for antibiotic activity. This project was designed to search for novel tetracycline inactivators, and to determine the origin of the tetX. Initially, the search for TetX-like proteins in S. coelicolor and C. hutchinsonii was performed using homologous protein sequences found using BLAST searches. Each of the genes encoding the homologous protein sequences was cloned, over-expressed and purified, then analyzed using HPLC and LC/MS methods to determine their tetracycline inactivating ability. Next, the published tetracycline inactivators Tet34 and Tet37 were tested for their ability to inactivate the drug using HPLC and LC/MS methods, after being cloned, over-expressed and purified. Finally, a search of the Actinomycete library belonging to the Wright Laboratory was conducted looking for novel tetracycline inactivators. Bioassays were the first step in a series of experiments done, with HPLC and LC/MS assays eventually being used to determine if an inactivation event was occurring. The homologous sequences from S. coelicolor and C. hutchinsonii did not inactivate tetracycline as determined by HPLC and LC/MS data. The potential inactivators, Tet34 and Tet37, were also found to be void of tetracycline inactivating activity. Finally, one isolate in the actinomycete library was thought to be inactivating the drug, however, upon further inspection via HPLC and LC/MS methods this inactivation event was dismissed. Future research should focus on the search for novel enzymes capable of modifying the structure of tetracycline, as well as the origin of the only known tetracycline inactivator, tetX.</p> / Thesis / Master of Science (MSc)

Clonagem ou técnica de transferência nuclear (TN) permite a geração de um organismo geneticamente idêntico a outro. Inúmeras aplicações da TN têm sido descritas para uso em pecuária e em medicina humana. O sucesso na clonagem de ovinos, bovinos, suínos e caprinos confirma a utilidade da TN para o propósito de expansão clonal de animais de valor zootécnico. Diversos trabalhos mostram que há uma perda de embriões e neonatos de animais clonados, sendo que má formações de órgãos e alterações de tamanho e peso destes animais são freqüentemente descritas. Mediante o exposto este trabalho visa esclarecer do ponto de vista morfológico as principais alterações apresentadas por animais que vieram a óbito, usando como método de estudo a biometria de órgãos e a avaliação dos que apresentam algum tipo de alteração. Este estudo foi conduzido na fazenda Tambaú, no período compreendido entre 2004 e 2008, foram necropsiados 13 animais clonados pela TN, pertencentes à espécie bovina, das raças Nelore e Simental, com idade variando de 1 a 19 dias, de ambos os sexos. Foram registrados o peso do animal, dos órgãos, bem como avaliação morfológica, histológica e imunoistoquímica destes. As alterações do tamanho e da morfologia de órgãos são os problemas mais freqüentemente encontrados, se alocando dentro da síndrome do bezerro anormal onde estão envolvidos alterações morfológicas, como o gigantismo, presente em 92,3 % dos animais necropsiados neste estudo. Houve uma importância muito grande em descrever estas anormalidades, através de estudos morfológicos e imunoistoquímicos, para uma melhor caracterização e entendimento dos problemas envolvendo a clonagem animal e também contribuir no desenvolvimento da neonatologia bovina. / Cloning or Nuclear Transfer (NT) allows generation of identical organisms. Innumerous applications of NT in veterinary and human medicine have been described. The success of cloning bovine, ovine, caprine and swine confirms the utility of NT in clonal expansion of valuable animals with high zootechnical performance. Many articles show that there is an important embryonal and neonatal loss of cloned animals, in which malformations of organs and alteration of size and weight are the most frequent problems described. This work aims to clarify, through morphological evaluation, the main alterations found in neonatally dead cloned bovines, using biometric rates of organs and evaluation of those that present any alteration. This work was conducted at the Tambaú Farm, São Paulo State, Brazil, from 2004 to 2008, and 13 bovine cloned by NT, male and female, belonging to Nelore and Simental breeds, aging from 01 to 19 days of life. The weight of animals and organs were registered and also morphological, histopathological and immunohistochemical analyses were performed during this work. The alterations of size and morphology of the animals and organs were the most frequent problems found in our study, referred to as abnormal offspring syndrome that describes morphological alterations such as gigantism, present in 92,3% of necropsied animals of this study. It is very important to identify and describe these abnormalities, by morphological, immunohistochemical approach aiming a better characterization of the problems related to cloning procedure, and also to contribute to the development of neonatal medicine bovines.

Clonagem ou técnica de transferência nuclear (TN) permite a geração de um organismo geneticamente idêntico a outro. Inúmeras aplicações da TN têm sido descritas para uso em pecuária e em medicina humana. O sucesso na clonagem de ovinos, bovinos, suínos e caprinos confirma a utilidade da TN para o propósito de expansão clonal de animais de valor zootécnico. Diversos trabalhos mostram que há uma perda de embriões e neonatos de animais clonados, sendo que má formações de órgãos e alterações de tamanho e peso destes animais são freqüentemente descritas. Mediante o exposto este trabalho visa esclarecer do ponto de vista morfológico as principais alterações apresentadas por animais que vieram a óbito, usando como método de estudo a biometria de órgãos e a avaliação dos que apresentam algum tipo de alteração. Este estudo foi conduzido na fazenda Tambaú, no período compreendido entre 2004 e 2008, foram necropsiados 13 animais clonados pela TN, pertencentes à espécie bovina, das raças Nelore e Simental, com idade variando de 1 a 19 dias, de ambos os sexos. Foram registrados o peso do animal, dos órgãos, bem como avaliação morfológica, histológica e imunoistoquímica destes. As alterações do tamanho e da morfologia de órgãos são os problemas mais freqüentemente encontrados, se alocando dentro da síndrome do bezerro anormal onde estão envolvidos alterações morfológicas, como o gigantismo, presente em 92,3 % dos animais necropsiados neste estudo. Houve uma importância muito grande em descrever estas anormalidades, através de estudos morfológicos e imunoistoquímicos, para uma melhor caracterização e entendimento dos problemas envolvendo a clonagem animal e também contribuir no desenvolvimento da neonatologia bovina. / Cloning or Nuclear Transfer (NT) allows generation of identical organisms. Innumerous applications of NT in veterinary and human medicine have been described. The success of cloning bovine, ovine, caprine and swine confirms the utility of NT in clonal expansion of valuable animals with high zootechnical performance. Many articles show that there is an important embryonal and neonatal loss of cloned animals, in which malformations of organs and alteration of size and weight are the most frequent problems described. This work aims to clarify, through morphological evaluation, the main alterations found in neonatally dead cloned bovines, using biometric rates of organs and evaluation of those that present any alteration. This work was conducted at the Tambaú Farm, São Paulo State, Brazil, from 2004 to 2008, and 13 bovine cloned by NT, male and female, belonging to Nelore and Simental breeds, aging from 01 to 19 days of life. The weight of animals and organs were registered and also morphological, histopathological and immunohistochemical analyses were performed during this work. The alterations of size and morphology of the animals and organs were the most frequent problems found in our study, referred to as abnormal offspring syndrome that describes morphological alterations such as gigantism, present in 92,3% of necropsied animals of this study. It is very important to identify and describe these abnormalities, by morphological, immunohistochemical approach aiming a better characterization of the problems related to cloning procedure, and also to contribute to the development of neonatal medicine bovines.

>Magister Scientiae - MSc / Insect-derived baculoviruses have been used extensively as a safe and versatile research model for transgenic protein expression. Preclinical studies have revealed the promising potential of Baculoviruses as a delivery vector for a variety of therapeutic applications, including vaccination, tissue engineering and cancer treatments. Coronaviruses are enveloped viruses containing linear, non-segmented ribonucleic acid. Human coronavirus NL63 was first discovered in the Netherlands in January 2004, where a 7-month-old girl presented with an acute respiratory tract infection that was later established to predominantly infect infants, the elderly and immunocompromised individuals. In addition to the known non-structural and structural proteins of coronaviruses, an accessory protein known as open reading frame 3 which is conserved in the Coronaviridae family has not been extensively researched. Open reading frame 3 encodes a putative membrane-bound protein. This study cloned the open reading frame 3 viral gene of 741 base pairs into the baculovirus expression construct via competent bacterial cell lines. Open reading frame 3-Baculovirus particles were generated in Spodoptera frugiperda insect cells. Recombinant cells containing the viral protein gene were used to infect healthy Spodoptera frugiperda 9 cells at varying ratios of multiplicity of infection over a fixed time-course. The open reading frame 3 viral protein was not detected by quantification methods at a molecular weight of 26 kilo Dalton, due to polyclonal antibody degradation.

Os fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função placentária. Os efeitos destes na expressão da enzima esteroidogênica aromatase P450 (P450arom) na placenta bovina em diferentes estágios gestacionais (90 a 270 dias) foram avaliados através de imunocitoquímica. Além disso, comparou-se a influência destes entre células placentárias de bovinos clonados e não clonados aos 270 dias. A aromatase P450 foi localizada exclusivamente no citoplasma das células trofoblásticas gigantes e sua expressão foi menor aos 150 dias de gestação, em relação às demais idades (p<0,05). O VEGF (50 ng/ml) influenciou significativamente a expressão da P450arom aos 150 e 270 dias, enquanto o bFGF (10 ng/ml) foi efetivo em estimular essa expressão particularmente no final da gestação (270 dias). Os dois fatores combinados (bFGF+VEGF) inibiram a expressão da P450arom no terço inicial (90 dias), mas, por outro lado, estimularam-na aos 150 e 270 dias (p<0,05). Nos clones, a expressão da P450arom, nos grupos controle e VEGF, foi semelhante a dos animais não clonados aos 270 dias de gestação, porém, o bFGF e os dois fatores combinados inibiram-na significativamente (p<0,05). Em todos os grupos analisados, a expressão da P450arom apresentou característica ascendente em função dos dias de cultivo, atingindo concentração máxima após 96 horas de incubação. Assim, o presente estudo demonstrou efeitos distintos e estágio-específicos dos fatores de crescimento bFGF e VEGF na secreção de estrógenos na placenta bovina via modulação da expressão da aromatase P450 in vitro. Conclui-se que estes fatores de crescimento agem como potentes moduladores de enzimas esteroidogênicas e que, sob as condições de cultivo estabelecidas, as células placentárias de bovinos clonados apresentam padrão de resposta distinto quando comparadas com células de bovinos não clonados de mesma idade gestacional. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of placental development and function. Their effects on the steroidogenic enzyme aromatase P450 (P450arom) expression from bovine placenta at different gestational stages (90 - 270 days) were evaluated by immunocytochemistry. Moreover, we compared the effects of these growth factors on P450arom expression between cloned and non cloned bovine placental cells. P450arom was localized exclusively in trophoblast giant cells cytoplasm, and its expression reached lowest levels at day 150 of gestation in comparison to the remaining evaluated gestational stages. VEGF (50 ng/mL) influenced significantly P450arom expression at days 150 and 270, whereas bFGF (10 ng/mL) was effective in stimulating P450arom expression particularly during late gestation (day 270). The two factors combined (bFGF+VEGF) inhibited P450arom expression during early gestation (day 90), but, in contrast, stimulated it at days 150 and 270 of pregnancy (P<0.05). In cloned bovine placental cells, P450arom expression was similar to non-cloned cells in the control and VEGF groups, however, bFGF and both factors together inhibited it significantly (P<0.05). In all groups analyzed, P450arom expression presented rising pattern over the duration of the culture, reaching maximal values at 96 hours of incubation. Thus, the present study demonstrated distinct and stage-specific effects of these growth factors on bovine placenta P450arom expression in vitro. We concluded that these growth factors act as potent steroidogenic enzymes regulators, and, under the established culture conditions, placental cells from cloned bovines presented distinct answer pattern compared to non cloned placental cells at the same gestational stage.

A clonagem de animais é uma técnica em desenvolvimento e ainda requer refinamento, uma vez que as perdas embrionárias são significativas. Mesmo com animais chegando à termo, algumas deficiências verificadas ao nascimento provocam a morte destes antes do primeiro mês de vida. As alterações placentárias durante a embriogênese estão relacionadas, à formação deficiente da placenta, principalmente nas regiões de troca materno-fetal. Considerando a necessidade de estudos mais detalhados sobre a morfologia da placenta e a ausência de estudos quantitativos das estruturas placentárias em grandes mamíferos, investigamos comparativamente os vilos coriônicos da placenta de bovinos não clonados e clonados usando delineamento estereológico. Foram utilizadas placentas de quatro fêmeas de bovinos clonados e quatro de não clonados. A amostragem foi realizada de modo uniforme, sistemático e aleatório, sendo obtidas estimativas de densidade de volume, volume referência, tamanho e comprimento e número de unidades volume star. Todos os parâmetros estereológicos apresentaram valores superiores (embora não significativos) para não clonados, com exceção do número de unidades volume star. No entanto, a placenta de não clonados foi mais eficiente (p= 0.014). Apesar de não significativos, os resultados sugerem a existência de diferenças biológicas, ou seja, a placenta de bovinos não clonados apresenta vilos maiores (porém em menor número), mas distribuídos em um número maior de placentomas. Já em animais clonados, estes vilos são menores, mais numerosos e distribuídos em um número menor de placentomas. / Animal cloning is still in development it requires further improvements since embryonic losses are remarkable animals die before the first month after birth. The placental changes during embryogenesis cause a deficiency in the placenta, mostly in the maternal-fetal exchange areas. Due to the need for more detailed studies on the placenta?s morphology, especially the quantitative analysis of the placenta structures in large animals, chorionic villi were comparatively investigated in both cloned and non-cloned bovines by means of stereology designed methods. Placentas from four cloned and four non-cloned bovines were used. Specimens were collected in a random uniformand systematic procedure, and stereological designed methods were pursued to estimate volume density of villi; the volume reference of placenta (Cavilieri Principle), surface density, surface area, star volume and number of star volume units. All parameters presented larger values for non-cloned, with exception of number of star volume units, thought these results were statistically non-significant larger in non-cloned animals (p= 0.014). In conclusion, it is possible to say that there are biological differences, in the placenta of non-cloned bovines which presents larger chorionic villi, small villi number, but distributed in a larger number of placentomas. In cloned bovines, however, villi are smaller, numerous more, and they are distributed in fewer number of placentomes.

As principais causas de morte perinatal em bezerros estão de alguma forma relacionadas a problemas cardiorrespiratórios. A maior parte de morte de bezerros ocorre justamente no período de até 48h após o nascimento, quando ainda estão sendo feitos os ajustes fisiológicos necessários à vida extrauterina. Com o aumento de animais advindos das técnicas de produção in vitro, também aumentaram os problemas de sobrevivência e sobrevida dos recém nascidos. Este estudo teve como objetivo geral padronizar valores de referência de hemogasometria e espirometria de bezerros a termo, nascidos por parto espontâneo, e prematuros, nascidos por cesariana, da raça Nelore concebidos por inseminação artificial (IA), assim como estabelecer protocolos de cuidados intensivos neonatais aos animais prematuros. Objetivamente, o estudo compreendeu: 1. A avaliação dos valores de pressão invasiva de átrio direito, ventrículo direito, artéria pulmonar e artéria pulmonar ocluída, hemogasometria, espirometria e capnografia de bezerros da raça Nelore, a termo, nascidos por parto espontâneo; 2. A avaliação e padronização da hemogasometria arterial de bezerros raça Nelore, a termo, nascidos de partos espontâneos; 3. A avaliação da pressão invasiva da artéria pulmonar e dos efeitos do sildenafil sobre os valores de pressão de artéria pulmonar em bezerros da raça Nelore, prematuros, nascidos por cesariana; 4. Diferenças hemodinâmicas (utilizando o cateter de Swan-Ganz), na função pulmonar e nas trocas gasosas entre bezerros a termo nascidos por parto espontâneo e prematuros nascidos por cesariana; 5. O estabelecimento de protocolos de cuidados neonatais para bezerros advindos de gestações complicadas com risco de morte neonatal prematura, onde foram realizadas 3 cesarianas em bezerros concebidos por IA e 16 concebidos por transferência nuclear por de células somática (clonagem), sendo estabelecidos protocolos de terapia neonatal com sildenafil, surfactante e oxigenoterapia. Bezerros da raça Nelore a termo nascidos por parto espontâneo estabilizam seus parâmetros de hemogasometria a valores de animais adultos em até 48 horas após o nascimento e têm valores de hemogasometria mais próximos dos valores normais para a espécie, enquanto os bezerros prematuros, nascidos por cesariana, têm valores mais deslocados em relação a normalidade. A padronização da hemogasometria de bezerros da raça Nelore nascidos por eutocia, pode fomentar as pesquisas com animais advindos de técnicas de PIV, assim como aumentar a sobrevida e sobrevivência além de diminuir a mortalidades desses animais. Já o sildenafil não apresenta efeitos adversos significativos quanto a oxigenação dos bezerros em que foi usado, mesmo quando houve alterações não desejadas da PAP. Dessa forma, quando não existe a possibilidade de se aferir a PAP e suspeita-se de hipertensão, o sildenafil é pode ser usado sem maiores consequências para a saúde do paciente. / The main causes of perinatal death in cattle are frequently related to cardiorespiratory distress. A great number of losses are placed during the first 48h after birth, when important physiological adjustments to the extra-uterine life are still in progress. Recent increase of offspring derived from assisted reproductive in vitro biotechnologies resulted in diminished survival rates of the newborn. The present study aimed to obtain standard values of hemodynamic evaluation, blood gas and spirometry of Nelore calves conceived by artificial insemination (AI) born at term, spontaneously, or from premature calves born by cesarean delivery, as well as to establish protocols of neonatal intensive care focusing on premature animals. Objectively, the study comprised: 1. The evaluation of invasive pressure values from right atrium, right ventricle, pulmonary artery and pulmonary wedge pressure, blood gas, spirometry and capnography of Nelore calves born spontaneously; 2. Evaluation and standardization of arterial blood gas of Nelore calves born at term spontaneously; 3. Evaluation of invasive pressure of pulmonary artery (PAP) and effects of sildenafil administration on its values from Nelore premature calves born by cesarean; 4. The comparison of hemodynamic, blood gas and spirometry of calves born at term spontaneously or premature calves born by cesarean delivery, during the first 30 days of life; 5. The establishment of neonatal care protocols focusing on complicated pregnancies at risk of premature neonatal death, when 3 cesarean sections of calves conceived by AI and 16 conceived by nuclear transfer of somatic cells (cloning) were monitored, and therefore protocols involving neonatal therapy with sildenafil, surfactant and oxygen therapy were established. Nelore calves born at term spontaneously have their blood gas stabilized in values similar to adult cattle until 48 hours after birth, and present a blood gas profile more similar to the expected for the species, whereas premature calves born from cesarean delivery present values different from normality. The standardization of blood gas of Nelore calves born at term from eutocic deliveries may promote better perinatal survival rates in offspring derived from in vitro production. The treatment with sildenafil does not present adverse effects related to the oxygen levels of calves even when adverse alterations were observed in PAP. Therefore, whenever hypertension is suspected and measurement of PAP is impaired, the sildenafil treatment may be used without major consequences to the patient health

As principais causas de morte perinatal em bezerros estão de alguma forma relacionadas a problemas cardiorrespiratórios. A maior parte de morte de bezerros ocorre justamente no período de até 48h após o nascimento, quando ainda estão sendo feitos os ajustes fisiológicos necessários à vida extrauterina. Com o aumento de animais advindos das técnicas de produção in vitro, também aumentaram os problemas de sobrevivência e sobrevida dos recém nascidos. Este estudo teve como objetivo geral padronizar valores de referência de hemogasometria e espirometria de bezerros a termo, nascidos por parto espontâneo, e prematuros, nascidos por cesariana, da raça Nelore concebidos por inseminação artificial (IA), assim como estabelecer protocolos de cuidados intensivos neonatais aos animais prematuros. Objetivamente, o estudo compreendeu: 1. A avaliação dos valores de pressão invasiva de átrio direito, ventrículo direito, artéria pulmonar e artéria pulmonar ocluída, hemogasometria, espirometria e capnografia de bezerros da raça Nelore, a termo, nascidos por parto espontâneo; 2. A avaliação e padronização da hemogasometria arterial de bezerros raça Nelore, a termo, nascidos de partos espontâneos; 3. A avaliação da pressão invasiva da artéria pulmonar e dos efeitos do sildenafil sobre os valores de pressão de artéria pulmonar em bezerros da raça Nelore, prematuros, nascidos por cesariana; 4. Diferenças hemodinâmicas (utilizando o cateter de Swan-Ganz), na função pulmonar e nas trocas gasosas entre bezerros a termo nascidos por parto espontâneo e prematuros nascidos por cesariana; 5. O estabelecimento de protocolos de cuidados neonatais para bezerros advindos de gestações complicadas com risco de morte neonatal prematura, onde foram realizadas 3 cesarianas em bezerros concebidos por IA e 16 concebidos por transferência nuclear por de células somática (clonagem), sendo estabelecidos protocolos de terapia neonatal com sildenafil, surfactante e oxigenoterapia. Bezerros da raça Nelore a termo nascidos por parto espontâneo estabilizam seus parâmetros de hemogasometria a valores de animais adultos em até 48 horas após o nascimento e têm valores de hemogasometria mais próximos dos valores normais para a espécie, enquanto os bezerros prematuros, nascidos por cesariana, têm valores mais deslocados em relação a normalidade. A padronização da hemogasometria de bezerros da raça Nelore nascidos por eutocia, pode fomentar as pesquisas com animais advindos de técnicas de PIV, assim como aumentar a sobrevida e sobrevivência além de diminuir a mortalidades desses animais. Já o sildenafil não apresenta efeitos adversos significativos quanto a oxigenação dos bezerros em que foi usado, mesmo quando houve alterações não desejadas da PAP. Dessa forma, quando não existe a possibilidade de se aferir a PAP e suspeita-se de hipertensão, o sildenafil é pode ser usado sem maiores consequências para a saúde do paciente. / The main causes of perinatal death in cattle are frequently related to cardiorespiratory distress. A great number of losses are placed during the first 48h after birth, when important physiological adjustments to the extra-uterine life are still in progress. Recent increase of offspring derived from assisted reproductive in vitro biotechnologies resulted in diminished survival rates of the newborn. The present study aimed to obtain standard values of hemodynamic evaluation, blood gas and spirometry of Nelore calves conceived by artificial insemination (AI) born at term, spontaneously, or from premature calves born by cesarean delivery, as well as to establish protocols of neonatal intensive care focusing on premature animals. Objectively, the study comprised: 1. The evaluation of invasive pressure values from right atrium, right ventricle, pulmonary artery and pulmonary wedge pressure, blood gas, spirometry and capnography of Nelore calves born spontaneously; 2. Evaluation and standardization of arterial blood gas of Nelore calves born at term spontaneously; 3. Evaluation of invasive pressure of pulmonary artery (PAP) and effects of sildenafil administration on its values from Nelore premature calves born by cesarean; 4. The comparison of hemodynamic, blood gas and spirometry of calves born at term spontaneously or premature calves born by cesarean delivery, during the first 30 days of life; 5. The establishment of neonatal care protocols focusing on complicated pregnancies at risk of premature neonatal death, when 3 cesarean sections of calves conceived by AI and 16 conceived by nuclear transfer of somatic cells (cloning) were monitored, and therefore protocols involving neonatal therapy with sildenafil, surfactant and oxygen therapy were established. Nelore calves born at term spontaneously have their blood gas stabilized in values similar to adult cattle until 48 hours after birth, and present a blood gas profile more similar to the expected for the species, whereas premature calves born from cesarean delivery present values different from normality. The standardization of blood gas of Nelore calves born at term from eutocic deliveries may promote better perinatal survival rates in offspring derived from in vitro production. The treatment with sildenafil does not present adverse effects related to the oxygen levels of calves even when adverse alterations were observed in PAP. Therefore, whenever hypertension is suspected and measurement of PAP is impaired, the sildenafil treatment may be used without major consequences to the patient health