Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos / Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

Dysregulated wound healing is commonly associated with excessive fibrosis. Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) is characteristically overexpressed in fibrotic diseases and stimulated by transforming growth factor-β (TGF-β) in dermal fibroblasts. Reepithelialisation and epidermal wound coverage counteract excessive scar formation. We have previously shown that interleukin-1α (IL-1α) derived from keratinocytes conteracts TGF-β-stimulated CTGF-expression. The aim of this thesis was to further explore the effects of keratinocytes and IL-1α on gene and protein expression, as well as pathways, in TGF-β stimulated fibroblasts. Fibroblasts were studied in vitro by conventional two dimensional cell culture models and in a three dimensional keratinocyte-fibroblast organotypic skin culture model. The results showed that IL-1 suppresses basal and TGF-β-induced CTGF mRNA and protein, involving a possible TAK1 mechanism. Keratinocytes regulate the expression of fibroblast genes important for the turnover of the extracellular matrix. Most of the genes analysed (11/13) were regulated by TGF-β and counter regulated by keratinocytes. The overall results support a view that keratinocytes regulate fibroblasts to act catabolically (anti-fibrotic) on the extracellular matrix. Transcriptional microarray and gene set enrichment analysis showed that antagonizing effects of IL-1α on TGF-β were much more prominent than the synergistic effects. The most confident of these pathways was the interferon signaling, which were inhibited by TGF-β and activated by IL-1α. A proteomics study confirmed that IL-1α preferentially conteracts TGF-β effects. Six new fibroblast proteins involved in synthesis/ regulation were identified, being regulated by TGF-β and antagonized by IL-1α. Pathway analysis confirmed counter-regulation of interferon signaling by the two cytokines. These findings have implications for understanding the role of fibroblasts for inflammatory responses and development of fibrosis in the skin.

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Introduction : La fécondation in vitro est de mieux en mieux connue et en amélioration constante, cependant les taux d’implantation et de grossesse sont encore bas (environ 35% par fécondation in vitro). Un des enjeux de l’amélioration de la fécondation in vitro est le développement embryonnaire et l’implantation. Pour cela, la co-culture des embryons sur un tapis de cellules endométriales maternelles autologues peut être utilisée pour améliorer le développement embryonnaire (taux d’embryon se développant jusqu’à J5 : blastocyste) et l’implantation. L’objectif de l’étude est d’étudier le lien entre la qualité du tapis cellulaire et le développement embryonnaire. Matériel et méthodes : Cette étude est une sous analyse de l’essai clinique randomisé en double aveugle OvoGen, comparant le taux de blastulation et de grossesse dans deux groupes randomisés : le groupe étude, dans lequel les embryons se développent sur un tapis cellulaire endométrial maternel et le groupe contrôle, dans lequel les embryons sont cultivés dans du milieu conventionnel. Nous avons analysé la qualité des tapis cellulaire du groupe étude (confluence des cellules, taux de cellules épithéliales et vitalité des cellules stromales) par rapport au développement embryonnaire et au taux de grossesse. Résultats : 50 tapis de cellules endométriales maternelles et 291 embryons sur les puits ont été analysés de 2012 à 2015 à la clinique ovo (Montréal, Québec). La qualité des embryons n’était pas changée par la qualité des tapis (p=0,65 pour la confluence, p=0,25 pour le taux de glande et p=0,92 pour la viabilité des cellules). En revanche, le taux de grossesse augmentait quand la confluence diminuait (p=0,022) et lorsque la viabilité des cellules stromales augmentait (p=0,001). De plus, la qualité des tapis était dépendante de la date de la biopsie : la biopsie faite à J7 après l’ovulation permettait une meilleure qualité de puits (confluence augmentée, p=0,045, taux de glande augmenté p=0,004 et viabilité stromales augmentée p=0,001) que la biopsie faite à J5 post ovulation. Discussion : Aucune des nombreuses études sur la co-culture ne porte sur la qualité des tapis cellulaire. Il est intéressant de noter que le taux de grossesse augmente avec la diminution de la confluence et l’augmentation de la viabilité des cellules stromales dans les puits contenant les embryons transférés. Comme il a déjà été démontré, (1)le jour de la biopsie endométriale influe sur la qualité du tapis cellulaire en coculture et pour que celui-ci soit de bonne qualité, il faut que l’endomètre soit réceptif (après J19 du cycle). Conclusion : Nous avons montré que la qualité des tapis cellulaires dépendait du jour de la biopsie d’endomètre et que cette qualité pouvait influencer le bénéfice de la co-culture. Il serait intéressant d’étudier la réceptivité de l’endomètre au moment de la biopsie avant utilisation des cellules en co-culture pour optimiser la qualité du tapis cellulaire. / Introduction: Lot's of progress has been made in the process of in vitro fertilization (IVF) in the last years. However, the pregnancy rate is still low. There are two important issues in IVF: embryo development and implantation. One answer may be the endometrial autologue co-culture which could improve the embryo development and the implantation rate in many ways. The aim of this study is to assess the effect of co-culture quality on human embryo development and implantation rate. Materials and methods: The ovogen study was a randomized, double blind trial analysis. OvoGen compared the blastulation and the pregnancy rate in two randomized groups: the study group, with autologous endometrial co-culture and the control group, with conventional media. The outcome of our study was to assess the correlation between the quality of autologous endometrial co-culture (cells confluence, rate of epithelials cells and stromals cells viability) and the embryo development. Results: FIfty patients in the co-culture group were analyzed between 2012 to 2015 at the ovo clinic (Montreal, Quebec). 291 embryos were analyzed, each cocultured on a monolayer endometrial cells. The embryo quality was not significantly linked with the co-culture quality (p=0,65 for the cells confluence, 0,25 for the epithelial cells rate and 0,92 for the stromal cells viability). On the other hand, the 11 pregnancy rate increased in correlation with the decreasing of the confluence (p=0,022) and the increase of stromal cells (p=0,001). Moreover, the moment of the biopsy had an effect on the co-culture: when the biopsy was performed seven days after the ovulation, the quality of the co-culture was better (confluence increased p=0,045, epithelials cells increased p= 0,004 and stromal cells viability increased p=0,001) than when the biopsy was done five days after the ovulation. Discussion: There were no previous study on the quality of the co-culture and its effect on the embryo development. The fact that the pregnancy rate increased with the decrease of the confluence in the co-culture is interesting. Indeed, we could easily explain why a huge confluence could be prejudicial for the dialog between embryo and endometrium. Moreover, in accordance with previous experience, the day of the biopsy in the cycle is important for the quality of the endometrium. This is why the day of the biopsy may have an effect on the co-culture quality. Conclusion: Our results show that the moment of the biopsy has an effect on the quality of the co-culture and that the quality of the co-culture has an effect on the pregnancy rate. It could be interesting to study the endometrium receptivity on the biopsy before the co-culture to optimize the quality and the benefit of the co-culture.

Campylobacter jejuni is the leading bacterial cause of gastrointestinal diarrheal disease in humans worldwide. This zoonotic pathogen has a complex epidemiology due to its presence in many different host organisms. The overall aim of this thesis was to explore the role of amoebae of the genus Acanthamoeba as an intermediate host and vector for survival and dissemination of C. jejuni. Earlier studies have shown that C. jejuni can enter, survive and replicate within Acanthamoebae spp. In this thesis, I have shown that C. jejuni actively invades Acanthamoeba polyphaga. Once inside, C. jejuni could survive within the amoebae by avoiding localization to degradative lysosomes. We also found that A. polyphaga could protect C. jejuni in acid environments with pH levels far below the range in which the bacterium normally survives. Furthermore, low pH triggered C. jejuni motility and invasion of A. polyphaga. In an applied study I found that A. polyphaga also could increase the survival of C. jejuni in milk and juice both at room temperature and at +4ºC, but not during heating to recommended pasteurization temperatures. In the last study we found that forty environmental C. jejuni isolates with low bacterial concentrations could be successfully enriched using the Acanthamoeba-Campylobacter coculture (ACC) method. Molecular genetic analysis using multilocus sequence typing (MLST) and sequencing of the flaA gene, showed no genetic changes during coculture. The results of this thesis have increased our knowledge on the mechanisms behind C. jejuni invasion and intracellular survival in amoebae of the genus Acanthamoeba. By protecting C. jejuni from acid environments, Acanthamoebae could serve as important reservoirs for C. jejuni e.g. during acid sanitation of chicken stables and possibly as vectors during passage through the stomach of host animals. Furthermore, Acanthamoeba spp. could serve as a vehicle and reservoir introducing and protecting C. jejuni in beverages such as milk and juice. Validation of the ACC method suggests that it is robust and could be used even in outbreak investigations where genetic fingerprints are compared between isolates. In conclusion, Acanthamoeba spp. are good candidates for being natural hosts and vectors of C. jejuni.

Le développement de méthodes in vitro fiables et prédictives représente à l’heure actuelle un véritable défi. En effet, la demande en méthodes alternatives à l’expérimentation animale n’a cessé de croître ces dernières années du fait de la mise en place de législations limitant par considérations éthiques l’utilisation de ces modèles in vivo. De plus, ce besoin a été renforcé par le règlement européen REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) imposant aux industriels de valider l’innocuité de nombreuses substances déjà commercialisées. Toutefois, les modèles in vitro classiques consistant en la culture simple de cellules en monocouche dans des boîtes de Petri ne permettent pas de conserver les propriétés initiales de ces cellules et de retranscrire les conditions et l’environnement cellulaire des organes in vivo. Le développement de méthodes alternatives in vitro prédictives s’avèrent donc crucial en particulier pour mimer le fonctionnement de deux organes : l’intestin et le foie. En effet, ces deux organes sont largement impliqués dans les processus d’Absorption, Distribution, Métabolisme et Excrétion (ADME) de la plupart des xénobiotiques ingérés. C’est pour ces raisons que nous avons testé la faisabilité de l’une de ces méthodes in vitro alternative permettant d’associer une barrière intestinale à la culture dynamique de cellules hépatiques au sein de microsystèmes dans le cadre de ce doctorat. Cette coculture est effectuée au sein du dispositif appelé IIDMP (Integrated Insert in a Dynamic Microfluidic Platform). Nous avons décidé de tester d’une part l’influence de la culture dynamique et d’autre part d’éventuelles interactions entre les cellules intestinales et hépatiques sur la fonctionnalité et l’activité métabolique de ces deux types cellulaires. Les résultats obtenus durant ce doctorat ont permis d’atteindre 4 objectifs :- Développer un dispositif fiable en termes de fonctionnalité (fluidique, robustesse…).- Mettre en évidence l’innocuité du dispositif lorsque des cellules de lignée et primaires y étaient cultivées.- Démontrer les avantages de l’utilisation de ce dispositif comparativement à l’utilisation de modèles classiques in vitro, en particulier avec des cellules de lignée.- Démontrer que l’utilisation de ce dispositif permettait de mettre en évidence des phénomènes d’interactions entre cellules intestinales et hépatiques notamment sur l’activité du CYP1A2 des hépatocytes qu’ils soient issus d’une lignée ou de cultures primaires. / The development of reliable and predictive in vitro methods is a real challenge. Indeed, the demand for alternative methods to animal experimentation has been growing in recent years due to the introduction of legislation limiting the use of these models in vivo by ethical considerations. Moreover, this need was amplified by regulations such as the European REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) requiring the safety validation of many substances. However, the conventional in vitro model consisting in a simple cell culture monolayer in Petri dishes does not preserve the initial properties of these cells and does not mimic the conditions of the cellular environment and organs in vivo. The development of alternative in vitro predictive methods is crucial especially to mimic the working of two organs: the intestine and liver. Indeed, these two organs are involved in the process of Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion (ADME) of most xenobiotics ingested.We propose in this thesis to test the feasibility of one of these in vitro alternative methods allowing the association between an intestinal barrier and the dynamic culture of hepatic cells in microsystems in a device called IIDMP (Integrated Dynamic Insert in a Microfluidic Platform). We tested the influence of the flow of culture and possible interactions between intestinal and liver cells on the function and metabolic activity of these two cell types.Then, we demonstrated that : - This device is reliable in terms of global functionality (fluid, robustness ...).- This device did not injury the integrity of the cell line and primary cells.- The use of this device has many advantages when compared with the use of conventional in vitro models, especially with cells line.- The use of this device highlights phenomena of interaction between hepatic and intestinal cells as an increase of the CYP1A2 activity of HepG2 C3A and human primary hepatocytes.

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Frühgeburtlichkeit ist eine Pandemie. Im Jahr 2020 wurden schätzungsweise 13,4 Millionen Babys als Frühgeburten, d. h. vor der 37. Schwangerschaftswoche, geboren. Komplikationen bei Frühgeburten sind die häufigste Todesursache bei Kindern unter 5 Jahren (ca. 900 000 Todesfälle im Jahr 2019). Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine Form der chronischen Lungenerkrankung, von der Neugeborene betroffen sind, vor allem solche, die als Frühgeborene zur Welt kommen und eine Sauerstofftherapie benötigen. Bei der BPD werden die Lungen und die Alveolen geschädigt, was zu Gewebezerstörung (Dysplasie) und Narbenbildung führt. Leider konzentrieren sich die derzeitigen Behandlungen der BPD auf die Bewältigung der Krankheit, da es derzeit keine heilende Therapie gibt. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass mesenchymale Stamm-/Stromzellen (MSCs) in der regenerativen Medizin zur Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden können. MSCs sind multipotente Zellen, die sich in verschiedene Zelltypen differenzieren und immunmodulatorische, entzündungshemmende, antioxidative und regenerative Eigenschaften besitzen. Sowohl präklinische als auch klinische Studien mit MSCs bei BPD haben erste vielversprechende Ergebnisse gezeigt. Kürzlich zeigten Möbius et al. jedoch widersprüchliche Ergebnisse, indem sie feststellten, dass eine prophylaktische Verabreichung von aus der menschlichen Nabelschnur stammenden MSC (UC-MSCs) eine gestörte Lungenentwicklung bei extrem früh geborenen nicht-menschlichen Primaten (Papio spp.) nicht verhindern konnte, wie es von Studien an anderen Modellorganismen erwartet wurde. Deshalb habe ich mich auf die Suche nach möglichen Erklärungen für diese Beobachtungen gemacht und mich dabei auf die lungeneigenen MSCs (L-MSCs) der Paviane konzentriert. Das primäre Ziel meines Promotionsprojekts war es, eine erste Charakterisierung und einen Vergleich der residenten L-MSCs sowohl von Placebo- als auch von UC-MSC-behandelten Frühgeborenen vorzunehmen. Das zweite Ziel meines Projekts war es, ein robustes und reproduzierbares (direktes) Ko-Kultur-Modell von L-MSCs und HUVECs zu etablieren. Wir haben uns für HUVECs entschieden, da diese Zellen von Neugeborenen stammen und es sich gezeigt hat, dass eine starke und komplexe Interaktion zwischen MSCs und blutgefäßbildenden Endothelzellen vor und während der Bildung von Mikrogefäßen für eine ordnungsgemäße Blut- und Sauerstoffzirkulation in der sich entwickelnden Lunge (Alveolen) besteht. Meine ersten Ergebnisse zeigen, dass es sich bei beiden Gruppen um echte MSCs handelt, da alle sechs (drei aus jeder Gruppe) in der Lage waren, sich an Kunststoff-Zellkulturplatten anzuheften, eine dreistufige Differenzierung in die Adipozyten-, Osteozyten- und Chondrozytenlinien zeigten und die MSC-Markergene CD73 (5'-Nukleotidase), CD90 (Thy-1) und CD105 (Endoglin) exprimierten, die vom ISCT als Mindestkriterien für MSC empfohlen werden. Zusätzlich untersuchte ich ihre CFU-Fähigkeit sowie ihre Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO)-Expression nach IFN-ɣ-Induktion, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen festgestellt wurden. Es gab jedoch einen Trend bei ihrer CFU-Fähigkeit - L-MSCs aus den mit Placebo behandelten Tieren zeigten eine höhere CFU-Fähigkeit im Vergleich zu ihren Gegenstücken, die fast keine Kolonien bilden konnten. Im Gegensatz dazu wiesen die L-MSCs der UC-MSC-behandelten Tiere nach der IFN-ɣ-Induktion eine höhere Expression von IDO auf als die der Placebo-Tiere. Darüber hinaus wiesen beide Gruppen eine höhere IDO-Expression auf, die als Mindestkriterium für die klinische Anwendung von MSC gilt. Die RNA-Sequenzierung beider Gruppen zeigte unterschiedliche exprimierte Gensätze, z.B. solche, die am Glutathion-Stoffwechsel, an Ribosomen sowie an Glykolyse und Glukoneogenese beteiligt sind. Im zweiten und wichtigsten Teil meines Projekts begann ich mit der Untersuchung und dem Vergleich verschiedener Medien für HUVECs, die auch das Wachstum und die Vermehrung von L-MSCs für direkte Ko-Kultur-Experimente unterstützen würden. Sowohl HUVECs als auch L-MSCs wurden parallel aufgetaut und zunächst in ihrem eigenen bevorzugten Zellkulturmedium kultiviert. Danach wurden sie 72 Stunden lang ko-kultiviert. Nach diesen 3 Tagen wurden die HUVECs mit Hilfe von CD31+-Magnetbeads magnetisch getrennt. Zur Qualitätskontrolle wurde einmal eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um die korrekte Abtrennung der CD31+-Zellen zu bestätigen. Danach wurden mehrere Experimente mit HUVECs durchgeführt, die mit aus der Lunge stammenden MSCs von mit Placebo behandelten Tieren (HUVECs (P)), mit HUVECs, die mit aus der Lunge stammenden MSCs von UC-MSC-behandelten Tieren (HUVECs (T)) kokultiviert wurden, und mit HUVECs ohne Ko-Kultur (HUVECs (Ctr)). Es gab keine signifikanten Unterschiede in ihren Proliferationsraten, CFU-Fähigkeiten, bioenergetischen Profilen und Fähigkeiten zur Röhrenbildung. Es gab jedoch einige sichtbare Trends. So übertrafen die HUVECs (P) beide Gegenspieler leicht in ihren Proliferationsraten und CFU-Fähigkeiten. Darüber hinaus zeigten HUVECs (P) auch besser definierte Fähigkeiten zur Vasculogenese, wenn sie auf einer künstlichen Basalmembran ausgesät wurden, sowie eine höhere Anzahl von Verzweigungen, Maschen, Fläche der Maschen usw. im Vergleich zu beiden Gegenstücken. Es gab jedoch große Diskrepanzen zwischen den Gruppen, was die Individualität der einzelnen Pavianproben unterstreicht. Auch hier ergab die RNA-Sequenzierung statistisch unterschiedlich exprimierte Gene/Gensätze, darunter viele, die am Zellzyklus, der Angiogenese und der IFN-ɣ-Reaktion beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Ergebnisse die ersten Ergebnisse von M. Möbius und Kollegen widerspiegeln, die keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen bei einer Reihe von funktionellen und strukturellen Lungenparametern feststellen konnten. Unter Berücksichtigung der Einschränkungen meiner Studie, wie der geringen Anzahl von Pavianproben, der unkonventionellen Versuchsplanung aufgrund nicht vorhandener kommerzieller Antikörper, die spezifisch für Paviane sind, sowie der makrovaskulären Endothelzellen aus dem Gewebe von Neugeborenen anstelle von mikrovaskulären Zellen, wie sie in der sich entwickelnden menschlichen Lunge vorhanden sind, ebnen meine Ergebnisse den Weg für weitere Experimente unter Verwendung der nächsten Generation menschlicher kleiner Atemwegsepithelzellen (SAECs) und den Vergleich der Ergebnisse mit HUVECs. Darüber hinaus sind eingehendere (funktionelle) Analysen mit anderen Geweben von Pavianen gerechtfertigt. So haben wir zum Beispiel begonnen, auch mit aus Trachealaspirat (TA-MSCs) gewonnenen MSCs zu arbeiten, da TA-MSCs bei Kindern mit BPD nachweislich stark vertreten sind und als Marker für BPD dienen können. Mit unseren Studien an unserem einzigartigen Modellorganismus der extremen Frühgeburtlichkeit hoffen wir, die (molekularen) pathophysiologischen Mechanismen, die der Entwicklung der BPD zugrunde liegen, besser zu verstehen und den Weg für eine sichere, robuste und wirksame stammzellbasierte Therapie der BPD zu ebnen.

Natural Killer (NK) cellterapi är en lovande kandidat för cancerbehandling på grund av dess förmåga att känna igen och döda cancerceller. Adoptiv överföring av expanderade autologa eller allogena NK-celler har visat sig förbättra patientresultaten, särskilt i fall av akut myeloid leukemi (AML) efter stamcellstransplantation. En stor utmaning förknippad med NK-cellterapi är dock att få en tillräcklig mängd NK-celler för att uppnå meningsfulla terapeutiska resultat. Nuvarande metoder för att expandera NK-celler innebär ofta att T-celler avlägsnas från blodet, eftersom T-celler utgör över 50 % av blodets cellpopulation, medan NK-celler endast utgör cirka 10 %. Strategin för att ta bort T-celler involverar vanligtvis användningen av immunomagnetiska metoder, som kräver utbildad personal, är dyra och kräver god tillverkningssed (GMP) för att säkerställa metodens giltighet. Detta projekt syftade till att ta itu med denna fråga genom att etablera ett samodlingssystem mellan NK- och T-celler för att fungera som en modell för NK-expansion från patientens blod, vilket skulle kunna förbättra effektiviteten av cancerbehandling. Projektet syftade också till att undersöka det metaboliska beteendet (skillnader i näringsbehov och biprodukttolerans) mellan de två celltyperna. De två första experimenten med Jurkat gjordes med användning av en modifierad DMEM/RPMI och RPMI 1640-mediet under varierande glukos- och glutaminmålförhållanden. Resultatet från dessa två experiment visar att det modifierade DMEM/RPMI-mediet stödjer tillväxten av Jurkat-celler. Dessutom var produktionen av biprodukter inklusive laktat och ammoniak lägre i detta medium. Emellertid var glukos och glutamin avgörande för Jurkat-celltillväxt eftersom uppenbar konsumtion observerades under odlingsperioden. Det tredje experimentet syftade till att bedöma den negativa/reducerande effekten av glukos- och glutamintillstånd på Jurkat-celler. Resultaten från detta experiment applicerades sedan på NK-92-cellexpansion (fjärde experimentet). Det femte experimentet involverade samodling av båda celltyperna, med början med ett förhållande på 10% NK-celler till 90% Jurkat-celler, en ny celldiameterbaserad distributionsmetod användes för att förutsäga procentandelen NK-92-celler under samodlingen. Från dag 3 till dag 4 var det en ökning av andelen NK-celler, särskilt inom cellstorleksintervallet där de vanligtvis förekommer (17,4 µm). NK-cellerna utökades från 10 % på dag 0 till 52 % (i tillstånd med 2 mM glukos, 2 mM glutamin) på dag 3 och 45 % i tillstånd med 2 mM (glukos), 0,15 mM glutamin på dag 2. Sammantaget uppnådde denna studie framgångsrikt projektets mål att utveckla en samodlingsmodell genom att studera de enskilda cellinjernas metaboliska beteende. Ytterligare studier behövs för att undersöka effekterna av Interleukin 2 (IL-2) som produceras av Jurkat-celler på NK-celler. Dessutom skulle experiment med fler glukos- och glutaminmålkoncentrationer under längre odlingsperioder erbjuda en mer omfattande förståelse av samodlingssystemet, inklusive dess långsiktiga livskraft och celltillväxten av dessa cellinjer. / Natural Killer (NK) cell therapy is a promising candidate for cancer treatment due to its ability to recognize and kill cancer cells. The adoptive transfer of expanded autologous or allogenic NK cells has shown to improve patient outcomes, especially in cases of Acute Myeloid Leukemia (AML) following stem cell transplantation. However, a major challenge associated with NK cell therapy is obtaining a sufficient amount of NK cells to achieve meaningful therapeutic outcomes. Current methods for expanding NK cells often involve the removal of T cells from the blood, as T cells constitute over 50% of the blood's cell population, while NK cells make up only about 10%. The strategy to remove T cells typically involves the use of immunomagnetic beads, which require trained personnel, are expensive, and necessitate good manufacturing practices (GMP) to ensure the method's validity. This project aimed to address this issue by establishing a coculture system between NK and T cells to serve as a model for NK expansion from the patient blood which could improve the effectiveness of cancer treatment. The project also aimed at investigating the metabolic behavior (differences in nutrient demands and byproduct tolerance) between the two cell types. The first two experiment with Jurkat was done using a modified DMEM/RPMI and the RPMI 1640 media under varying glucose and glutamine target conditions. The result from these two experiments shows that the modified DMEM/RPMI media support the growth of Jurkat cells. In addition, the production of byproducts including lactate and ammonia were lower in this media. However, glucose and glutamine were crucial for Jurkat cells growth as evident consumption was observed during the culture period. The third experiment aimed to assess the negative/reducing impact of glucose and glutamine conditions on Jurkat cells. The findings from this experiment were then applied to NK-92 cells expansion (fourth experiment). The fifth experiment involved coculturing both cell types, starting with a ratio of 10% NK cells to 90% Jurkat cells, a new cell diameter based distribution method was used to predict the percentage of NK-92 cells during the coculture. From day 3 to day 4, there was an increase in the percentage of NK cells, particularly within the cell size range where they typically occur (17,4 µm). The NK cells were expanded from 10% on day 0 to 52% (in condition with 2mM glucose, 2mM glutamine) on day 3 and 45% in condition with 2mM(glucose), 0,15mM glutamine on day 2. Overall, this study successfully achieved the project's aim of developing a coculture model through studying the metabolic behavior of the individual cell lines. However, further studies are needed to investigate the effects of Interleukin 2 (IL-2) produced by Jurkat cells on NK cells. Moreover, conducting experiments with more glucose and glutamine targets concentrations over extended culture periods would offer a more comprehensive understanding of the coculture system, including its long-term viability and the cell growth of these cell lines.