La commutation de classe (CSR) est une étape clef de la réponse immunitaire. Ce phénomène va permettre de changer le type d’immunoglobuline (Ig) produite en réponse à un antigène donné. Ces Ig seront ensuite produites par les plasmocytes, qui constituent le stade ultime de la différenciation de la lignée cellulaire B. Lors de dérèglements de la prolifération de ces cellules, certaines Ig monoclonales anormales peuvent être produites et conduire à des situations pathologiques. La première partie de ce travail s’inscrit dans une logique de compréhension des éléments minima requis pour l’établissement de ce phénomène de CSR. Grace à un modèle animal d’insertion dirigée dans le locus kappa murin, naturellement ciblé par l’enzyme AID responsable de ce phénomène, nous avons mis en évidence que la présence de deux régions « switch » transcrites et fortement mutées par AID, n’était pas suffisante pour permettre ce phénomène. Un modèle murin reproduisant une maladie due à une Ig anormale a aussi été établi. Ce modèle de HCDD (Heavy Chain Deposition Disease) nous a permis de mettre en évidence la nécessité de la délétion du CH1 des chaînes lourdes d’Ig pour la génération des dépôts et nous a également permis de montrer que l’efficacité des thérapies à base d’inhibiteur de protéasome observée chez les patients atteint de HCDD, était en partie due à l’Ig pathogène elle-même, qui induit une élévation du stress du réticulum endoplasmique (UPR) au sein des plasmocytes producteurs de ces Ig. / Class Switch Recombination (CSR) is a key step during the immune response. CSR results in a switch to a more specific Ig isotype in response to a specific antigen. Plasma cells, the ultimate stage of B cell lineage differentiation, will synthesize this Ig. During plasma cell disorders, the production of an abnormal monoclonal Ig can lead to pathogenic situations. The aim of the first part of this study is to determine the minimal requirements for CSR induction with a mouse model in which we inserted a “switch cassette” composed of two transcribed S regions into a kappa locus which is naturally targeted by AID. However, despite efficient transcription and AID targeting of S regions, the “switch cassette” was not sufficient to induce effective CSR. We also developed a mouse model of HCDD (Heavy Chain Deposition Disease) which reproduced typical Randall-type renal lesions due to production of a pathogenic truncated heavy chain. This model demonstrated that the effective response to proteasome inhibitors observed in patients, is the consequence of the presence of a truncated HC that sensitizes plasma cells to this type of therapy through an elevated unfolded protein response (UPR).

Le processus de la commutation de classe ou commutation isotypique (CSR) des gènes d’immunoglobulines caractérise les cellules de la lignée B et implique principalement les régions switch précédant les gènes constants au sein du locus IgH. Des jonctions entre la région switch donneuse Sμ et celle acceptrice Sx sont crées pendant ce processus. Plusieurs études ont démontré que le destin des cellules de la lignée B était largement modulé en fonction de la classe de l’immunoglobuline qu’elles produisent et en particulier selon les signaux transmis par leur BCR (qui peuvent par exemple pour la classe IgE, comporter des signaux pro-apoptotiques). Nous avons utilisé plusieurs modèles visant à l’étude de la physiologie et de la mécanistique du switch vers différentes classes de BCR et d’immunoglobulines peu exprimées. Nous avons cherché à forcer l’expression de l’isotype IgA2 grâce à un modèle transgénique dédié, dans le but d’approfondir les spécificités du signal BCR transduit par cet isotype en comparaison avec le BCR IgA1. En outre, et d’une façon très intéressante, nous avons découvert l’existence (jusqu’ici ignorée et masquée par les 4 autres sous-classes plus abondantes) d’une cinquième sous-classe d’IgG humaine, l’IgG5 qui est codé par un gène jusqu’ici faussement classifié pseudo-gène. Ainsi nous avons étudié les modalités d’expression du gène correspondant après un switch non-canonique,le répertoire normal des IgG5, leur représentation parmi les IgG humaines monoclonales ainsi que leurs fonctions immunitaires grâce à un IgG5 fabriquée artificiellement portant une activité anti-CD20 humaine. Enfin, nous avons testé des produits pharmaceutiques (RHPS4 : stabilisant des structures G-quadruplex au niveau d’ADN et JQ1 : inhibiteur des facteurs de transcription à bromodomaines), montrant leur capacité à retarder ou inhiber la commutation de classe in vitro mais aussi in vivo dans des souris allergiques. / The process of class switch recombination (CSR) or isotypic switching of immunoglobulin genes characterizes the B cell lineage and primarily involves switch regions preceding the constant genes within the IgH locus. Junctions between donor switch region Sμ and acceptor Sx are generated during this process. Several studies have shown that the fate of B cells is largely modulated according to the class of immunoglobulin they produce and in particular the signals transmitted by their BCR « for example for IgE, BCRs can combine proapoptotic signals. We used several relevant mouse models to study the physiological aspect and the B cell compartment after switching to IgA2 (a dedicated transgenic model expressing IgA2) since IgA2 conveys a membrane signal different from tht of IgA1. In addition, we tested two pharmaceuticals drugs(RHPS4: stabilizer of G-quadruplex structures at the DNA level and JQ1: inhibitor of bromodomain proteins) showed their ability to delay or inhibit class switching towards IgE in vitro but also in vivo in allergic mice. Interestingly, we also demonstrated the existence (till now ignored and maybe masked by the other 4 more abundant IgG subclasses) of a fifth subclass of human IgG, IgG5 which is encoded by a gene classified as a pseudo-gene. We studied the expression modalities of the corresponding gene after a non-canonical switch, the normal IgG5 repertoire, their representation among the monoclonal human IgGs as well as their immune functions through an artificially synthesited IgG5 with human anti-CD20 activity.

Le streptocoque du groupe B (GBS) est un agent causant des septicémies et des méningites chez les nouveaux nés et chez les adultes. Une réaction sérologique dirigée contre la capsule polysaccharidique (CPS) permet de différencier les 10 sérotypes de GBS, dont le sérotype III qui est le plus fréquemment isolé en cas de méningite. Actuellement l’efficacité de l’unique traitement disponible, l’antibioprophylaxie intrapartum, est controversée. Dans l’optique d’élargir les options de prévention, cette étude vise à mieux comprendre les interactions entre GBS III et le développement de la réponse adaptative, sujet qui est peu documenté. Cette étude a évalué, par cytométrie en flux (FACS), les sous-populations des lymphocytes B (LB) spléniques impliquées suite à l’infection systémique de GBS III dans un modèle in vivo. De plus, la réponse humorale contre GBS III et contre la CPS III purifiée ainsi que la formation des centres germinatifs (GCs) spléniques dans un contexte de multiples infections par GBS ont été évalués. Les résultats suggèrent que la première infection stimule la production d’anticorps contre GBS III mais peu contre sa CPS. De plus, GBS III activerait la différenciation des LB et induirait la formation des GCs liée au déclenchement d’une réponse mémoire permettant un meilleur contrôle lors des infections subséquentes. Malgré sa faible immunogénicité, la CPS ne semblerait pas interférer avec le développement de l’immunité adaptative humorale contre la bactérie. La production d’anticorps contre GBS III qui implique la commutation de classe serait principalement produite contre des épitopes différents de ceux composant la CPS III. / Group B Streptococcus (GBS) is an agent of septicemia and meningitis in newborns but also in adults. A serological reaction directed against the polysaccharide capsule (CPS) allows to differentiate 10 GBS serotypes, including serotype III which is the most frequently isolated in cases of meningitis. Currently the effectiveness of the only available treatment, intrapartum antibiotic prophylaxis, is controversial. To improve prevention strategies, this study aims to better understand the interactions between GBS and the development of the adaptive response, a subject that is poorly documented. This study evaluated, by flow cytometry (FACS), the splenic subpopulations of B lymphocytes (LB) involved following systemic GBS infection in an in vivo model. This study also evaluated the serum anti-GBS antibody response and against its purified capsule as well as the formation of splenic germinal centers (GCs) in the context of multiple GBS infections. Results suggest that the first infection stimulates the production of antibodies against GBS III but little against its capsule. Furthermore, results suggest that GBS activates B cell differentiation by inducing the production of GCs, which are linked to triggering a memory response allowing better control in subsequent infections. Despite its low immunogenicity, the CPS does not appear to interfere with the development of adaptive humoral immunity against the bacteria. Therefore, the production of antibodies against GBS III, involving class switching, would recognize different epitopes from those found on its capsule.

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID. / Activation induced deaminase (AID) plays a central role in adaptive immunity. AID deaminates deoxycytidine to deoxyuridine in defined regions of the immunoglobulin (Ig) genes and initiates somatic hypermutation (SHM), gene conversion (iGC) and class switch recombination (CSR). While being essential for an effective immune response by underpinning antibody affinity maturation and isotype switching, the mutagenic activity of AID can also be oncogenic and causes genomic instability leading to the development of cancer, or exacerbate autoimmune diseases. Therefore, AID regulation, including the control of its protein level, is central to balancing effective immunity with cancer/autoimmunity. Notably, AID shuttles between the cytoplasm and the nucleus but is predominantly cytoplasmic at steady-state, with cytoplasmic AID being much more stable than nuclear AID. These regulatory steps contribute to limit the exposure of the genome to AID but their mechanisms are unknown. This thesis aimed at identifying AID partners and intrinsic determinants regulating its stability and modulating its biological functions. Firstly, we identified AID as a novel HSP90 client protein. We demonstrated that HSP90 interacts with AID in the cytoplasm and prevents its polyubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Consequently, HSP90 inhibition results in a significant reduction of endogenous AID levels and correlates with a proportional reduction in both AID-mediated antibody diversification and off-target mutations. Secondly, we showed that the first step in the HSP90 molecular chaperoning pathway and stabilization is the interaction of AID with the HSP40 and HSP70 system. In fact, a specific HSP40 protein, DnaJa1, is the limiting step in cytoplasmic AID stabilization. DnaJa1 farnesylation is required for DnaJa1-AID interaction and modulation of DnaJa1 levels or its farnesylation impacts endogenous AID levels and antibody diversification. In vivo, DnaJa1- deficient mice display compromized response to immunization, resulting from reduced AID protein levels and isotype switching. Thirdly, we found that AID is intrinsically less stable than its APOBEC paralogs. We identified the AID N-terminal aspartic acid residue at position two and an internal PEST-like motif as destabilizing modulators of AID protein turnover. Disruption of these motifs increases AID protein stability and antibody diversification.We conclude that AID’s intrinsic instability directly contributes to regulating antibody diversification. This intrinsic instability is at least partially compensated for in the cytoplasm by the protective action of the DnaJa1-HSP90 molecular chaperoning pathway. Pharmacologically targeting AID in an indirect way, by using HSP90 or farnesyltransferase inhibitors, could be relevant for treating some AID-associated lymphomas/leukemias and/or autoimmune diseases.

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