En introduisant fréquemment des mutations ponctuelles dans les régions variables des gènes d'immunoglobulines (Ig), le processus d'hypermutation somatique (SHM, initié par la déaminase AID) est essentiel pour augmenter l'affinité des anticorps. En marge de ses cibles physiologiques (les gênes d'Ig), AID peut induire des "dommages collatéraux" au niveau de cibles "illégitimes" qui sont appelées "off targets" (dont certains oncogènes, tel que Bcl6 fréquemment muté dans les lymphomes B). Le risque élevé de dommages collatéraux dans le génome des cellules B implique que les remaniements géniques soient précisément surveillés. Parmi les éléments cis-régulateurs impliqués dans cette surveillance, on compte l'activateur cEμ au locus des chaînes lourdes des Ig (IgH) et ses régions flanquantes d'attachement à la matrice nucléaire MARsEμ (étudiés en détails dans nos modèles de souris KO). Nous montrons que la délétion des régions MARsEμ diminue non seulement les mutations au locus des chaines lourdes des Ig (effet physiologique en cis) mais également au locus des chaines légères Ig situé sur un chromosome différent (effet de trans). A l'aide d'une outil bioinformatique (DeMinEr) que nous avons développé dans le but d'identifier des mutations rares, nous montrons également que les régions MARsEμ sont impliquées dans les dommages collatéraux infligés aux "off targets" des cellules B. Grâce à la technique de FISH 3D, nous proposons que les régions MARsEμ participent à la régulation de la SHM en influençant la position des cibles de AID dans le noyau des cellules B. Notre étude met en évidence un niveau de régulation spatiale du processus de SHM médié par les régions MARsEμ du locus IgH. / By introducing frequent point mutations into the variable regions of immunoglobulin (Ig) genes, somatic hypermutation (SHM, initiated by the AID deaminase) is a driving force for antibody affinity maturation. It is now admitted that AID-induces mutations in germinal centre B cells could affect in parallel to their Ig genes physiological targets, illegitimates targets (including oncogenes) so calles "off targets" (such as Bcl6 with frequent point mutation in B lymphomas). The high risk of "collateral damage" in the B cell genome implies that remodeling events are precisely surveyed. Among cisregulatory elements involved (transcriptional enhancers and chromatin isolators and anchors...), one best candidate is the intronic region including the cEμ enhancer and iths flanking MARsEμ regions that we have been studying extensively using mouse KO model. We recently showed that MARsEμ deletion decreases SHM not only at Ig Heavy chain locus IgH (physiological cis effect) but surprisingly also at the Ig Light chain Kappa locus Ig, located on a different chromosome (trans effect). To extend the study of this intriguing trans effect, we developed a bioinformatic tool called DeMinEr that unveiled that MARsEμ regions were also involved in AID-induced collateral damages to "off-targets". Using FISH 3D, we show that MARsEμ regions harboured the potential not only to locally recruit SHM but also to cause dynamic changes of nuclear structures. The surprising cis and trans effect of MARsEμ deletion, impacting simultaneously nuclear positioning and SHM, revealed an additional level of regulation for targeting mutations to Ig and "off-targets" genes.

Pour augmenter l'affinité des anticorps sécrétés en réponse à un antigène, les gènes d'immunoglobulines subissent l'hypermutation somatique, une mutagénèse adaptative initiée par l'action de l'activation-induced cytidine deaminase (AID). L'uracile provenant de la désamination des cytosines par cette enzyme est réparé de façon erronée par la suite : si il est pris en charge par l'uracile N-glycosylase (UNG), enzyme à l'origine d'une réparation poursuivie habituellement par des composantes de la voie du "base-excision repair", il reste à sa place un site abasique franchissable par les ADN polymérases translésionnelles avec un taux d'erreur très élevé. Si le mésappariement U:G est reconnu par la voie du " mismatch repair ", le brin d'ADN entourant le U est dégradé puis néo-synthétisé par une autre ADN polymérase translésionnelle particulièrement mutagène en face des bases T et A, la polymérase eta. Nous avons proposé que le choix entre ces deux voies de réparation mutagènes puisse être régulé en fonction du cycle cellulaire: les mutations des paires A:T seraient introduites dans les gènes d'immunoglobulines par la voie du mismatch repair en phase G1 alors que la voie erronée d'UN introduirait les autres mutations lors de la phase S. Nous sommes parvenus à restreindre l'activité de l'AID à deux parties distinctes du cycle, la phase G1 ou les phases S/G2/M, et nous avons établi le fonctionnement de ce système dans le modèle murin. De façon surprenante, nous avons détecté un taux de mutation proche du bruit de fond chez toutes les souris dont l'AID opérait uniquement dans les phases S/G2/M. Par contre, les souris dont l'AID a été restreinte en G1 présentaient un spectre de mutation diversifié sur les quatre bases et similaire au normal. A la lumière de ces résultats, nous proposons que les lésions introduites tout au long du cycle par l'AID soient diversifiées par les acteurs de l'hypermutation somatique pendant la phase G1, alors que les lésions seraient soit réparées de façon fidèle en dehors de cette phase-là, soit de faible impact. Afin d'expliquer le biais de brin dans l'hypermutation somatique observé pour les mutations sur les bases A :T, nous proposons pour l'ADN polymérase eta un rôle inhabituel de réparation du brin portant la " lésion ", et non de synthèse translésionnelle classique en face de cette lésion. Nous avons analysé le profil, le taux et la distribution des mutations introduites par Pol eta sur un oligonucléotide cible pour l'hypermutation, qui a été inséré au locus des immunoglobulines et utilisé pour l'établissement des souris knock-in avec un fond génétique déficient ou non en UNG. Nos résultats, selon lesquels Pol eta continue de cibler le brin codant indépendamment de la localisation des " points d'entrée " en forme d'uraciles, contredisent les rapports déjà publiés sur ce sujet. De façon inattendue, nos résultats mettent en évidence une coopération entre les voies UNG et et les activités endonucléasique du mismatch repair, fournissant la cassure simple brin qui va permettre d'initier la resynthèse à fort taux d'erreur à l'origine de la mutagénèse A/T. Ces résultats résolvent aussi le paradoxe de la non-participation apparente du complexe effecteur du mismatch repair (Mlh1/Pms2) dans le processus d'hypermutation, en proposant qu'il fonctionne en redondance avec UNG, dans une distribution des tâches qui dépend du contexte de la séquence ciblée et de la densité du processus de deamination.

Pour augmenter l'affinité des anticorps sécrétés en réponse à un antigène, les gènes d'immunoglobulines subissent l'hypermutation somatique, une mutagénèse adaptative initiée par l'action de l'activation-induced cytidine deaminase (AID). L'uracile provenant de la désamination des cytosines par cette enzyme est réparé de façon erronée par la suite : si il est pris en charge par l'uracile N-glycosylase (UNG), enzyme à l'origine d'une réparation poursuivie habituellement par des composantes de la voie du "base-excision repair", il reste à sa place un site abasique franchissable par les ADN polymérases translésionnelles avec un taux d'erreur très élevé. Si le mésappariement U:G est reconnu par la voie du " mismatch repair ", le brin d'ADN entourant le U est dégradé puis néo-synthétisé par une autre ADN polymérase translésionnelle particulièrement mutagène en face des bases T et A, la polymérase eta. Nous avons proposé que le choix entre ces deux voies de réparation mutagènes puisse être régulé en fonction du cycle cellulaire: les mutations des paires A:T seraient introduites dans les gènes d'immunoglobulines par la voie du mismatch repair en phase G1 alors que la voie erronée d'UN introduirait les autres mutations lors de la phase S. Nous sommes parvenus à restreindre l'activité de l'AID à deux parties distinctes du cycle, la phase G1 ou les phases S/G2/M, et nous avons établi le fonctionnement de ce système dans le modèle murin. De façon surprenante, nous avons détecté un taux de mutation proche du bruit de fond chez toutes les souris dont l'AID opérait uniquement dans les phases S/G2/M. Par contre, les souris dont l'AID a été restreinte en G1 présentaient un spectre de mutation diversifié sur les quatre bases et similaire au normal. A la lumière de ces résultats, nous proposons que les lésions introduites tout au long du cycle par l'AID soient diversifiées par les acteurs de l'hypermutation somatique pendant la phase G1, alors que les lésions seraient soit réparées de façon fidèle en dehors de cette phase-là, soit de faible impact. Afin d'expliquer le biais de brin dans l'hypermutation somatique observé pour les mutations sur les bases A :T, nous proposons pour l'ADN polymérase eta un rôle inhabituel de réparation du brin portant la " lésion ", et non de synthèse translésionnelle classique en face de cette lésion. Nous avons analysé le profil, le taux et la distribution des mutations introduites par Pol eta sur un oligonucléotide cible pour l'hypermutation, qui a été inséré au locus des immunoglobulines et utilisé pour l'établissement des souris knock-in avec un fond génétique déficient ou non en UNG. Nos résultats, selon lesquels Pol eta continue de cibler le brin codant indépendamment de la localisation des " points d'entrée " en forme d'uraciles, contredisent les rapports déjà publiés sur ce sujet. De façon inattendue, nos résultats mettent en évidence une coopération entre les voies UNG et et les activités endonucléasique du mismatch repair, fournissant la cassure simple brin qui va permettre d'initier la resynthèse à fort taux d'erreur à l'origine de la mutagénèse A/T. Ces résultats résolvent aussi le paradoxe de la non-participation apparente du complexe effecteur du mismatch repair (Mlh1/Pms2) dans le processus d'hypermutation, en proposant qu'il fonctionne en redondance avec UNG, dans une distribution des tâches qui dépend du contexte de la séquence ciblée et de la densité du processus de deamination.

Durant l’ontogénie B, le locus des chaines lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus de réarrangements géniques. Lors des phases précoces du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène, les réarrangements VDJ permettent l’obtention d’un répertoire d’Ig fonctionnelles. Lors des phases tardives, l’hypermutationsomatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig pour son antigène tandis que larecombinaison isotypique (CSR) modifie ses fonctions effectrices. Ces évènements impliquent l’induction de lésions de l’ADN potentiellement oncogéniques, ce qui impose unerégulation très stricte. Cette régulation est assurée par divers éléments cis-régulateurs répartis tout au long du locus IgH, dont la région régulatrice en 3’ (3’RR). La 3’RR s’étend sur 30 kb et contient quatre activateurs transcriptionnels, les trois premiers formant une structure palindromique. Lors de ma thèse, j’ai utilisé plusieurs modèles murins porteurs de délétions de tout ou partie de la 3’RR pour étudier son rôle, ainsi que celui des différents éléments qui la compose lors des diverses étapes de l’ontogénie B. Nous avons pu déterminer comment la 3’RR régule précisément la CSR en ciblant spécifiquement la région switch acceptrice et caractériser le phénomène encore peu connu de CSR vers IgD. D’autre part, nous avons démontré l’importance de la 3’RR lors de la SHM et dans le développement des différentes sous populations lymphocytaires B. Enfin, la comparaison des résultats obtenus lors de l’analyse des différents modèles nous a permis de déterminer que la structure palindromique de la 3’RR est importante pour une SHM efficace, mais relativement dispensable lors de la CSR. / During B-cell development, the heavy chains locus (IgH) undergoes three genic rearrangement events. During the early stages, before encountering the antigen, VDJ rearrangements allow the generation of a functional Ig repertoire. During the late stages, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its antigen, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. These events imply thegeneration of potentially oncogenic DNA lesions, and thus require a strict regulation. This regulation is assured by several cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends on more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. During my PhD, I investigated several mouse models carrying deletion of part or totality of the 3’RR to investigate its role during B cell development. We demonstrated how she precisely regulates CSR by specifically targeting the acceptor switch region, and described the poorly known mechanism of CSR toward IgD. Otherwise, we have demonstrated its importance during SHM and in the correct development of the different B cell subpopulations. Finally, by comparing the results obtained during the analysis of the various mouse models, we have demonstrated that the palindromic structure of the 3’RR is required for optimal SHM, but not for CSR.

Durant l’ontogénie B, le locus des chaînes lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus majeurs de réarrangements géniques. Lors de la phase précoce du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène (Ag), les recombinaisons VHDJH donnent le répertoire diversifié des Ig fonctionnelles. Durant la phase tardive, suite à une activation par l’Ag, l’hypermutation somatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig à son Ag et la recombinaison isotypique (CSR) va modifier ses fonctions effectrices. Tous ces processus sont strictement régulés par différents éléments cis-régulateurs repartis tout au long du locus IgH. La région régulatrice en 3’ (3’RR) en est un. Elle s’étend sur environ 30 Kb et est constituée de quatre activateurs transcriptionnels, dont les trois premiers forment une structure palindromique. La 3’RR contrôle, chez le lymphocyte B-2 (LB-2), la transcription du locus IgH, le devenir de la cellule B, la SHM et la CSR mais elle n’a aucun effet sur les recombinaisons VHDJH et la diversité du répertoire antigénique. Les LB-1 représentent un petit pourcentage des LB totaux. Ils diffèrent des LB-2 par leur origine, développement, fonctions, marqueurs de surface et distribution tissulaire. Les LB-1 maintiennent l'homéostasie dans l'organisme et sont la source principale des Ig naturelles (NIgM et NIgA) au cours des premières phases d'une réponse immunitaire. Lors de ma thèse, nous avons étudié le rôle de la 3’RR sur le développement des LB-1. D’une façon identique aux LB-2, la 3’RR contrôle la transcription du locus IgH, le devenir des cellules B et la SHM dans les LB-1. A l’inverse des LB-2, la 3’RR joue un rôle indirect sur la diversité du répertoire antigénique dans les LB-1 et n’a aucun effet sur la CSR vers IgA. Ces résultats mettent en évidence, pour la première fois, la contribution de la 3'RR dans le développement d’une population cellulaire B à l’interface entre l’immunité innée et acquise. Ils renforcent nos connaissances sur le rôle des éléments cis-régulateurs du locus IgH dans le développement de ces deux immunités. / During B-cell development, the immunoglobulin heavy chain locus (IgH) undergoes three major genic rearrangements. During the early stages, before encountering the antigen (Ag), VHDJH rearrangements allow the generation of the Ig repertoire. During the late stages, after encountering the Ag, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its Ag, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. All these genetic events are strictly regulated by cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends over more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. The 3'RR controls B2 B-cell IgH transcription, cell fate, SHM and CSR but not repertoire diversity. B1 B-cells represent a small percentage of total B-cells differing from B2 B-cells by several points such as precursors, development, functions, surface markers and tissue distribution. B1 B-cells act at the steady state to maintain homeostasis and during the earliest phases of an immune response by secreting natural Ig (NIgM and NIgA). During my PhD, we investigated the role of the 3'RR on B1 B-cells. Similarly to B2 B-cells, the 3'RR controls IgH transcription, cell fate and SHM in B1 B-cells. In contrast to B2 B-cells, 3'RR deletion indirectly affects B1 B-cell repertoire diversity and has no effect on their CSR towards IgA. These results highlight, for the first time, the contribution of the 3'RR in the development of a B-cell population at the interface between innate and acquired immunity. Moreover, these results strengthen our knowledge of the role of the cis-regulatory elements of the IgH locus in the development of these two immune responses.

L’enzyme Activation-induced cytidine deaminase (AID) initie la diversification des immunoglobulines (Ig) par l’induction de dommages à l’ADN. Alors que les lésions induites aux gènes des Ig sont cruciales pour l’établissement de réponses immunes hautement spécifiques et adaptées, ce même type de lésions provoquées ailleurs dans le génome contribue à la transformation cellulaire et à l’apparition de cancer. Les mécanismes impliqués dans la protection de l’intégrité génomique des cellules B restent à définir. D’une part, nous avons développé une approche de protéomique locus-unique en couplant une technique d’identification de protéine par biotinylation de proximité avec l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9. Cette technique innovante, dont nous avons fait la preuve de principe pour des loci abondants, pourra être utilisée pour identifier le protéome des différentes cibles génomiques d’AID. D’autre part, nous avons caractérisé le rôle de Parp3, Parp9 et Med1, identifiées comme partenaires d’AID, éclairant ainsi les mécanismes qui contrôlent l’activité d’AID et la réparation des lésions induites par AID lors de la diversification des Ig. / Activation-induced cytidine deaminase (AID) initiates immunoglobulin (Ig) diversification by inducing DNA damage. While on-target lesions are crucial for mounting highly specific and adaptive immune responses, off-target lesions contribute to malignant cell transformation. Despite its implications, the events following AID recruitment that enforce genome integrity in B cells remain poorly defined. It is not understood why multiple non-Ig loci bound by AID are not mutated or why AID-induced DNA lesions may lead to mutations or DNA breaks. To address this question, we developed a single-locus proteomic approach coupling proximity-dependent protein identification and genome editing (CRISPR/Cas9) to identify and compare the proteins recruited at individual genomic loci bound by AID. We performed the proof of principle of this innovative tool by identifying the proteome of abundant genomic loci. On the other hand, we functionally characterized Parp3, Parp9 and Med1, identified as AID partners, revealing novel mechanisms that tightly control AID activity and DNA repair during Ig diversification.

Pour augmenter l’affinité des anticorps sécrétés en réponse à un antigène, les gènes d’immunoglobulines subissent l’hypermutation somatique, une mutagénèse adaptative initiée par l’action de l’activation-induced cytidine deaminase (AID). L’uracile provenant de la désamination des cytosines par cette enzyme est réparé de façon erronée par la suite : si il est pris en charge par l’uracile N-glycosylase (UNG), enzyme à l’origine d’une réparation poursuivie habituellement par des composantes de la voie du "base-excision repair", il reste à sa place un site abasique franchissable par les ADN polymérases translésionnelles avec un taux d’erreur très élevé. Si le mésappariement U:G est reconnu par la voie du « mismatch repair », le brin d’ADN entourant le U est dégradé puis néo-synthétisé par une autre ADN polymérase translésionnelle particulièrement mutagène en face des bases T et A, la polymérase eta. Nous avons proposé que le choix entre ces deux voies de réparation mutagènes puisse être régulé en fonction du cycle cellulaire: les mutations des paires A:T seraient introduites dans les gènes d’immunoglobulines par la voie du mismatch repair en phase G1 alors que la voie erronée d’UN introduirait les autres mutations lors de la phase S. Nous sommes parvenus à restreindre l’activité de l’AID à deux parties distinctes du cycle, la phase G1 ou les phases S/G2/M, et nous avons établi le fonctionnement de ce système dans le modèle murin. De façon surprenante, nous avons détecté un taux de mutation proche du bruit de fond chez toutes les souris dont l’AID opérait uniquement dans les phases S/G2/M. Par contre, les souris dont l’AID a été restreinte en G1 présentaient un spectre de mutation diversifié sur les quatre bases et similaire au normal. A la lumière de ces résultats, nous proposons que les lésions introduites tout au long du cycle par l’AID soient diversifiées par les acteurs de l’hypermutation somatique pendant la phase G1, alors que les lésions seraient soit réparées de façon fidèle en dehors de cette phase-là, soit de faible impact. Afin d’expliquer le biais de brin dans l’hypermutation somatique observé pour les mutations sur les bases A :T, nous proposons pour l’ADN polymérase eta un rôle inhabituel de réparation du brin portant la « lésion », et non de synthèse translésionnelle classique en face de cette lésion. Nous avons analysé le profil, le taux et la distribution des mutations introduites par Pol eta sur un oligonucléotide cible pour l’hypermutation, qui a été inséré au locus des immunoglobulines et utilisé pour l’établissement des souris knock-in avec un fond génétique déficient ou non en UNG. Nos résultats, selon lesquels Pol eta continue de cibler le brin codant indépendamment de la localisation des « points d’entrée » en forme d’uraciles, contredisent les rapports déjà publiés sur ce sujet. De façon inattendue, nos résultats mettent en évidence une coopération entre les voies UNG et et les activités endonucléasique du mismatch repair, fournissant la cassure simple brin qui va permettre d'initier la resynthèse à fort taux d'erreur à l'origine de la mutagénèse A/T. Ces résultats résolvent aussi le paradoxe de la non-participation apparente du complexe effecteur du mismatch repair (Mlh1/Pms2) dans le processus d'hypermutation, en proposant qu'il fonctionne en redondance avec UNG, dans une distribution des tâches qui dépend du contexte de la séquence ciblée et de la densité du processus de deamination. / Somatic hypermutation is a localized mutagenesis, essentially targeted to the immunoglobulin V region, and occurring during the immune response. This process is triggered by AID (activation-induced cytidine deaminase) that deaminates cytosines into uracils at the Ig locus. This lesion is further processed by Ung or the Msh2-Msh6 complex, with an abnormal outcome for both pathways that results in an increased mutation load. The Msh2-Msh6 complex recruits Pol eta to generate a short patch DNA synthesis with mostly mutations at A and T bases. To get further insight into this error-prone repair process, we have generated hypermutation substrates consisting in an A/T oligonucleotide of 100 bases with or without 3 cytidines in its core region, inserted by knock-in at the heavy chain Ig locus. Our aim was to compare the mutation frequency, distribution and mutation profile of substrates with C on either the coding or the non-coding strand on WT or Ung-deficient background, taking into account that Pol eta is a preferred A to G mutator. Our results suggest that Pol eta resynthesis may proceed on the coding strand, whatever the strand localization of the uracil, thus contradicting previous reports. Unexpectedly, our results revealed a cooperation between the Ung pathway and the endonuclease activity of the mismatch repair, with both of them providing the single-strand nick that allows initiation of the error-prone process that generates mutations at A and T bases. These results resolve the apparent paradox of the non-involvement of the mismatch repair effector complex (Mlh1-Pms2) in hypermutation, by proposing that it works redundantly with UNG, in a distribution of tasks that will depend upon the sequence context and the intensity of deamination activity. We have also constructed cell cycle restricted mutants of AID, to study in which phase of the cell cycle this atypical, mismatch repair driven, error-prone synthesis is taking place. Using the Fucci restriction system (degrons based on Cdt1 or Geminin peptides), we have generated AID constructs with proper restriction in either G1 or S/G2/M phases. These retroviral constructs have been used to transduce mouse hematopoietic stem cells from either AID -deficient mice and to restore immunodeficient animals, in order to analyze their immune response. We report that restriction of AID expression in S/G2/M part of the cycle yielded only background mutation frequency, while AID operating in the G1 phase is able to generate an equal proportion of A/T and G/C mutations at the Ig loci, thus demonstrating that uracils generated in G1 are substrates for both Ung- and mismatch repair pathways.

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID. / Activation induced deaminase (AID) plays a central role in adaptive immunity. AID deaminates deoxycytidine to deoxyuridine in defined regions of the immunoglobulin (Ig) genes and initiates somatic hypermutation (SHM), gene conversion (iGC) and class switch recombination (CSR). While being essential for an effective immune response by underpinning antibody affinity maturation and isotype switching, the mutagenic activity of AID can also be oncogenic and causes genomic instability leading to the development of cancer, or exacerbate autoimmune diseases. Therefore, AID regulation, including the control of its protein level, is central to balancing effective immunity with cancer/autoimmunity. Notably, AID shuttles between the cytoplasm and the nucleus but is predominantly cytoplasmic at steady-state, with cytoplasmic AID being much more stable than nuclear AID. These regulatory steps contribute to limit the exposure of the genome to AID but their mechanisms are unknown. This thesis aimed at identifying AID partners and intrinsic determinants regulating its stability and modulating its biological functions. Firstly, we identified AID as a novel HSP90 client protein. We demonstrated that HSP90 interacts with AID in the cytoplasm and prevents its polyubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Consequently, HSP90 inhibition results in a significant reduction of endogenous AID levels and correlates with a proportional reduction in both AID-mediated antibody diversification and off-target mutations. Secondly, we showed that the first step in the HSP90 molecular chaperoning pathway and stabilization is the interaction of AID with the HSP40 and HSP70 system. In fact, a specific HSP40 protein, DnaJa1, is the limiting step in cytoplasmic AID stabilization. DnaJa1 farnesylation is required for DnaJa1-AID interaction and modulation of DnaJa1 levels or its farnesylation impacts endogenous AID levels and antibody diversification. In vivo, DnaJa1- deficient mice display compromized response to immunization, resulting from reduced AID protein levels and isotype switching. Thirdly, we found that AID is intrinsically less stable than its APOBEC paralogs. We identified the AID N-terminal aspartic acid residue at position two and an internal PEST-like motif as destabilizing modulators of AID protein turnover. Disruption of these motifs increases AID protein stability and antibody diversification.We conclude that AID’s intrinsic instability directly contributes to regulating antibody diversification. This intrinsic instability is at least partially compensated for in the cytoplasm by the protective action of the DnaJa1-HSP90 molecular chaperoning pathway. Pharmacologically targeting AID in an indirect way, by using HSP90 or farnesyltransferase inhibitors, could be relevant for treating some AID-associated lymphomas/leukemias and/or autoimmune diseases.

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