Les hormones thyroïdiennes (T[indice inférieur 3], T[indice inférieur 4]) sont cruciales pour le développement, la croissance et plusieurs fonctions homéostatiques. Leurs actions s'exercent via leurs récepteurs (TRs), facteurs de transcription membres de la famille des récepteurs nucléaires. La régulation de la transcription par les TRs est complexe et dynamique et demande l'intervention d'une multitude de co-régulateurs. Récemment, nous avons identifié un nouveau co-activateur des TRs, RanBPM, dont le mécanisme d'action est inconnu. Plusieurs évidences suggèrent que RanBPM pourrait être relié à la voie de l'ubiquitine et du protéasome (Ub-Pr): RanBPM modifie l'ubiquitination et la stabilité de p73 et RanBPM interagit avec USP11, une ubiquitine protéase. Par ailleurs, bien qu'il ait été démontré que la T[indice inférieur 3] induit une diminution rapide des TRs par la voie Ub-Pr, les mécanismes précis impliqués dans leur dégradation sont inconnus, même s'ils font sans doute partie du processus normal de régulation de la transcription. Notre hypothèse stipule que RanBPM pourrait moduler l'activité transcriptionnelle des TRs en influençant leur stabilité. Nos objectifs étaient de caractériser la dégradation de TR[bêta]1, puis d'étudier l'effet de RanBPM sur ce processus. Nos analyses pulse chase confirment que TR[bêta]1 est dégradé par la voie Ub-Pr et mettent en évidence une dégradation atypique de TR[bêta]1. En effet, en absence de T[indice inférieur 3], la dégradation de TR[bêta]1 débute plus de 30 minutes après le début de la période de chase, 44% des récepteurs restent non dégradés après 180 minutes de chase et la demi-vie estimée est de 134 min, alors qu'en présence de T[indice inférieur 3], la dégradation débute immédiatement, 28% des récepteurs restent non dégradés après 180 minutes de chase et la demi-vie estimée est de 104 min. Nos analyses de fractionnement cellulaire, en trois fractions (cytoplasmique, nucléaire soluble et nucléaire insoluble), démontrent la présence prédominante de TR[bêta]1 dans la fraction nucléaire insoluble correspondant aux protéines associées à la chromatine et/ou la matrice nucléaire. De plus, nos expériences d'immunobuvardages de type Western en présence de cycloheximide révèlent des différences dans la cinétique de disparition de TR[bêta]1 selon la fraction dans laquelle il a été isolé: (i) dans le cytoplasme, TR[bêta]1 est relativement stable en absence d'HTs et diminue rapidement en présence d'HTs, (ii) dans la fraction soluble du noyau TR[bêta]1 disparaît plus rapidement en présence qu'en absence d'HTs et (iii) dans la partie insoluble du noyau TR[bêta]1 apparaît stable en présence et en absence d'HTs et un traitement de 20 minutes avec la T[indice inférieur 3] augmente transitoirement la quantité de TR[bêta]1 dans cette fraction suggérant un déplacement des populations cytoplasmique et nucléaire soluble vers la population associée à la chromatine et/ou à la matrice nucléaire. Ces résultats témoignent donc de la co-existence dans la cellule de formes stables et instables de TR[bêta]1 qui pourraient avoir des fonctions distinctes. Par ailleurs, nos résultats d'immunobuvardages de type Western indiquent que RanBPM pourrait a priori avoir un effet protecteur sur la dégradation de TR[bêta]1 puisque sa sur-expression augmente la quantité de TR[bêta]1, alors que la diminution de son expression, par l'utilisation de shRNAs spécifiques, réduit la quantité de TR[bêta]1 détectés dans les extraits cellulaires. Toutefois, nos analyses pulse chase révèlent que RanBPM n'influence pas la cinétique de dégradation de TR[bêta]1, suggérant que l'effet de RanBPM sur la quantité de TR[bêta]1 ne résulte pas d'un effet sur la stabilité protéique. En conclusion, nos résultats mettent en évidence une dégradation atypique de TR[bêta]1 due à la co-existence de différentes populations de TR[bêta]1 possédant des cinétiques de dégradation différentes. De plus, notre étude révèle que RanBPM augmente la quantité protéique de TR[bêta]1, mais n'influence pas la stabilité de TR[bêta]1.

Les protéines existent sous différents états fonctionnels régulés de façon précise par leur environnement afin de maintenir l‘homéostasie de la cellule et de l‘organisme vivant. La prévalence de ces états protéiques est dictée par leur énergie libre de Gibbs alors que la vitesse de transition entre ces états biologiquement pertinents est déterminée par le paysage d‘énergie libre. Ces paramètres sont particulièrement intéressants dans un contexte thérapeutique et biotechnologique, où leur perturbation par la modulation de la séquence protéique par des mutations affecte leur fonction. Bien que des nouvelles approches expérimentales permettent d‘étudier l‘effet de mutations en haut débit pour une protéine, ces méthodes sont laborieuses et ne couvrent qu‘une fraction de l‘ensemble des structures primaires d‘intérêt. L‘utilisation de modèles bio-informatiques permet de tester et générer in silico différentes hypothèses afin d‘orienter les approches expérimentales. Cependant, ces méthodes basées sur la structure se concentrent principalement sur la prédiction de l‘enthalpie d‘un état, alors que plusieurs évidences expérimentales ont démontré l‘importance de la contribution de l‘entropie. De plus, ces approches ignorent l‘importance de l‘espace conformationnel protéique dicté par le paysage énergétique cruciale à son fonctionnement. Une analyse des modes normaux peut être effectuée afin d‘explorer cet espace par l‘approximation que la protéine est dans une conformation d‘équilibre où chaque acide aminé est représenté par une masse régie par un potentiel harmonique. Les approches actuelles ignorent l‘identité des résidus et ne peuvent prédire l‘effet de mutations sur les propriétés dynamiques. Nous avons développé un nouveau modèle appelé ENCoM qui pallie à cette lacune en intégrant de l‘information physique et spécifique sur les contacts entre les atomes des chaînes latérales. Cet ajout permet une meilleure description de changements conformationnels d‘enzymes, la prédiction de l‘effet d‘une mutation allostérique dans la protéine DHFR et également la prédiction de l‘effet de mutations sur la stabilité protéique par une valeur entropique. Comparativement à des approches spécifiquement développées pour cette application, ENCoM est plus constant et prédit mieux l‘effet de mutations stabilisantes. Notre approche a également été en mesure de capturer la pression évolutive qui confère aux protéines d‘organismes thermophiles une thermorésistance accrue.

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription qui exercent leur fonction via le contrôle de la transcription de leurs gènes cibles, une régulation qui est dépendante de cofacteurs associés. Les complexes transcriptionnels ainsi formés dialogueront avec l’environnement chromatinien (méthylation de l’ADN, remodelage des nucléosomes, modifications post-traductionnelles des histones) afin de promouvoir la répression ou l’activation transcriptionnelle des cibles géniques de ces récepteurs. Ce projet a identifié une interaction entre la lysine déméthylase LSD1 et le récepteur nucléaire orphelin ERRα dans des cellules humaines de cancers du sein. LSD1 protège ERRα d’une dégradation protéasomale de manière indépendante de son activité catalytique. Par ailleurs, LSD1 déméthyle H3K9 et H3K4 in vivo, mais est incapable in vitro de déméthyler H3K9. La présence de ERRα révèle cette activité de LSD1 sur H3K9, suggérant que le complexe ERRα -LSD1 agit comme un régulateur positif de la transcription. En ce sens, ERRα et LSD1 régulent un nombre important de gènes communs identifiés par RNAseq. Ainsi, 10 gènes activés ont été sélectionnés et le recrutement de ERRα et LSD1 a été examiné sur ces cibles géniques. En association avec les résultats obtenus in vitro, nous avons observé in vivo qu’en absence de ERRα ou LSD1, les gènes activés par ces deux partenaires présentent une augmentation de la marque répressive H3K9me2 sans affecter H3K4me2 au niveau du site d’initiation de la transcription. En conclusion, LSD1 interagit avec ERRα et inhibe sa dégradation, conduisant à une coopération transcriptionnelle de ces protéines. Pour la première fois, un rôle direct de ERRα sur l’environnement chromatinien a été identifié via l’activité de LSD1 sur des marques répressives d’histones. / Nuclear receptors are transcription factors that cooperate with chromatin associated factors to promote their activities. These transcriptional complexes are able to modulate the chromatin landscape to repress or promote transcription. Interestingly, there is an intricate cross-talk between these complexes and the chromatin environment that can influence each other to coordinate gene expression led by nuclear receptors. Post-translational modifications of histones regulate in part, DNA accessibility and the activities of nuclear receptors. One of these histone modifiers is LSD1, which is known to demethylate lysines 4 (H3K4) and 9 (H3K9) on histone 3. This manuscript focuses on the discovered LSD1-ERRα complex in human cancer cell lines. LSD1 interacts with ERRα, hence, modulates ERRα protein stability via a demethylation independent manner. Moreover, LSD1 is able to demethylate H3K4me2 in vitro but not H3K9me2. Interestingly, we observed that ERRα is able to switch LSD1 activity toward H3K9me2 to promote gene transcription without any additional cofactor in vitro. To confirm this effect in vivo, a transcriptomic analysis on mammary cancer cells was performed and highlights common target genes between ERRα and LSD1. We selected 10 genes activated by both and verified ERRα and LSD1 recruitment on these targets. Moreover, upon knock-down of ERRα or LSD1, the transcriptional start sites of activated genes -bound and regulated by both proteins- are enriched in the repressive mark H3K9me2. Altogether, these results describe a positive regulation of ERRα by LSD1 which in turn, drives the demethylase activity on H3K9me2 to promote transcription. Finally, these data highlight a direct function of ERRα on chromatin landscape.

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MIIs, [MIM 266600]) sont caractérisées par une inflammation chronique au niveau du tube gastro-intestinal. Les deux principales formes sont la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU). Les MIIs résulteraient d’un défaut du système immunitaire et de l’épithélium intestinal. Ce dernier forme une barrière physique et biochimique qui sépare notre système immunitaire des microorganismes commensaux et pathogènes de la microflore intestinale. Un défaut dans la barrière épithéliale intestinale pourrait donc mener à une réponse immunitaire soutenue contre notre microflore intestinale. Les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’identifier 201 régions de susceptibilité aux MIIs. Parmi celles-ci, la région 1q32 associée à la MC (p<2x10-11) et à la CU (p<6x10-7) contient 4 gènes, dont C1orf106, un gène codant pour une protéine de fonction inconnue. Le re-séquençage de la région 1q32 a permis d’identifier une variante génétique rare de C1orf106 (MAF˂1%) associée aux MIIs (p=0,009), Y333F. Nous avons démontré que la substitution de la tyr333 par une phénylalanine semble avoir un effet sur la stabilité protéique de C1orf106 tel que démontré lors de l’inhibition de la synthèse protéique induite par le cycloheximide. Nous avons déterminé que C1orf106 est exprimé dans le côlon et l’intestin grêle. De plus, son expression est augmentée lors de la différenciation des cellules épithéliales Caco-2 en épithélium intestinal polarisé. Son profil d’expression correspond aux types cellulaires et tissulaires affectés dans les MIIs. De plus, C1orf106 est partiellement co-localisée avec le marqueur des jonctions serrées, ZO-1. Toutefois, son marquage reproduit parfaitement celui du marqueur des jonctions adhérentes, E-cadhérine. Les jonctions serrées et adhérentes sont localisées du côté apical de la jonction intercellulaire et sont toutes deux impliquées dans l’établissement de la barrière épithéliale. Nous avons donc testé l’impact de C1orf106 sur la perméabilité de l’épithélium intestinal. Nous avons observé une augmentation de la perméabilité épithéliale chez un épithélium intestinal formé par des cellules Caco-2 sous-exprimant C1orf106. Nos résultats suggèrent que C1orf106 pourrait être le gène causal de la région 1q32. / The Inflammatory bowel diseases (IBD, [MIM 266600]) involve chronic inflammation of the digestive tract and include ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD). IBD may result from defects in the homeostasis of immune system and intestinal epithelium. The latter forms a physical and biochemical barrier to commensal and pathogenic microorganisms. A dysfunction in the epithelial barrier may lead to a sustained immune response against the gut flora. Genome wide association studies (GWAS) have identified 200 susceptibility regions in IBD. Among these, the 1q32 region associated with risk of both CD (p<2x10-11) and UC (p<6x10-7), contains the gene C1orf106. Our targeted re-sequencing study has identified a low-frequency variant, Y333F (p=0.009) in C1orf106, a protein of unknown function and in which tyrosine333 is predicted to be phosphorylated. We demonstrated that its substitution by a phenylalanine may have an effect on C1orf106 protein stability as shown by cycloheximide treatment experiments. Our RNA expression analyses of human tissues and cell lines demonstrated that C1orf106 is mostly expressed in the small intestine and colon. It is also detectable in monocytic cell lines but more highly expressed in colonic epithelial cell lines. Furthermore, its expression is increased by 40% during differentiation of colonic epithelial Caco-2 cells into polarized epithelium. To provide further biological context, we generated colorectal LS174T cells that stably overexpress the Y333F alleles and demonstrated that it is partially localized with ZO-1, used as a tight junction (TJ) marker. We did observe tighter colocalization with E-cadherin, a canonical marker for adherens junctions (AJ), typically located below the TJ complex. AJ and TJ play an essential role in the establishment of epithelial barrier. The localization of C1orf106 at these regions suggests its possible implication in epithelial barrier homeostasis. Using trans-epithelial measurement of ions movement across epithelium, we demonstrated an increased in permeability of an epithelium formed by C1orf106 knock-down Caco-2 cells. Our results suggest that C1orf106 could be the causal gene of the 1q32 susceptibility region.

L'administration de protéines de façon locale et prolongée à partir de microsphères biodégradables de PLGA présente un réel intérêt thérapeutique (diminution du nombre d'injections, potentialisation de l'activité, diminution des effets secondaires), plus particulièrement, dans le domaine de l'ingénierie tissulaire pour l'apport de facteurs de croissance. Cependant, la faible stabilité des protéines dans ces systèmes limite leur développement. Dans ce travail, des stratégies ont été mises en place pour préserver l'intégrité de protéines à la fois lors des étapes d'encapsulation et de libération. Dans une étude préliminaire, des protéines modèles et thérapeutiques ont été précipitées afin d'éviter leur dénaturation pendant leur future encapsulation. Des particules submicroniques ont ainsi été formées par ajout d'un non solvant et d'un sel à une solution aqueuse de protéine. Après optimisation des rendements de précipitation, ces particules de protéines ont été microencapsulées par un procédé de simple émulsion (s/o/w). Aucune perte d'activité n'a été observée et ce, sans stabilisant. Ensuite, pour pallier au ralentissement de la libération après le premier jour d'incubation des microsphères, l'interaction protéine-polymère a été modélisée et des composés capables de limiter l'adsorption du lysozyme sur le PLGA ont été sélectionnés, notamment le poloxamer 188. La précipitation du lysozyme avec du poloxamer 188 avant encapsulation a ainsi conduit à une libération continue de protéine active pendant trois semaines sans effet burst à partir de microsphères de PLGA et pendant plus de six semaines avec un copolymère tribloc de PLGA-PEG-PLGA.

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID. / Activation induced deaminase (AID) plays a central role in adaptive immunity. AID deaminates deoxycytidine to deoxyuridine in defined regions of the immunoglobulin (Ig) genes and initiates somatic hypermutation (SHM), gene conversion (iGC) and class switch recombination (CSR). While being essential for an effective immune response by underpinning antibody affinity maturation and isotype switching, the mutagenic activity of AID can also be oncogenic and causes genomic instability leading to the development of cancer, or exacerbate autoimmune diseases. Therefore, AID regulation, including the control of its protein level, is central to balancing effective immunity with cancer/autoimmunity. Notably, AID shuttles between the cytoplasm and the nucleus but is predominantly cytoplasmic at steady-state, with cytoplasmic AID being much more stable than nuclear AID. These regulatory steps contribute to limit the exposure of the genome to AID but their mechanisms are unknown. This thesis aimed at identifying AID partners and intrinsic determinants regulating its stability and modulating its biological functions. Firstly, we identified AID as a novel HSP90 client protein. We demonstrated that HSP90 interacts with AID in the cytoplasm and prevents its polyubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Consequently, HSP90 inhibition results in a significant reduction of endogenous AID levels and correlates with a proportional reduction in both AID-mediated antibody diversification and off-target mutations. Secondly, we showed that the first step in the HSP90 molecular chaperoning pathway and stabilization is the interaction of AID with the HSP40 and HSP70 system. In fact, a specific HSP40 protein, DnaJa1, is the limiting step in cytoplasmic AID stabilization. DnaJa1 farnesylation is required for DnaJa1-AID interaction and modulation of DnaJa1 levels or its farnesylation impacts endogenous AID levels and antibody diversification. In vivo, DnaJa1- deficient mice display compromized response to immunization, resulting from reduced AID protein levels and isotype switching. Thirdly, we found that AID is intrinsically less stable than its APOBEC paralogs. We identified the AID N-terminal aspartic acid residue at position two and an internal PEST-like motif as destabilizing modulators of AID protein turnover. Disruption of these motifs increases AID protein stability and antibody diversification.We conclude that AID’s intrinsic instability directly contributes to regulating antibody diversification. This intrinsic instability is at least partially compensated for in the cytoplasm by the protective action of the DnaJa1-HSP90 molecular chaperoning pathway. Pharmacologically targeting AID in an indirect way, by using HSP90 or farnesyltransferase inhibitors, could be relevant for treating some AID-associated lymphomas/leukemias and/or autoimmune diseases.

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