Les télomères garantissent la stabilité des extrémités chromosomiques. Une défaillance de protection entraine l’apparition de chromosomes dicentriques (c-à-d. possédant deux centromères) instables en mitose. La présence de chromosomes dicentriques est donc une source de mutagénèse et une menace pour la viabilité des cellules. Chez Saccharomyces cerevisiae, les dicentriques issus d’une fusion de télomères cassent préférentiellement à la fusion. Ce processus inexpliqué permet la régénération d’un caryotype normal et protège les chromosomes des conséquences néfastes d’une fusion accidentelle de leurs extrémités. Ce manuscrit explore les mécanismes moléculaires de cette voie de secours. La haute affinité de Rap1, pour ses sites consensus en tandem ou pour des séquences télomériques est suffisantes pour former un point chaud de cassure des chromosomes dicentriques. Une protéine hétérologue ayant aussi une haute affinité fixation pour sa séquence mime la présence de fusions de télomères, montrant que la forte affinité d’une protéine pour ses sites en tandem suffit à créer un point chaud. En l’absence de séquence télomérique interne, les chromosomes dicentriques cassent plutôt aux régions péricentromériques. Ces positions de cassure dépendent d’une force générée par les Condensines capable de relocaliser rapidement les centromères des chromosomes dicentriques au site de cytodiérèse avant leur cassure. De plus, le repliement des chromosomes dicentriques dépendant des Condensines est également nécessaire à une cassure préférentielle aux séquences fixant Rap1. En anaphase, ces séquences forment aussi un isolateur capable de séparer deux domaines chromosomiques. Ainsi, les télomères fusionnés sont secourus par un mécanisme qui favorise une capture des fusions et des régions péricentromériques par le septum dépendant de la conformation des chromosomes dirigées par les Condensines et par Rap1, Ces résultats suggèrent que les séquences télomériques fixant Rap1 bloquent l’extrusion de boucles par Condensine. De plus ce travail propose un nouvel outil pour l’étude de la condensation in vivo. Il montre également que la cassure des chromosomes dicentriques survient pendant la septation et que cytodiérèse n’est pas ralentie par la présence d’un pont de chromatine. / Telomeres ensure chromosome end stability. Failure to do so would lead to chromosome end fusions and the formation dicentric chromosomes (i.e. chromosomes with two centromeres) that are unstable in mitosis. Dicentrics are a threat to cell viability and a source of extensive mutagenesis. In Saccharomyces cerevisiae, dicentrics formed by telomere fusion preferentially break at the fusion. This unexplained process allows the recovery of a normal karyotype and protects the genome from the detrimental consequences of accidental telomere fusions. Here, I address the molecular basis of this rescue pathway. Simple tandem arrays tightly bound by the telomere factor Rap1 or a heterologous high-affinity DNA binding factor are sufficient to establish breakage hotspots, mimicking telomere fusions within dicentrics. I also adress the mechanism allowing breakage at pericentromeric regions when dicentric do not bear telomeric sequences. During anaphase, Condensins generate forces sufficient to rapidly relocalize the centromeres to the bud neck and refold dicentrics prior their breakage by cytokinesis. This relocalisation is essential for breakage at pericentromeres. Moreover Condensin-dependent refolding is essential to the preferential breakage at telomere fusions, more generally at Rap1-bound arrays and which delimit insulated chromosomal domains. Thus, the rescue of fused telomeres results from a Condensin- and Rap1-driven chromosome conformation that favours fusion entrapment where the septum closes. These results suggest that Rap1-bound telomere sequences stall loop-extrusion by Condensins. In addition, this work provides a new and direct way to monitor Condensin activity on chromatin in live cells. It also shows that dicentric chromosomes are broken during septation and that cytokinesis is not delayed by chromatin bridges.

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Condensine est un complexe protéique organisateur du génome qui conduit l’assemblage des chromosomes et promeut leur transmission fidèle en anaphase. De nombreuses études ont rapporté des changements dans les niveaux des ARNs cellulaires quand Condensine est défaillante, suggérant un rôle pour Condensine dans la régulation de l’expression génique. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont demeurés énigmatiques, et l’on ignore dans quelle mesure le rôle joué par Condensine dans l’expression génique est lié ou non à sa fonction dans l’organisation des chromosomes. Lors de ma thèse, j’ai étudié l’activité de Condensine dans la régulation de l’expression génique en utilisant la levure S. pombe comme organisme modèle. Contrairement à l’idée communément admise, mes résultats montrent que Condensine ne joue aucun rôle direct dans le maintien du transcriptome, ni en interphase, ni en mitose chez cette levure. En accord avec les études précédentes, j’observe des changements de niveau et de qualité des ARNs dans les cellules mutantes pour Condensine au sortir de la mitose ; des ARNs non codants et des ARNs aberrants, étendus en 3’, s’accumulent. En revanche, je démontre que ces changements sont la conséquence de défauts de transmission des chromosomes en anaphase. L’inactivation de Condensine cause la non-disjonction de l’ADN ribosomique et du nucléole, entrainant une déplétion de l’ARN-exosome des cellules filles, lesquelles accumulent alors des ARNs normalement dégradés par l’ARN-exosome. De façon cruciale, je montre qu’empêcher les anomalies de migration des chromosomes restaure une expression normale des gènes malgré l’inactivation de Condensine, démontrant que c’est l’instabilité chromosomique qui est source des changements d’expression génique observés quand Condensine est défaillante, et non le complexe Condensine en tant que tel. Ce travail remet en question le concept de régulation de l’expression génique par les complexes Condensine et appelle à la prudence lorsque l’on cherche à étudier les fonctions de ces complexes en dehors de la condensation de la chromatine en mitose. / Condensin is a genome organiser that shape chromosomes and promote their accurate transmission in anaphase. Several studies have related changes in RNA level when Condensin is defective, suggesting that the complex has also a role in gene expression. However, the mechanisms have remained enigmatic and we still don’t know to what extent it is related to its role in chromosome organization. During my thesis, I studied the role played by Condensin in the regulation of gene expression using S. pombe as a model system. In contrast to previous studies, my results provide compelling evidence that Condensin plays no direct role in the maintenance of the transcriptome, neither during interphase nor during mitosis in this yeast. Accordingly to previous studies, I observed changes in RNA level in cells mutated for Condensin; non coding and 3’ extended RNA accumulate. However, I showed that the changes in gene expression in post-mitotic fission yeast cells that result from Condensin inactivation are largely a consequence of chromosome missegregation during anaphase, which notably depletes the RNA-exosome from daughter cells. Crucially, preventing karyotype abnormalities in daughter cells restores a normal transcriptome despite Condensin inactivation. Thus, chromosome instability, rather than a direct role of Condensin in the transcription process, changes gene expression. This work challenges the concept of gene regulation by canonical Condensin complexes and ask for caution when studying Condensin role outside chromosome condensation in mitosis.

La condensation mitotique des chromosomes est l'un des mécanismes assurant la transmission fidèle de l'information génétique. Les complexes condensines et leur association à la chromatine sont nécessaires à cette condensation. Cependant, les mécanismes par lesquels ces complexes s'associent aux chromosomes et contribuent à leur condensation sont mal compris. L'objectif de ma thèse était d'identifier et de caractériser des facteurs de condensation encore inconnus collaborant avec le complexe condensine présent chez S. pombe. Par un crible génétique, nous avons recherché des mutants viables lorsque le complexe condensine est complètement fonctionnel mais morts lorsque ce complexe est partiellement défectif. Nous avons ainsi identifié 7 protéines jusqu'alors jamais impliquées dans la condensation mitotique. Parmi ces dernières, nous avons identifié des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et des facteurs de transcription comme Gcn5, une HAT très conservée, connue pour son rôle de coactivateur de la transcription ; suggérant un lien entre la condensation et la machinerie transcriptionnelle. Gcn5 s'associe à la chromatine au niveau des promoteurs des gènes où elle acétyle principalement H3K9, H3K14 et H3K18. Sa présence au niveau des promoteurs est directement corrélée avec le niveau de transcription des gènes correspondants. Bien que la majorité de la chromatine soit dé-acétylée et que la présence de Gcn5 soit réduite au niveau des chromosomes en mitose, des traces de H3K9 acétylée persistent au niveau de certains promoteurs. Nos résultats suggèrent que cette acétylation persistante pourrait être liée au recrutement du complexe condensine à la chromatine / From yeasts to human, Condensin is essential for mitotic chromosome condensation. However, how Condensin binds to chromatin and, in this context, shapes mitotic chromosome remain poorly understood. Mappings performed from yeasts to mouse have revealed that condensin is enriched near highly expressed genes along chromosome arms, suggesting that as yet identified features associated with transcription take part in condensin binding to chromatin. To identify factors that collaborate with Condensin we performed a synthetically lethal genetic screen in fission yeast. We searched for mutants that are alive when Condensin is fully functional but dead when Condensin is partly defective. We identified 7 proteins never known for their roles in the mitotic condensation, such as some chromatin remodelling and some transcription factors. All these results were consistent with a link between condensation and transcription. Among theses 7 proteins, we found Gcn5, which encodes a conserved HAT, well known for the role it plays as a transcriptional co-activator. Gcn5 binds to gene promoters where it acetylates mainly H3K9, K14 and K18, and its occupancy correlates with transcription rates. Remarkably, although the bulk of chromatin is de-acetylated and Gcn5 reduced from chromatin upon mitosis entry, traces of Gcn5 dependant H3K9 acetylated persist at condensin binding sites. Here, we provide evidence that Gcn5-mediated histone H3 K9 acetylation could assist the binding of Condensin to chromatin

Les modifications post-traductionelles des histones contribuent à l’expression génique et à la stabilité du génome. La méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), une marque associée aux promoteurs de gènes transcrits, est déposé par les methyltransferases hautement conservées de la famille SET1, dans le contexte du complexe COMPASS. SET-2, l’homologue de SET1 chez Caenorhabditis elegans, est responsable de la déposition de H3K4me dans la lignée germinale, et son inactivation provoque une perte progressive de la fertilité. Le but de mon travail de thèse a été d’étudier comment SET-2 et la méthylation de H3K4 contribuent au maintien de la lignée germinale. J’ai montré que l’absence de SET-2 provoque une sensibilité accrue aux dommages à l’ADN. Cependant, les voies de signalisation et de réparation de ces dommages sont fonctionnelles dans le mutant set-2. Par séquençage de l’ADN, j’ai par ailleurs montré que la stérilité progressive observée en l’absence de set-2 n’est pas due à une capacité de réparation réduite. L’ensemble de mes résultats suggère que H3K4me pourrait agir en aval de la signalisation de dommages à l’ADN, en influençant l’organisation de la chromatine aux sites des cassures double brin. J’ai d’autre part mis en évidence une nouvelle fonction pour la méthylation de H3K4 dans l’organisation de la chromatine en montrant que set-2 interagit génétiquement avec le complexe Condensine II et la Topoisomérase II, facteurs clefs de l’organisation mitotique des chromosomes. Des expériences de microscopie par FLIM-FRET ont d’ailleurs validé une fonction de H3K4 méthylée dans l’organisation de la chromatine dans la lignée germinale. Enfin, j’ai montré par analyses transcriptomiques que la protéine CFP-1 du complexe COMPASS est impliquée dans la régulation du programme transcriptionnel de la lignée germinale et que cette fonction est indépendante de SET-2. L’ensemble de mes résultats montre comment la régulation chromatinienne impacte le maintien d’une lignée germinale fonctionnelle à plusieurs niveaux. / Post-translational modifications of histones contribute to gene expression and genome stability. Methylation of lysine 4 of histone H3 (H3K4me), a mark associated with actively transcribed genes, is deposited by the highly conserved SET1 family methyltransferases acting in COMPASS related complexes. SET-2, the SET1 homologue in Caenorhabditis elegans, is responsible for the deposition of H3K4me in the germ line, and its inactivation causes progressive loss of fertility. The purpose of my PhD work was to study how SET-2 and the methylation of H3K4 contribute to the maintenance of the germ line. I have shown that the absence of SET-2 causes increased sensitivity to DNA damage. However, the DNA damage-induced signaling and repair pathways are functional in the set-2 mutant. By DNA sequencing, I have also shown that the progressive sterility observed in the absence of set-2 is not due to a reduced repair capacity. Together, my results suggest that H3K4 methylation may act downstream of DNA damage signaling, potentially by influencing the organization of chromatin at the sites of double-strand breaks. I have also described a new function for H3K4 methylation in the organization of chromatin by showing that set-2 genetically interacts with the Condensitin II complex and Topoisomerase II, key factors in mitotic chromosome organization. Moreover, FLIM-FRET microscopy experiments have validated a role for H3K4 methylation in germline chromatin organization. Finally, using transcriptomic analyses, I have described a function for CFP-1, a component of the COMPASS complex, in the regulation of the germline transcriptional program independent of SET-2. Altogether, my results show how chromatin regulation affects the maintenance of a functional germline through multiple mechanisms.

Following the discovery of the one-dimensional sequence of human DNA, much focus has been directed on microscopy and molecular techniques to learn about the spatial organization of chromatin in a 3D cell. The development of these powerful tools has enabled high-resolution, genome-wide analysis of chromosome structure under many different conditions. In this thesis, I focus on how the organization of interphase chromatin is established and maintained following mitosis. Mitotic chromosomes are folded into helical loop arrays creating short and condensed chromosomes, while interphase chromosomes are decondensed and folded into a number of structures at different length scales ranging from loops between CTCF sites, enhancers and promoters to topologically associating domains (TADs), and larger compartments. While the chromatin organization at these two very different states is well defined, the transition from a mitotic to interphase chromatin state is not well understood. The aim of this thesis is to determine how interphase chromatin is organized following mitotic chromosome decondensation and to interrogate factors potentially responsible for driving the transition. First, I determine the temporal order with which CTCF-loops, TADs, and compartments reform as cells exit mitosis, revealing a unique structure at the anaphase-telophase transition never observed before. Second, I test the role of transcription in reformation of 3D chromosome structure and show that active transcription is not required for the formation of most interphase chromatin features; instead, I propose that transcription relies on the proper formation of these structures. Finally, I show that RNA in the interphase nucleus can be degraded with only slight consequences on the overall chromatin organization, suggesting that once interphase chromatin structures are achieved, the structures are stable and RNA is only required to reduce the mixing of active and inactive compartments. Together, these studies further our understanding of how interphase structures form, how these structures relate to functional activities of the interphase cell, and the stability of chromatin structures over time.