Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-22Bitstream added on 2014-06-13T20:56:17Z : No. of bitstreams: 1 gomes_de_me_sjrp.pdf: 504080 bytes, checksum: 982f1ee0e75971f787bbecbde367a266 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No últimos anos, a avicultura brasileira posicionou o país como o terceiro maior produtor mundial de perus, entretanto o setor permanece em acentuado crescimento e tem uma grande importância econômica, movimentando cerca de 10 milhões de dólares por ano. A indústria avícola brasileira obteve novos mercados, mostrando novas perspectivas no comércio internacional. O Coronavirus dos Perus (Turkey Coronavirus, ¨TCoV) é um vírus envelopado, com RNA de fita simples, não segmentado, com sentido positivo e pertence a ordem Nidovirales, família Coronavirus e gênero Coronavirus (grupo III). Trata-se de um agente causador de enterites altamente transmissíveis, gerando grandes perdas econômicas no Brasil e no mundo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o processo de apoptose celular e a variabilidade molecular em tecidos de embriões de perus experimentalmente infectados com TCoV (primeiro isolado brasileiro, 2007). A infecção experimental foi desenvolvida por meio da inoculação viral na cavidade amniótica de embriões de perus com 23-25 dias de incubação por nove vezes consecutivas. Foi empregada a técnica de imunoistoquímica no intuito de detectar os marcadores apoptóticos Anexina V, Caspase 2, Caspase 3, p53 e ainda a detecção de apoptose com o emprego do kit TUNEL. Foi realizado o sequenciamento do vírus original e suas passagens em ovos embrionados a fim de detectar mutações decorrentes das passagens virais. O TCoV propagou em ovos embrionados de perus (Melleagridis gallopavo) apresentando vacuolização dos enterócitos e congestão como lesões histopatológicas. A análise das lesões macroscópicas mostrou congestão moderada, acúmulo de líquidos e processo inflamatório. A apoptose foi identificada pelo uso do kit comercial TUNEL e mostrou a presença viral no intestino bem como a ocorrência de apoptose celular nos enterócitos. Os resultados... / The Brazilian poultry industry represents third world producer of turkeys, in last years, whereas the sector is in growth and has a large economic importance moving around 10 million of dollars per year. Brazilian’s industry obtained new markets, showing new perspectives into the international trade. Turkey Coronavirus (TCoV) is an agent that causes high transmissible enteritis, causing great economic lost, in Brazil and worldwide. It is an enveloped virus, with single strand RNA, non segmented, positive sense, belongs to Nidovirales order, Coronaviridae family and Coronavirus group III. The present work evaluated the apoptosis process and the molecular variety in turkey embryo tissues experimentally infected by turkey Coronavirus (first isolated in Brazil, 2007). The experimental infection was performed trough viral inoculation into amniotic cavity in embryonated turkey eggs with 23-25 days of incubation for nine times consecutivelly. Immunohistochemistry was performed to detect the apoptotic factors Annexin V, Caspase 2, Caspase 3, p53 and apoptosis detection by TUNEL kit. The sequencing of original virus and the respective passages developed to detect mutations acquired through passages. TCoV propagated in turkey eggs (Melleagridis gallopavo) presenting enterocytes vacuolization and congestion as histopathologic lesions. Analysis of macroscopic lesions showed mild congestion, liquid accumulation and inflammation process. The apoptosis identification performed applying the commercial kit TUNEL shown the viral presence in intestinal tissue, as well, the cellular apoptosis occurrence. The results demonstrated positive signals to annexin V, caspase 2, caspase 3 and p53, exactly how described in others authors to others Coronavirus. Regarding to the sequences, it was detected the occurrence of three mutations never described before and 19 mutation of common occurrence... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: No últimos anos, a avicultura brasileira posicionou o país como o terceiro maior produtor mundial de perus, entretanto o setor permanece em acentuado crescimento e tem uma grande importância econômica, movimentando cerca de 10 milhões de dólares por ano. A indústria avícola brasileira obteve novos mercados, mostrando novas perspectivas no comércio internacional. O Coronavirus dos Perus (Turkey Coronavirus, ¨TCoV) é um vírus envelopado, com RNA de fita simples, não segmentado, com sentido positivo e pertence a ordem Nidovirales, família Coronavirus e gênero Coronavirus (grupo III). Trata-se de um agente causador de enterites altamente transmissíveis, gerando grandes perdas econômicas no Brasil e no mundo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o processo de apoptose celular e a variabilidade molecular em tecidos de embriões de perus experimentalmente infectados com TCoV (primeiro isolado brasileiro, 2007). A infecção experimental foi desenvolvida por meio da inoculação viral na cavidade amniótica de embriões de perus com 23-25 dias de incubação por nove vezes consecutivas. Foi empregada a técnica de imunoistoquímica no intuito de detectar os marcadores apoptóticos Anexina V, Caspase 2, Caspase 3, p53 e ainda a detecção de apoptose com o emprego do kit TUNEL. Foi realizado o sequenciamento do vírus original e suas passagens em ovos embrionados a fim de detectar mutações decorrentes das passagens virais. O TCoV propagou em ovos embrionados de perus (Melleagridis gallopavo) apresentando vacuolização dos enterócitos e congestão como lesões histopatológicas. A análise das lesões macroscópicas mostrou congestão moderada, acúmulo de líquidos e processo inflamatório. A apoptose foi identificada pelo uso do kit comercial TUNEL e mostrou a presença viral no intestino bem como a ocorrência de apoptose celular nos enterócitos. Os resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Brazilian poultry industry represents third world producer of turkeys, in last years, whereas the sector is in growth and has a large economic importance moving around 10 million of dollars per year. Brazilian's industry obtained new markets, showing new perspectives into the international trade. Turkey Coronavirus (TCoV) is an agent that causes high transmissible enteritis, causing great economic lost, in Brazil and worldwide. It is an enveloped virus, with single strand RNA, non segmented, positive sense, belongs to Nidovirales order, Coronaviridae family and Coronavirus group III. The present work evaluated the apoptosis process and the molecular variety in turkey embryo tissues experimentally infected by turkey Coronavirus (first isolated in Brazil, 2007). The experimental infection was performed trough viral inoculation into amniotic cavity in embryonated turkey eggs with 23-25 days of incubation for nine times consecutivelly. Immunohistochemistry was performed to detect the apoptotic factors Annexin V, Caspase 2, Caspase 3, p53 and apoptosis detection by TUNEL kit. The sequencing of original virus and the respective passages developed to detect mutations acquired through passages. TCoV propagated in turkey eggs (Melleagridis gallopavo) presenting enterocytes vacuolization and congestion as histopathologic lesions. Analysis of macroscopic lesions showed mild congestion, liquid accumulation and inflammation process. The apoptosis identification performed applying the commercial kit TUNEL shown the viral presence in intestinal tissue, as well, the cellular apoptosis occurrence. The results demonstrated positive signals to annexin V, caspase 2, caspase 3 and p53, exactly how described in others authors to others Coronavirus. Regarding to the sequences, it was detected the occurrence of three mutations never described before and 19 mutation of common occurrence... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-26T13:44:42Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO RAYANA 2012.pdf: 1271704 bytes, checksum: 17747d56ccd490af5f242277a6e895d9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T13:44:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO RAYANA 2012.pdf: 1271704 bytes, checksum: 17747d56ccd490af5f242277a6e895d9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / CAPES, Embrapa Suínos e Aves (SC) e CNPq / A bronquite infecciosa das aves (BI) é causada por um vírus da família Coronaviridae e caracteriza-se por uma enfermidade contagiosa, de distribuição mundial. A presença de novas variantes do vírus tem trazido grandes perdas econômicas á indústria avícola. A grande variabilidade genética do VBI das aves, o difícil controle vacinal e as diferenças em patogenicidade principalmente a falta de conhecimento da interação patógeno-hospedeiro, surge à necessidade de maiores estudos relacionados à imunopatogênese viral para que possam auxiliar futuras abordagens de controle. O objetivo deste trabalho foi estudar o perfil de transcrição da resposta a infecção causada por uma cepa clássica (M41), através dos estudos de expressão gênica dos genes TLR3 e INF tipo I, envolvidos na resposta imune inata, em diferentes horas pós infecção. Nós demonstramos aqui que galinhas infectadas com a cepa clássica do Vírus da Bronquite Infecciosa (M41) apresentaram na fase inicial da infecção, primeiras (6,12,24) horas pós infecção, aumento na expressão de IFNα, seguido por uma supressão da via de sinalização TLR3 enquanto que os níveis basais de IFNβ permaneceram inalterados. O aumento imediato da resposta IFNα logo nas primeiras 6 horas pós infecção caracteriza esta citocina como principal mediadora da resposta inata à infecção pelo VBI (M41).

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:48:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felippe_PauloAnselmoNunes_D.pdf: 7878570 bytes, checksum: bacb59d6d40fdf4e282eb9e5e89306a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O Brasil figura entre os maiores produtores e exportadores do mundo de carne de frango e ovos, o que confere a avicultura a capacidade de interferir na construção do PIB nacional. Estes índices envolvem a necessidade de uma alta produtividade e consequentemente um manejo zoosanitário suficiente para atender a economicidade do setor. Este estudo focou dois gêneros virais de importância na avicultura, o Coronavirus e o Metapneumovirus, objetivando verificar a presença de vírus em aves silvestres e sinantrópicas da avifauna brasileira, visando compreender melhor a eco-epizootiologia das respectivas morbidades de que são agentes etiológicos. Para tanto se coletou 134 amostras através de swabs traqueais e cloacais de 53 aves silvestres brasileiras de 20 espécies diferentes e de 14 pombas (Columba livia), que não possuíam sinais de doença. Além destas aves, foi também objeto de estudo amostras de galinhas e frangos comerciais oriundos de vários estados da federação nos anos de 2003 a 2009, com sintomas respiratórios. O material genético dos vírus encontrados foi extraído e submetido à reação de nested RT-PCR, destinado a amplificar a região hipervariável do gene que codifica a proteína S1 dos coronavírus e o gene que codifica a proteína G dos metapneumovírus. Os amplificados foram então sequenciados e analisados construindo-se árvores filogenéticas e matrizes de similaridade através de recursos de bioinformática. Foi possível recuperar seis (06) amostras de coronavírus de Columba livia e vinte e três (23) de galinhas domésticas. No estudo filogenético se observou dois grandes clusteres; um agrupando-se com o genótipo Massachusetts e outro com D207; das amostras de pomba 5 agruparam-se com Massachusetts; 1 amostra de galinha e uma de pomba agruparam com o genótipo Connecticut e 1 de galinha com o Arkansas. As amostras oriundas de pomba e as de galinha compartilharam uma similaridade que chegou a 100%, para algumas delas. Quanto aos metapneumovírus recuperou-se vírus de 7 aves silvestres, 7 de pombas e 15 de galinhas domésticas, sendo que estas amostras agruparam-se em dois grandes clusteres, um com o subtipo A (5 de aves silvestres, 2 de pombas e 1 de galinha) e outro com o subtipo B (2 de aves silvestres, 5 de pombas e 14 de galinha). A identidade genética entre os amplificados de galinha e de aves não domésticas chegou a 100%. Tanto para os coronavirus como para os metapneumovirus o isolamento de vírus com um de seus genes mais variáveis apresentando até 100% de identidade com os das galinhas domésticas, pode representar uma possível recuperação dos vírus atenuados utilizados nas vacinações de rotina, ou mesmo a passagem dos vírus patogênicos para estes animais, fazendo com que estes mantenham o agente no ambiente. Aves de diferentes espécies podem ainda funcionar enquanto um ambiente seletivo para estes vírus, provocando a fixação de novos genótipos virais, o que seria uma provável explicação para o fato destes agravos continuarem a ocorrer em granjas de todo o mundo em detrimento da existência de vacinas, além da possibilidade de surgimento de vírus recombinantes capazes de infectar humanos, como é o caso da SARS / Abstract: Avian Coronavirus and Metapneumovirus in Brazilian Domestic and Wild Birds: Molecular Characterization and Phylogenetic. Brazil is among the largest producers and exporters of poultry meat and eggs in the world, which gives the poultry industry the capacity to interfere in the construction of national GDB. These indexes involve the need of a high productivity and consequently a sufficient zoosanitary management for the economy of the sector. This study focused on two important viral genera for this, Coronavirus and the Metapneumovirus, to verify the presence of virions in wild birds and synanthropic ones of Brazil, seeking a better understanding of those diseases and your ecoepizootiology. For that, were collected one hundred thirty-four samples (tracheal and cloacal swabs) from fifty three Brazilian wild birds of twenty different species and fourteen from pigeons (Columba livia), without symptoms, and samples of chickens from several states of the federation in the years from 2003 to 2009, with swollen head syndrome. The virus genetic material found was subjected to the reaction of nested RT PCR, to amplify the hypervariable region of the gene encoding the coronavirus S1 subunit of the S protein and the gene encoding the G protein of metapneumovirus. The amplified were then sequenced and analyzed by constructing phylogenetic trees and similarity matrices using bioinformatics resources. Were isolated six (6) coronavirus from Columba livia and twenty three (23) from domestic fowl. In the phylogenetic analysis, two major clusters were observed one grouped with Massachusetts genotype and the other with D207; samples of five pigeons grouped with Massachusetts as well, one chicken sample and one from pigeon were grouped with genotype Connecticut and other from chicken with Arkansas genotype. The samples from pigeons and chickens shared a similarity which reached 100%. As for metapneumovirus, virus was recovered from seven wild birds, seven pigeons and fifteen from chickens. These samples were grouped into two major clusters; with subtype A (five from wild birds, two from pigeons and one from chicken) and with subtype B (two wild birds, 5 pigeons and 14 chickens). The genetic similarity between chicken amplicons to non domestic birds reached 100%. For both coronavirus and metapneumovirus, virus isolation from non domestic birds and their great similarity (reached 100%) with those from chickens, may represent a possible recovery of the attenuated virus used in routine vaccinations, or even the passage of pathogenic viruses for these animals, causing them to keep the agent in the environment. Birds of different species can also function as a selective environment for these viruses, leading to the establishment of new viral genotypes, which would be a likely explanation for the fact that these injuries continue to occur on farms around the world, even with the use of vaccines, besides the possibility of emergence of recombinant viruses capable of infecting humans, as is the case with SARS / Doutorado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-21Bitstream added on 2014-08-13T18:00:42Z : No. of bitstreams: 1 000756392.pdf: 1529746 bytes, checksum: c695f204ec592597ec7f94c736d1b9ff (MD5) / O Coronavírus felino (FCoV) é um membro da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, gênero Alphacoronavírus, que é responsável por causar a peritonite infecciosa felina (PIF). Dentre os testes sorológicos utilizados no auxílio ao diagnóstico da doença, o método mais sensível e recomendado é o ELISA. O FCoV apresenta características que dificultam seu cultivo celular, sendo necessário o uso de antígenos recombinantes no ELISA. A proteína de nucleocapsídeo (N) do FCoV apresenta vantagens no seu uso como antígeno recombinante em testes sorológicos, por ser conservada, altamente imunogênica, e ser uma das mais produzidas durante a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi padronizar e aplicar o ELISA indireto com uso de proteína N recombinante para detectar anticorpos anti-FCoV em soros de gatos naturalmente infectados. Um fragmento de rim de um felino que veio a óbito com PIF foi utilizado para extração de RNA viral, amplificação pela RT-PCR e sequenciamento da proteína N. A sequência da proteína N foi sintetizada com códons otimizados para expressão em Escherichia coli e inserida no plasmídeo pGS21a. Após sua produção, a proteína foi purificada. Foi realizado o Western blott com soro de gato naturalmente infectado para a confirmação da reatividade da proteína. Na padronização do ELISA indireto foi determinada o tipo de bloqueio, concentração de antígeno e diluição dos soros. Trezentos e oitenta e duas amostras de soros felinos foram testadas. Os resultados obtidos mostraram que a proteína produzida apresentou ótima reatividade no ELISA indireto. Foram encontradas diferenças de A450 entre os soros testados, onde se demonstrou uma alta capacidade de discriminação com A450 de 0,1 a 1,8, mostrando que o teste é quantitativo. O ELISA indireto padronizado para detecção de anticorpos anti-FCoV utilizando a proteína N recombinante é um método eficiente e pode ser aplicado em amostras de campo / The Feline Coronavírus (FCoV) is a member of the Nidovirales order, Coronaviridae family, Alphacoronavírus genus, which is responsible for causing Feline Infectious Peritonitis (FIP). Among the serological tests used in the disease diagnosis, ELISA is the most sensitive and recommended assay. FCoV has characteristics that difficult their cell culture growing, requiring the use of recombinant antigens in the ELISA. The FCoV nucleocapsid protein (N) is conserved, highly immunogenic and is the most protein produced during viral infection, being a great recombinant antigen in serological tests. The aim of this study was to standardize and apply the indirect ELISA using recombinant N protein to detect anti-FCoV antibodies in sera from naturally infected cats. A kidney fragment of died feline FIP positive was used for extraction of viral RNA, amplification by RT-PCR and sequencing of the protein N. The N protein sequence was synthesized with optimized codons for expression in Escherichia coli and inserted into pGS21a plasmid. The protein was produced, purified and the Western blotting was performed with sera from naturally infected cat to confirm the reactivity of the protein. To indirect ELISA standardization, the antigen concentration, serum dilution and the blocking reagent were determined. Three hundred eighty-two cat’s sera were tested. The obtained results showed that the protein presented good reactivity in indirect ELISA. The A450 differences from 0.1 to 1.8 showed the quantitative feature of the assay. The standardized indirect ELISA for detection of anti-FCoV using recombinant N protein is efficient and can be applied in field samples

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Luciane Alarcão Dias Melício / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Resumo: O Coronavírus felino (FCoV) é um membro da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, gênero Alphacoronavírus, que é responsável por causar a peritonite infecciosa felina (PIF). Dentre os testes sorológicos utilizados no auxílio ao diagnóstico da doença, o método mais sensível e recomendado é o ELISA. O FCoV apresenta características que dificultam seu cultivo celular, sendo necessário o uso de antígenos recombinantes no ELISA. A proteína de nucleocapsídeo (N) do FCoV apresenta vantagens no seu uso como antígeno recombinante em testes sorológicos, por ser conservada, altamente imunogênica, e ser uma das mais produzidas durante a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi padronizar e aplicar o ELISA indireto com uso de proteína N recombinante para detectar anticorpos anti-FCoV em soros de gatos naturalmente infectados. Um fragmento de rim de um felino que veio a óbito com PIF foi utilizado para extração de RNA viral, amplificação pela RT-PCR e sequenciamento da proteína N. A sequência da proteína N foi sintetizada com códons otimizados para expressão em Escherichia coli e inserida no plasmídeo pGS21a. Após sua produção, a proteína foi purificada. Foi realizado o Western blott com soro de gato naturalmente infectado para a confirmação da reatividade da proteína. Na padronização do ELISA indireto foi determinada o tipo de bloqueio, concentração de antígeno e diluição dos soros. Trezentos e oitenta e duas amostras de soros felinos foram testadas. Os resultados obtidos mostraram que a proteína produzida apresentou ótima reatividade no ELISA indireto. Foram encontradas diferenças de A450 entre os soros testados, onde se demonstrou uma alta capacidade de discriminação com A450 de 0,1 a 1,8, mostrando que o teste é quantitativo. O ELISA indireto padronizado para detecção de anticorpos anti-FCoV utilizando a proteína N recombinante é um método eficiente e pode ser aplicado em amostras de campo / Abstract: The Feline Coronavírus (FCoV) is a member of the Nidovirales order, Coronaviridae family, Alphacoronavírus genus, which is responsible for causing Feline Infectious Peritonitis (FIP). Among the serological tests used in the disease diagnosis, ELISA is the most sensitive and recommended assay. FCoV has characteristics that difficult their cell culture growing, requiring the use of recombinant antigens in the ELISA. The FCoV nucleocapsid protein (N) is conserved, highly immunogenic and is the most protein produced during viral infection, being a great recombinant antigen in serological tests. The aim of this study was to standardize and apply the indirect ELISA using recombinant N protein to detect anti-FCoV antibodies in sera from naturally infected cats. A kidney fragment of died feline FIP positive was used for extraction of viral RNA, amplification by RT-PCR and sequencing of the protein N. The N protein sequence was synthesized with optimized codons for expression in Escherichia coli and inserted into pGS21a plasmid. The protein was produced, purified and the Western blotting was performed with sera from naturally infected cat to confirm the reactivity of the protein. To indirect ELISA standardization, the antigen concentration, serum dilution and the blocking reagent were determined. Three hundred eighty-two cat's sera were tested. The obtained results showed that the protein presented good reactivity in indirect ELISA. The A450 differences from 0.1 to 1.8 showed the quantitative feature of the assay. The standardized indirect ELISA for detection of anti-FCoV using recombinant N protein is efficient and can be applied in field samples / Mestre

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Taís Fukuta da Cruz / Banca: Luciane Alarcão Dias Melicio / Banca: Angelo José Magro / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Resumo: O Coronavírus felino (FCoV), ao infectar gatos domésticos (Felis catus), exibe uma patogenicidade bimodal, produzindo desde infecções entéricas subclínicas até a peritonite infecciosa felina (PIF), que é fatal para os gatos que a desenvolvem. A PIF é considerada uma das mais importantes doenças infecciosas dos felinos. O diagnóstico da pif não-efusiva (seca) é desafiador para ser estabelecido com o animal em vida, e o da pif efusiva (úmida) pode ser estabelecido através da associação de achados clínicos e resultados de exames laboratoriais. Técnicas sorológicas não fornecem um diagnóstico conclusivo, mas são ferramentas úteis e podem ser importantes no auxílio do manejo. O presente estudo teve como objetivos desenvolver um teste de ELISA indireto com uso do antígeno recombinante N (proteína de nucleocapsídeo) do FCoV, e também realizar um estudo soroepidemiológico para infecção pelo FCoV em gatos domésticos domiciliados da cidade de Botucatu, SP. Para o ELISA indireto o antígeno foi produzido através de clonagem e expressão em bactéria. Testes de concentração do antígeno e diluição dos soros foram realizados. Cento e cinquenta e uma amostras foram testadas. O ponto de corte foi determinado através do cálculo da média aritmética da A450 de 53 amostras negativas (testadas pelo kit ImmunoComb FCoV (FIP) - teste referência do estudo), mais 4 desvios padrão. Para o estudo soroepidemiológico, foram testadas as mesmas 151 amostras, agora pelo kit ImmunoComb FCoV (FIP) para det... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The feline coronavirus (FCoV) infect domestic cats (Felis catus) with a bimodal pathogenicity, producing from enteric subclinical infections to the fatal feline infectious peritonitis (PIF). FIP is considered one of the most important infectious diseases of felids. The diagnosis of FIP non-effusive is challenging for living animals and that of FIP effusive can be established through the association of clinical findings and results of laboratory tests. Although serological techniques do not provide conclusive diagnostics, they are useful tools and may important in helping the management. The present study aimed to develop an indirect ELISA test with the use of a nucleocapsid (N) recombinant protein of FCoV as antigen and to perform a seroepidemiological study for infection with FCoV in domiciled domestic cats from Botucatu, SP. For the indirect ELISA, the antigen was produced by cloning and vector expression using bacteria. Tests of antigen concentration and serum dilution were performed. One hundred and fifty-one samples (n=151) were tested and the cut-off determined by calculating the average at A450 from 53 negative samples (as tested by ImmunoComb FCoV (FIP) kit - the reference test for the study) and four standard deviation. For the seroepidemiological study, 151 samples were tested ImmunoComb FCoV (FIP) for detection of IgG anti-FCoV antibodies. The analyzed risk factors were age, breed, sex, reproductive condition, outdoor access, creation mode (solitary or grouped). The relative ELISA sensitivity was 85,57%, the relative specificity was 94,44% and the relative accuracy was 88,74%. In the seroepidemiological study the seropositivity was 64,24% (97/151) by the ImmunoComb FCoV (FIP) kit. There was no statistical significance among breed (p=1,000), sex (p=0,0818) and solitary or grouped animals (p=0,8325). Age (p=0,0157), reproductive condition (p=0,0074) and outdoor access... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O coronavírus felino (FCoV) ocorre sob uma grande diversidade gênica de amostras e é classificado em dois patotipos: o coronavírus felino entérico (FECoV) e o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV). O patotipo FIPV é altamente virulento e responsável pelo desenvolvimento de uma doença altamente fatal, denominada de peritonite infecciosa felina (PIF). Já o FECoV apresenta-se amplamente disseminado na população felina e é responsável na maioria das vezes por infecção assintomática. Atualmente, nenhum marcador gênico conhecido é capaz de diferenciar os patotipos FECoV de FIPV. O presente estudo foi dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo, objetivou-se avaliar a diversidade molecular do gene da membrana (M) em 190 amostras provenientes de 5 gatos sem manifestações de PIF (PIF-) e de 10 gatos com manifestações clínicas e histopatológicas de PIF (PIF+). Com esse estudo, conclui-se que tanto a hipótese de mutação in vivo do FECoV para FIPV, quanto a hipótese de transmissão entre gatos do patotipo FIPV são plausíveis. No segundo capítulo, com o objetivo de avaliar a diversidade dos genes 3a-c, E e M foram sequenciados clones de amplicons para estes genes obtidos, de 6 gatos PIF+ e 2 gatos PIF-. Os genes 3a-c, E e M apresentaram diversidade gênica que confere a constituição das quasiespécies de coronavírus felino com probabilidade de emergência do patotipo de alta virulência, mas de um modo hospedeiro-específico. Com o segundo estudo, conclui-se que as linhagens FIPV de coronavírus felino apresentaram a proteína 3c truncada, sendo o gene 3c o único marcador de patotipo dos FCoVs observado dentre os genes estudados. / Feline coronavirus (FCoV) occurs as a large genic diversity of strains and is classified as two pathotypes: feline enteric coronavirus (FECoV) and feline infectious peritonitis virus (FIPV). The FIPV pathotype is highly virulent and responsible for the onset of a highly fatal disease named feline infectious peritonitis (FIP), while the FECoV pathotype is widely disseminated in feline populations leading mostly to asymptomatic infections. No genic marker is currently known to differentiate the FECoV and FIPV pathotypes. This study has been divided in two chapters. In the first chapter, the aim was to evaluate the molecular diversity of the membrane (M) gene in 190 samples from 5 cats without FIP (FIP-) and 10 cats with clinical and histopathological evidence of FIP (FIP+). The conclusion of this study is that both the in vivo mutation hypothesis in the FECoV-to-FIP direction and the hypothesis of FIPV transmission amongst cats are plausible. In the second chapter, aimed to evaluate the diversity of genes 3a-c, E and M, clones of amplicons for these genes were obtained and sequenced from samples from six FIP+ and 2 FIP- cats. Genes 3a-c, E and M show a genic diversity that results in a quasispecies constitution of FCoV that leads to the probability of the emergence of the highly virulent pathotype in a host-specific way. The conclusion of this second study is that FIPV lineages show a truncated form of the 3C protein, making the 3c gene the only pathotype marker for FCoV observed amongst the genes studied herein.

O coronavírus felino (FCoV) ocorre sob uma grande diversidade gênica de amostras e é classificado em dois patotipos: o coronavírus felino entérico (FECoV) e o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV). O patotipo FIPV é altamente virulento e responsável pelo desenvolvimento de uma doença altamente fatal, denominada de peritonite infecciosa felina (PIF). Já o FECoV apresenta-se amplamente disseminado na população felina e é responsável na maioria das vezes por infecção assintomática. Atualmente, nenhum marcador gênico conhecido é capaz de diferenciar os patotipos FECoV de FIPV. O presente estudo foi dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo, objetivou-se avaliar a diversidade molecular do gene da membrana (M) em 190 amostras provenientes de 5 gatos sem manifestações de PIF (PIF-) e de 10 gatos com manifestações clínicas e histopatológicas de PIF (PIF+). Com esse estudo, conclui-se que tanto a hipótese de mutação in vivo do FECoV para FIPV, quanto a hipótese de transmissão entre gatos do patotipo FIPV são plausíveis. No segundo capítulo, com o objetivo de avaliar a diversidade dos genes 3a-c, E e M foram sequenciados clones de amplicons para estes genes obtidos, de 6 gatos PIF+ e 2 gatos PIF-. Os genes 3a-c, E e M apresentaram diversidade gênica que confere a constituição das quasiespécies de coronavírus felino com probabilidade de emergência do patotipo de alta virulência, mas de um modo hospedeiro-específico. Com o segundo estudo, conclui-se que as linhagens FIPV de coronavírus felino apresentaram a proteína 3c truncada, sendo o gene 3c o único marcador de patotipo dos FCoVs observado dentre os genes estudados. / Feline coronavirus (FCoV) occurs as a large genic diversity of strains and is classified as two pathotypes: feline enteric coronavirus (FECoV) and feline infectious peritonitis virus (FIPV). The FIPV pathotype is highly virulent and responsible for the onset of a highly fatal disease named feline infectious peritonitis (FIP), while the FECoV pathotype is widely disseminated in feline populations leading mostly to asymptomatic infections. No genic marker is currently known to differentiate the FECoV and FIPV pathotypes. This study has been divided in two chapters. In the first chapter, the aim was to evaluate the molecular diversity of the membrane (M) gene in 190 samples from 5 cats without FIP (FIP-) and 10 cats with clinical and histopathological evidence of FIP (FIP+). The conclusion of this study is that both the in vivo mutation hypothesis in the FECoV-to-FIP direction and the hypothesis of FIPV transmission amongst cats are plausible. In the second chapter, aimed to evaluate the diversity of genes 3a-c, E and M, clones of amplicons for these genes were obtained and sequenced from samples from six FIP+ and 2 FIP- cats. Genes 3a-c, E and M show a genic diversity that results in a quasispecies constitution of FCoV that leads to the probability of the emergence of the highly virulent pathotype in a host-specific way. The conclusion of this second study is that FIPV lineages show a truncated form of the 3C protein, making the 3c gene the only pathotype marker for FCoV observed amongst the genes studied herein.

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: João Manuel Grisi Candeias / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Resumo: O vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV) causa uma doença fatal, sistêmica e imunomediada. O FIPV contem mutações do coronavírus entérico felino (FECoV) e o diagnóstico antemortem da PIF é desafiador pois a maioria dos gatos são positivos para FCoV nos testes sorológicos e de amplificação de DNA. A diferenciação entre a infecção pelo FIPV e pelo FECoV é difícil, sendo conclusivo post-mortem pelo exame histopatológico. A RT-PCR para detecção do RNAm de coronavírus felino em sangue periférico é um teste diagnóstico que evidencia a infecção e replicação do vírus. Entretanto, esses ensaios não conseguem distinguir entre cepas produtoras de PIF e do FECoV. Na patogenia da infecção, as células imunes infectadas induzem uma produção exacerbada de citocinas. Assim, nosso objetivo foi o de verificar se gatos com PIF expressam RNAM codificante de citocinas de forma alterada quando comparadas com animais saudáveis. Para tanto, amostras de sangue de 44 gatos provenientes de gatis de SP e RJ foram coletadas em 4 momentos, num intervalo de 4 meses. A partir do RNA total extraído, foi realizada a RT-qPCR para RNAm codificante de citocinas felinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-γ) normalizadas pelo GAPDH. Observou-se que, para as citocinas IL-1, IL-2, IL-6 e IL-10, foram obtidos resultados elevados na maioria dos animais. Entretanto, IL-12, TNF-α e IFN-γ estavam aumentadas em apenas alguns grupos, que pode estar associado à infecção por FIPV. Os animais que apresentaram valores elevados para essas citocinas, tinham sinais clínicos compatíveis com a doença e contato com animais que desenvolveram a PIF / Abstract: The feline infectious peritonitis virus (FIPV) causes a fatal disease, and systemic immune mediated. The FIPV contains mutations of feline enteric coronavirus (FECoV) and antemortem diagnosis of FIP is challenging because most cats are positive for FCoV in serological and DNA amplification. The differentiation between infection the FIPV and FECoV is hard being conclusive post-mortem by histopathological examination. RT-PCR for detection of feline coronavirus mRNA in peripheral blood is a diagnostic test which shows the infection and replication of the virus. However, these tests can't distinguish between strains producing FIP and FECoV. In the pathogenesis of infection, the infected cells induce an immune exacerbated production of cytokines. Thus, our goal was to determine whether cats with FIP express mRNA encoding cytokines altered form compared to healthy animals. Therefore, blood samples from 44 cats from catteries of SP and RJ were collected at 4 times within 4 months. From the total RNA, we performed RT-qPCR mRNA coding for feline cytokine (IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-γ) normalized by GAPDH. It was observed that, for the cytokines IL-1, IL-2, IL-6 and IL-10 high scores were obtained in most animals. However, IL-12, TNF-α and IFN-γ were increased only in some groups, which may be associated with FIPV infection. The animals with high values for these cytokines had clinical signs consistent with the disease and contact with animals that developed FIP / Mestre