Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-22Bitstream added on 2014-06-13T20:56:17Z : No. of bitstreams: 1 gomes_de_me_sjrp.pdf: 504080 bytes, checksum: 982f1ee0e75971f787bbecbde367a266 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No últimos anos, a avicultura brasileira posicionou o país como o terceiro maior produtor mundial de perus, entretanto o setor permanece em acentuado crescimento e tem uma grande importância econômica, movimentando cerca de 10 milhões de dólares por ano. A indústria avícola brasileira obteve novos mercados, mostrando novas perspectivas no comércio internacional. O Coronavirus dos Perus (Turkey Coronavirus, ¨TCoV) é um vírus envelopado, com RNA de fita simples, não segmentado, com sentido positivo e pertence a ordem Nidovirales, família Coronavirus e gênero Coronavirus (grupo III). Trata-se de um agente causador de enterites altamente transmissíveis, gerando grandes perdas econômicas no Brasil e no mundo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o processo de apoptose celular e a variabilidade molecular em tecidos de embriões de perus experimentalmente infectados com TCoV (primeiro isolado brasileiro, 2007). A infecção experimental foi desenvolvida por meio da inoculação viral na cavidade amniótica de embriões de perus com 23-25 dias de incubação por nove vezes consecutivas. Foi empregada a técnica de imunoistoquímica no intuito de detectar os marcadores apoptóticos Anexina V, Caspase 2, Caspase 3, p53 e ainda a detecção de apoptose com o emprego do kit TUNEL. Foi realizado o sequenciamento do vírus original e suas passagens em ovos embrionados a fim de detectar mutações decorrentes das passagens virais. O TCoV propagou em ovos embrionados de perus (Melleagridis gallopavo) apresentando vacuolização dos enterócitos e congestão como lesões histopatológicas. A análise das lesões macroscópicas mostrou congestão moderada, acúmulo de líquidos e processo inflamatório. A apoptose foi identificada pelo uso do kit comercial TUNEL e mostrou a presença viral no intestino bem como a ocorrência de apoptose celular nos enterócitos. Os resultados... / The Brazilian poultry industry represents third world producer of turkeys, in last years, whereas the sector is in growth and has a large economic importance moving around 10 million of dollars per year. Brazilian’s industry obtained new markets, showing new perspectives into the international trade. Turkey Coronavirus (TCoV) is an agent that causes high transmissible enteritis, causing great economic lost, in Brazil and worldwide. It is an enveloped virus, with single strand RNA, non segmented, positive sense, belongs to Nidovirales order, Coronaviridae family and Coronavirus group III. The present work evaluated the apoptosis process and the molecular variety in turkey embryo tissues experimentally infected by turkey Coronavirus (first isolated in Brazil, 2007). The experimental infection was performed trough viral inoculation into amniotic cavity in embryonated turkey eggs with 23-25 days of incubation for nine times consecutivelly. Immunohistochemistry was performed to detect the apoptotic factors Annexin V, Caspase 2, Caspase 3, p53 and apoptosis detection by TUNEL kit. The sequencing of original virus and the respective passages developed to detect mutations acquired through passages. TCoV propagated in turkey eggs (Melleagridis gallopavo) presenting enterocytes vacuolization and congestion as histopathologic lesions. Analysis of macroscopic lesions showed mild congestion, liquid accumulation and inflammation process. The apoptosis identification performed applying the commercial kit TUNEL shown the viral presence in intestinal tissue, as well, the cellular apoptosis occurrence. The results demonstrated positive signals to annexin V, caspase 2, caspase 3 and p53, exactly how described in others authors to others Coronavirus. Regarding to the sequences, it was detected the occurrence of three mutations never described before and 19 mutation of common occurrence... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: No últimos anos, a avicultura brasileira posicionou o país como o terceiro maior produtor mundial de perus, entretanto o setor permanece em acentuado crescimento e tem uma grande importância econômica, movimentando cerca de 10 milhões de dólares por ano. A indústria avícola brasileira obteve novos mercados, mostrando novas perspectivas no comércio internacional. O Coronavirus dos Perus (Turkey Coronavirus, ¨TCoV) é um vírus envelopado, com RNA de fita simples, não segmentado, com sentido positivo e pertence a ordem Nidovirales, família Coronavirus e gênero Coronavirus (grupo III). Trata-se de um agente causador de enterites altamente transmissíveis, gerando grandes perdas econômicas no Brasil e no mundo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o processo de apoptose celular e a variabilidade molecular em tecidos de embriões de perus experimentalmente infectados com TCoV (primeiro isolado brasileiro, 2007). A infecção experimental foi desenvolvida por meio da inoculação viral na cavidade amniótica de embriões de perus com 23-25 dias de incubação por nove vezes consecutivas. Foi empregada a técnica de imunoistoquímica no intuito de detectar os marcadores apoptóticos Anexina V, Caspase 2, Caspase 3, p53 e ainda a detecção de apoptose com o emprego do kit TUNEL. Foi realizado o sequenciamento do vírus original e suas passagens em ovos embrionados a fim de detectar mutações decorrentes das passagens virais. O TCoV propagou em ovos embrionados de perus (Melleagridis gallopavo) apresentando vacuolização dos enterócitos e congestão como lesões histopatológicas. A análise das lesões macroscópicas mostrou congestão moderada, acúmulo de líquidos e processo inflamatório. A apoptose foi identificada pelo uso do kit comercial TUNEL e mostrou a presença viral no intestino bem como a ocorrência de apoptose celular nos enterócitos. Os resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Brazilian poultry industry represents third world producer of turkeys, in last years, whereas the sector is in growth and has a large economic importance moving around 10 million of dollars per year. Brazilian's industry obtained new markets, showing new perspectives into the international trade. Turkey Coronavirus (TCoV) is an agent that causes high transmissible enteritis, causing great economic lost, in Brazil and worldwide. It is an enveloped virus, with single strand RNA, non segmented, positive sense, belongs to Nidovirales order, Coronaviridae family and Coronavirus group III. The present work evaluated the apoptosis process and the molecular variety in turkey embryo tissues experimentally infected by turkey Coronavirus (first isolated in Brazil, 2007). The experimental infection was performed trough viral inoculation into amniotic cavity in embryonated turkey eggs with 23-25 days of incubation for nine times consecutivelly. Immunohistochemistry was performed to detect the apoptotic factors Annexin V, Caspase 2, Caspase 3, p53 and apoptosis detection by TUNEL kit. The sequencing of original virus and the respective passages developed to detect mutations acquired through passages. TCoV propagated in turkey eggs (Melleagridis gallopavo) presenting enterocytes vacuolization and congestion as histopathologic lesions. Analysis of macroscopic lesions showed mild congestion, liquid accumulation and inflammation process. The apoptosis identification performed applying the commercial kit TUNEL shown the viral presence in intestinal tissue, as well, the cellular apoptosis occurrence. The results demonstrated positive signals to annexin V, caspase 2, caspase 3 and p53, exactly how described in others authors to others Coronavirus. Regarding to the sequences, it was detected the occurrence of three mutations never described before and 19 mutation of common occurrence... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: Samir Issa Samara / Resumo: A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença infecciosa causada pelo coronavírus aviário (vírus da bronquite infecciosa - VBI) que está amplamente disseminada entre as criações avícolas comerciais na maior parte do mundo. Há atualmente no Brasil, uma predominância de infecções causadas por estirpes do VBI classificadas no genótipo variante (BR-I), que revelam diferenças marcantes de antigenicidade com relação à estirpe vacinal Massachusetts, rotineiramente usada em nosso país. Isso resulta em uma baixa imunidade-cruzada e consequentemente em um menor nível de proteção contra isolados de campo do genótipo BR-I. Dessa forma, os objetivos principais do presente estudo foram formular uma vacina experimental inativada com, uma estirpe IBVPR-05 variante do genótipo BR-1 do VBI acrescida de um novo adjuvante oleoso; testá-la após a administração, com 1 dia de idade, da vacina comercial atenuada com estirpe Massachusetts, avaliando-se as respostas imunes humorais e cito-mediadas, bem como o estado de proteção ao desafio com essa estirpe variante do VBI através da avaliação histopatológica e quantificação absoluta da carga viral presente na traqueia e rins de aves vacinadas e desafiadas com a variante. Os resultados deste estudo demonstraram que esse esquema imunoprofilático (vacinação das aves com 1 dia de idade com vacina atenuada comercial e revacinação com 14 dias de idade com vacina inativada experimental homóloga) induziu aumentos significativos nos níveis de anticorpos lacrimais e séricos do isótipo IgG anti-VBI e também na expressão dos genes relacionados às respostas imunes cito-mediadas, sobretudo o da cadeia  do CD8 e da Granzima A, nas aves vacinadas, que se mostraram associados com a diminuição de lesões histológicas e uma menor carga viral na traqueia e rins nas aves vacinadas e desafiadas. Concluiu-se que as respostas imunes humoral e celular de memória conferidas ... / Abstract: The infectious bronchitis (BIG) is an infectious disease caused by avian coronavirus (infectious bronchitis virus - IBV) that is widespread among commercial poultry flocks in the world. There are currently in Brazil, a predominance of infections caused by strains of IBV classified in variant genotype (BR-I), which reveal striking differences in antigenicity with regard to the vaccine strain Massachusetts, routinely used in this country. The consequence is a low cross-immunity and lower level of protection against Brazilian field isolates of genotype BR-I. Thus, the main objectives of this study were to formulate an experimental inactivated vaccine with a variant strain of IBV previously characterized as genotype BR-I and added of a new oil adjuvant and test it after an administration, at 1 day old, of a commercial attenuated Massachusetts vaccine, followed by the evaluation of humoral and cellular immune (CMI) responses, as well as the state of protection upon challenge with this variant strain of IBV by histopathological examination and absolute quantification of viral load present in the trachea, and kidneys of these birds vaccinated and challenged with this variant strain. The results of this study demonstrated that this immunoprophylactic approach (vaccination of birds with 1 day old with attenuated commercial vaccine and revaccination at 14 days of age with annual experimental inactivated vaccine) was able to elicit significant increases in the serum and tear levels of anti-IBV antibodies of IgG isotype, and also in the expression of CMI genes, especially of CD8  chain and Granzyme A in the vaccinated birds, which were associated with decreased histological lesions and reduced viral load in the trachea and kidney of vaccinated and challenged birds. It was concluded that humoral and cellular memory immune responses conferred by vaccination with this Brazilian variant strain of IBV combined to a previous Massachusets ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-21Bitstream added on 2014-08-13T18:00:42Z : No. of bitstreams: 1 000756392.pdf: 1529746 bytes, checksum: c695f204ec592597ec7f94c736d1b9ff (MD5) / O Coronavírus felino (FCoV) é um membro da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, gênero Alphacoronavírus, que é responsável por causar a peritonite infecciosa felina (PIF). Dentre os testes sorológicos utilizados no auxílio ao diagnóstico da doença, o método mais sensível e recomendado é o ELISA. O FCoV apresenta características que dificultam seu cultivo celular, sendo necessário o uso de antígenos recombinantes no ELISA. A proteína de nucleocapsídeo (N) do FCoV apresenta vantagens no seu uso como antígeno recombinante em testes sorológicos, por ser conservada, altamente imunogênica, e ser uma das mais produzidas durante a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi padronizar e aplicar o ELISA indireto com uso de proteína N recombinante para detectar anticorpos anti-FCoV em soros de gatos naturalmente infectados. Um fragmento de rim de um felino que veio a óbito com PIF foi utilizado para extração de RNA viral, amplificação pela RT-PCR e sequenciamento da proteína N. A sequência da proteína N foi sintetizada com códons otimizados para expressão em Escherichia coli e inserida no plasmídeo pGS21a. Após sua produção, a proteína foi purificada. Foi realizado o Western blott com soro de gato naturalmente infectado para a confirmação da reatividade da proteína. Na padronização do ELISA indireto foi determinada o tipo de bloqueio, concentração de antígeno e diluição dos soros. Trezentos e oitenta e duas amostras de soros felinos foram testadas. Os resultados obtidos mostraram que a proteína produzida apresentou ótima reatividade no ELISA indireto. Foram encontradas diferenças de A450 entre os soros testados, onde se demonstrou uma alta capacidade de discriminação com A450 de 0,1 a 1,8, mostrando que o teste é quantitativo. O ELISA indireto padronizado para detecção de anticorpos anti-FCoV utilizando a proteína N recombinante é um método eficiente e pode ser aplicado em amostras de campo / The Feline Coronavírus (FCoV) is a member of the Nidovirales order, Coronaviridae family, Alphacoronavírus genus, which is responsible for causing Feline Infectious Peritonitis (FIP). Among the serological tests used in the disease diagnosis, ELISA is the most sensitive and recommended assay. FCoV has characteristics that difficult their cell culture growing, requiring the use of recombinant antigens in the ELISA. The FCoV nucleocapsid protein (N) is conserved, highly immunogenic and is the most protein produced during viral infection, being a great recombinant antigen in serological tests. The aim of this study was to standardize and apply the indirect ELISA using recombinant N protein to detect anti-FCoV antibodies in sera from naturally infected cats. A kidney fragment of died feline FIP positive was used for extraction of viral RNA, amplification by RT-PCR and sequencing of the protein N. The N protein sequence was synthesized with optimized codons for expression in Escherichia coli and inserted into pGS21a plasmid. The protein was produced, purified and the Western blotting was performed with sera from naturally infected cat to confirm the reactivity of the protein. To indirect ELISA standardization, the antigen concentration, serum dilution and the blocking reagent were determined. Three hundred eighty-two cat’s sera were tested. The obtained results showed that the protein presented good reactivity in indirect ELISA. The A450 differences from 0.1 to 1.8 showed the quantitative feature of the assay. The standardized indirect ELISA for detection of anti-FCoV using recombinant N protein is efficient and can be applied in field samples

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-01Bitstream added on 2015-04-09T12:47:56Z : No. of bitstreams: 1 000814595_20170106.pdf: 227751 bytes, checksum: 314d86ad55894d7ecf7fb811a5737798 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-06T13:21:18Z: 000814595_20170106.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-06T13:22:01Z : No. of bitstreams: 1 000814595.pdf: 772035 bytes, checksum: ffe3ee6a24ca15fd8c342e53da722f25 (MD5) / A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença infecciosa causada pelo coronavírus aviário (vírus da bronquite infecciosa – VBI) que está amplamente disseminada entre as criações avícolas comerciais na maior parte do mundo. Há atualmente no Brasil, uma predominância de infecções causadas por estirpes do VBI classificadas no genótipo variante (BR-I), que revelam diferenças marcantes de antigenicidade com relação à estirpe vacinal Massachusetts, rotineiramente usada em nosso país. Isso resulta em uma baixa imunidade-cruzada e consequentemente em um menor nível de proteção contra isolados de campo do genótipo BR-I. Dessa forma, os objetivos principais do presente estudo foram formular uma vacina experimental inativada com, uma estirpe IBVPR-05 variante do genótipo BR-1 do VBI acrescida de um novo adjuvante oleoso; testá-la após a administração, com 1 dia de idade, da vacina comercial atenuada com estirpe Massachusetts, avaliando-se as respostas imunes humorais e cito-mediadas, bem como o estado de proteção ao desafio com essa estirpe variante do VBI através da avaliação histopatológica e quantificação absoluta da carga viral presente na traqueia e rins de aves vacinadas e desafiadas com a variante. Os resultados deste estudo demonstraram que esse esquema imunoprofilático (vacinação das aves com 1 dia de idade com vacina atenuada comercial e revacinação com 14 dias de idade com vacina inativada experimental homóloga) induziu aumentos significativos nos níveis de anticorpos lacrimais e séricos do isótipo IgG anti-VBI e também na expressão dos genes relacionados às respostas imunes cito-mediadas, sobretudo o da cadeia  do CD8 e da Granzima A, nas aves vacinadas, que se mostraram associados com a diminuição de lesões histológicas e uma menor carga viral na traqueia e rins nas aves vacinadas e desafiadas. Concluiu-se que as respostas imunes humoral e celular de memória conferidas ... / The infectious bronchitis (BIG) is an infectious disease caused by avian coronavirus (infectious bronchitis virus - IBV) that is widespread among commercial poultry flocks in the world. There are currently in Brazil, a predominance of infections caused by strains of IBV classified in variant genotype (BR-I), which reveal striking differences in antigenicity with regard to the vaccine strain Massachusetts, routinely used in this country. The consequence is a low cross-immunity and lower level of protection against Brazilian field isolates of genotype BR-I. Thus, the main objectives of this study were to formulate an experimental inactivated vaccine with a variant strain of IBV previously characterized as genotype BR-I and added of a new oil adjuvant and test it after an administration, at 1 day old, of a commercial attenuated Massachusetts vaccine, followed by the evaluation of humoral and cellular immune (CMI) responses, as well as the state of protection upon challenge with this variant strain of IBV by histopathological examination and absolute quantification of viral load present in the trachea, and kidneys of these birds vaccinated and challenged with this variant strain. The results of this study demonstrated that this immunoprophylactic approach (vaccination of birds with 1 day old with attenuated commercial vaccine and revaccination at 14 days of age with annual experimental inactivated vaccine) was able to elicit significant increases in the serum and tear levels of anti-IBV antibodies of IgG isotype, and also in the expression of CMI genes, especially of CD8  chain and Granzyme A in the vaccinated birds, which were associated with decreased histological lesions and reduced viral load in the trachea and kidney of vaccinated and challenged birds. It was concluded that humoral and cellular memory immune responses conferred by vaccination with this Brazilian variant strain of IBV combined to a previous Massachusets ...

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Luciane Alarcão Dias Melício / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Resumo: O Coronavírus felino (FCoV) é um membro da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, gênero Alphacoronavírus, que é responsável por causar a peritonite infecciosa felina (PIF). Dentre os testes sorológicos utilizados no auxílio ao diagnóstico da doença, o método mais sensível e recomendado é o ELISA. O FCoV apresenta características que dificultam seu cultivo celular, sendo necessário o uso de antígenos recombinantes no ELISA. A proteína de nucleocapsídeo (N) do FCoV apresenta vantagens no seu uso como antígeno recombinante em testes sorológicos, por ser conservada, altamente imunogênica, e ser uma das mais produzidas durante a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi padronizar e aplicar o ELISA indireto com uso de proteína N recombinante para detectar anticorpos anti-FCoV em soros de gatos naturalmente infectados. Um fragmento de rim de um felino que veio a óbito com PIF foi utilizado para extração de RNA viral, amplificação pela RT-PCR e sequenciamento da proteína N. A sequência da proteína N foi sintetizada com códons otimizados para expressão em Escherichia coli e inserida no plasmídeo pGS21a. Após sua produção, a proteína foi purificada. Foi realizado o Western blott com soro de gato naturalmente infectado para a confirmação da reatividade da proteína. Na padronização do ELISA indireto foi determinada o tipo de bloqueio, concentração de antígeno e diluição dos soros. Trezentos e oitenta e duas amostras de soros felinos foram testadas. Os resultados obtidos mostraram que a proteína produzida apresentou ótima reatividade no ELISA indireto. Foram encontradas diferenças de A450 entre os soros testados, onde se demonstrou uma alta capacidade de discriminação com A450 de 0,1 a 1,8, mostrando que o teste é quantitativo. O ELISA indireto padronizado para detecção de anticorpos anti-FCoV utilizando a proteína N recombinante é um método eficiente e pode ser aplicado em amostras de campo / Abstract: The Feline Coronavírus (FCoV) is a member of the Nidovirales order, Coronaviridae family, Alphacoronavírus genus, which is responsible for causing Feline Infectious Peritonitis (FIP). Among the serological tests used in the disease diagnosis, ELISA is the most sensitive and recommended assay. FCoV has characteristics that difficult their cell culture growing, requiring the use of recombinant antigens in the ELISA. The FCoV nucleocapsid protein (N) is conserved, highly immunogenic and is the most protein produced during viral infection, being a great recombinant antigen in serological tests. The aim of this study was to standardize and apply the indirect ELISA using recombinant N protein to detect anti-FCoV antibodies in sera from naturally infected cats. A kidney fragment of died feline FIP positive was used for extraction of viral RNA, amplification by RT-PCR and sequencing of the protein N. The N protein sequence was synthesized with optimized codons for expression in Escherichia coli and inserted into pGS21a plasmid. The protein was produced, purified and the Western blotting was performed with sera from naturally infected cat to confirm the reactivity of the protein. To indirect ELISA standardization, the antigen concentration, serum dilution and the blocking reagent were determined. Three hundred eighty-two cat's sera were tested. The obtained results showed that the protein presented good reactivity in indirect ELISA. The A450 differences from 0.1 to 1.8 showed the quantitative feature of the assay. The standardized indirect ELISA for detection of anti-FCoV using recombinant N protein is efficient and can be applied in field samples / Mestre

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Taís Fukuta da Cruz / Banca: Luciane Alarcão Dias Melicio / Banca: Angelo José Magro / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Resumo: O Coronavírus felino (FCoV), ao infectar gatos domésticos (Felis catus), exibe uma patogenicidade bimodal, produzindo desde infecções entéricas subclínicas até a peritonite infecciosa felina (PIF), que é fatal para os gatos que a desenvolvem. A PIF é considerada uma das mais importantes doenças infecciosas dos felinos. O diagnóstico da pif não-efusiva (seca) é desafiador para ser estabelecido com o animal em vida, e o da pif efusiva (úmida) pode ser estabelecido através da associação de achados clínicos e resultados de exames laboratoriais. Técnicas sorológicas não fornecem um diagnóstico conclusivo, mas são ferramentas úteis e podem ser importantes no auxílio do manejo. O presente estudo teve como objetivos desenvolver um teste de ELISA indireto com uso do antígeno recombinante N (proteína de nucleocapsídeo) do FCoV, e também realizar um estudo soroepidemiológico para infecção pelo FCoV em gatos domésticos domiciliados da cidade de Botucatu, SP. Para o ELISA indireto o antígeno foi produzido através de clonagem e expressão em bactéria. Testes de concentração do antígeno e diluição dos soros foram realizados. Cento e cinquenta e uma amostras foram testadas. O ponto de corte foi determinado através do cálculo da média aritmética da A450 de 53 amostras negativas (testadas pelo kit ImmunoComb FCoV (FIP) - teste referência do estudo), mais 4 desvios padrão. Para o estudo soroepidemiológico, foram testadas as mesmas 151 amostras, agora pelo kit ImmunoComb FCoV (FIP) para det... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The feline coronavirus (FCoV) infect domestic cats (Felis catus) with a bimodal pathogenicity, producing from enteric subclinical infections to the fatal feline infectious peritonitis (PIF). FIP is considered one of the most important infectious diseases of felids. The diagnosis of FIP non-effusive is challenging for living animals and that of FIP effusive can be established through the association of clinical findings and results of laboratory tests. Although serological techniques do not provide conclusive diagnostics, they are useful tools and may important in helping the management. The present study aimed to develop an indirect ELISA test with the use of a nucleocapsid (N) recombinant protein of FCoV as antigen and to perform a seroepidemiological study for infection with FCoV in domiciled domestic cats from Botucatu, SP. For the indirect ELISA, the antigen was produced by cloning and vector expression using bacteria. Tests of antigen concentration and serum dilution were performed. One hundred and fifty-one samples (n=151) were tested and the cut-off determined by calculating the average at A450 from 53 negative samples (as tested by ImmunoComb FCoV (FIP) kit - the reference test for the study) and four standard deviation. For the seroepidemiological study, 151 samples were tested ImmunoComb FCoV (FIP) for detection of IgG anti-FCoV antibodies. The analyzed risk factors were age, breed, sex, reproductive condition, outdoor access, creation mode (solitary or grouped). The relative ELISA sensitivity was 85,57%, the relative specificity was 94,44% and the relative accuracy was 88,74%. In the seroepidemiological study the seropositivity was 64,24% (97/151) by the ImmunoComb FCoV (FIP) kit. There was no statistical significance among breed (p=1,000), sex (p=0,0818) and solitary or grouped animals (p=0,8325). Age (p=0,0157), reproductive condition (p=0,0074) and outdoor access... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Antonio Carlos Alessi / Banca: Ricardo Luiz Moro de Souza / Banca: Luis Francisco Prata / Banca: Antonio Carlos Paulillo / Resumo: O vírus da bronquite infecciosa aviária (VBIG) permanece como um dos principais problemas para a avicultura industrial. Para a imunoprofilaxia dessa virose existem vacinas "vivas" atenuadas ou inativadas, mas elas não são efetivas para o controle dessa doença infecciosa a longo prazo, especialmente contra estirpes variantes desse vírus. A função primordial das vacinas usuais contra o VBIG são estimular as respostas imunes sistêmicas e locais, mediadas por anticorpos ou por células T efetoras. Com a finalidade de investigar os mecanismos envolvidos na imunidade protetora, os níveis de anticorpos locais e sistêmicos e a expressão de genes associados a respostas de linfócitos T citotóxicos, tais como o CD8 e a granzima A foi avaliada na mucosa traqueal, após a imunização primária de pintinhos de 1 dia de idade com vacinas atenuadas contra o VBIG seguida do desafio 42 dias depois. Proteção ao desafio foi avaliada por meio da ciliostase traqueal, histopatologia e detecção de vírus pela técnica de RT-PCR em tempo real na traquéia. Os níveis de anticorpos no soro e na secreção lacrimal foram mensurados pelo Sandwich- Concanavalina A - ELISA. A expressão dos genes de CD8 e de granzima A foram avaliadas pela técnica de RT-PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que a proteção contra a infecção pelo VBIG em aves vacinadas se correlacionou com os níveis de anticorpos anti-virais específicos dos isótipos IgG, IgM e IgA na secreção lacrimal e com os níveis de expressão de CD8 e de granzima A. Concluindo, os resultados possibilataram definir o perfil cinético do desenvolvimento das respostas imunes de memória contra o VBIG na mucosa que é o sítio primário de replicação viral e indicaram que os mecanismos de imunidade humoral e celular podem ser muito importantes para a proteção de hospedeiros naturais contra a infecção pelo VBIG. / Abstract: Avian infectious bronchitis (IBV) remains a major problem in the poultry industry. Live and inactivated vaccines are available, but they are not effective long term in controlling IBV infection, specially against variant strains. The essential function of existing IBV vaccines is to elicit, ideally, local and systemic specific antibodies, as well as cell-mediated immunity to this virus. To investigate the mechanisms of protective immunity, the levels of systemic and local specific antibodies and the expression of genes responsible for cytotoxic T cell killing such as CD8-marker and granzyme-A at tracheal mucosa was evaluated after the primary immunization of 1- day-old chicks with an attenuated avian infectious bronchitis virus (IBV) and challenge 42 days later. Challenge protection was evaluated by tracheal ciliostasis, histopathology and virus detection by real time RT-PCR. The serum and lachrymal anti-IBV antibody levels of IgG, IgM and IgM isotypes were measured with a Sandwich-ELISA Concanavalina-A method. The expression of CD8 and granzyme A genes were evaluated by real time RT-PCR. The results showed protection against challenge with the M-41. Lachrymal IgG, IgM and IgA anti-IBV specific antibodies and the levels of expression of CD8 and granzyme A genes correlated significantly with the protection to challenge. Overall, the results provided the kinetics on the development of memory mucosal immune responses against IBV at the primary replication site and indicate that tracheal humoral and cellular immune mechanisms may be very important in protecting natural hosts against IBV infection. / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: José Antônio Jerez / Banca: Iveraldo dos Santos Dutra / Resumo: O Complexo de Enterite de Perus (PEC) tem sido incriminado como uma das maiores causas de perdas econômicas em outros países. Neste estudo, foi demonstrado causando diarréia, perda de peso e na maioria das vezes alta mortalidade em perus acometidos de enterite com 30-120 dias de idade de uma determinada região produtora no Brasil. A RT-PCR foi aplicada em suspensões de intestinos (SI) (n=2), respectivos conteúdos intestinais (CI) (n=2), bursa de Fabrícius (BF), fezes (F) (n=5) e swabs cloacais (SC) (n=44), para amplificar a região conservada 3'UTR e gene do nucleocapsídeo de TCoV. Os exames de histopatologia e imunohistoquímica direta foram realizados para detectar o antígeno TCoV a partir de lâminas de intestinos e bursas infectados. Todos os resultados obtidos nos tecidos marcados, revelaram lesões sugestivas de terem sido causadas pela infecção por TCoV. A marcação positiva da imunohistoquímica direta estava presente em todas as lâminas de intestinos, entretanto, todas as BF analisadas foram negativas. Os achados de RT-PCR foram positivos para TCoV em todas as amostras de fezes e 27,27% das amostras de SC foram positivas para a região 3'UTR e região TCoV nucleocapsídeo. As amostras de soro (n=200), foram positivas para TCoV, com títulos variando de 2.0Log a 8.0Log usando o ELISA comercial IDEEX para IBV. Finalmente, o melhor material de campo para o diagnóstico de TCoV foram as fezes (F) e/ou suspensão de intestinos (SI), resultando na primeira descrição de perus com quadro agudo de enterite acometidos por coronavirus Grupo 3 no Brasil. / Abstract: The Poult Enteritis Complex (PEC) has been incriminated as the major cause of losses in other countries, and especially, in this study, was described causing diarrhea, weight gain and most of the time, high mortality. In this study, it was performed the turkey coronavirus (TCoV) detection from 30-120 day old affected poults from a particular producer region in Brazil. The RT-PCR was applied in intestines suspensions (IS) (n=2), respective intestines contents (IC) (n=2), bursa of Fabrícius (BF), faecal droppings (FD) (n=5) and cloacal swabs (CS) (n=44) to amplify the 3þUTR conserved region and TCoV nucleocapsid gene. The histopathological and direct immunohistochemical examinations were performed to detect the TCoV antigen from infected intestine and bursa slides. All results obtained from stained tissues, revealed lesions described to be caused by TCoV infection. The direct immunohistochemical positive signal was present in all intestine slides, however all BF analysed were negative. RT-PCRs findings were positive for TCoV in all FD samples, and 27,27% of CS analysed were positive for 3þUTR and TCoV nucleocapsid region. The sera samples (n=200) were positive for TCoV, with titers range from d 2.0Log to 8.0Log using the IDEEX commercial ELISA for IBV. Finally, the best field material for TCoV diagnosis was FD and/or intestine suspensions (IS), resulting in a first describe of TCoV affecting poults in Brazil. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-14Bitstream added on 2014-06-13T20:36:40Z : No. of bitstreams: 1 santos_il_me_jabo.pdf: 445425 bytes, checksum: 8eabdcdd56ae9af7bcf160cad345bd86 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O vírus da bronquite infecciosa aviária (VBIG) permanece como um dos principais problemas para a avicultura industrial. Para a imunoprofilaxia dessa virose existem vacinas “vivas” atenuadas ou inativadas, mas elas não são efetivas para o controle dessa doença infecciosa a longo prazo, especialmente contra estirpes variantes desse vírus. A função primordial das vacinas usuais contra o VBIG são estimular as respostas imunes sistêmicas e locais, mediadas por anticorpos ou por células T efetoras. Com a finalidade de investigar os mecanismos envolvidos na imunidade protetora, os níveis de anticorpos locais e sistêmicos e a expressão de genes associados a respostas de linfócitos T citotóxicos, tais como o CD8 e a granzima A foi avaliada na mucosa traqueal, após a imunização primária de pintinhos de 1 dia de idade com vacinas atenuadas contra o VBIG seguida do desafio 42 dias depois. Proteção ao desafio foi avaliada por meio da ciliostase traqueal, histopatologia e detecção de vírus pela técnica de RT-PCR em tempo real na traquéia. Os níveis de anticorpos no soro e na secreção lacrimal foram mensurados pelo Sandwich- Concanavalina A – ELISA. A expressão dos genes de CD8 e de granzima A foram avaliadas pela técnica de RT-PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que a proteção contra a infecção pelo VBIG em aves vacinadas se correlacionou com os níveis de anticorpos anti-virais específicos dos isótipos IgG, IgM e IgA na secreção lacrimal e com os níveis de expressão de CD8 e de granzima A. Concluindo, os resultados possibilataram definir o perfil cinético do desenvolvimento das respostas imunes de memória contra o VBIG na mucosa que é o sítio primário de replicação viral e indicaram que os mecanismos de imunidade humoral e celular podem ser muito importantes para a proteção de hospedeiros naturais contra a infecção pelo VBIG. / Avian infectious bronchitis (IBV) remains a major problem in the poultry industry. Live and inactivated vaccines are available, but they are not effective long term in controlling IBV infection, specially against variant strains. The essential function of existing IBV vaccines is to elicit, ideally, local and systemic specific antibodies, as well as cell-mediated immunity to this virus. To investigate the mechanisms of protective immunity, the levels of systemic and local specific antibodies and the expression of genes responsible for cytotoxic T cell killing such as CD8-marker and granzyme-A at tracheal mucosa was evaluated after the primary immunization of 1- day-old chicks with an attenuated avian infectious bronchitis virus (IBV) and challenge 42 days later. Challenge protection was evaluated by tracheal ciliostasis, histopathology and virus detection by real time RT-PCR. The serum and lachrymal anti-IBV antibody levels of IgG, IgM and IgM isotypes were measured with a Sandwich-ELISA Concanavalina-A method. The expression of CD8 and granzyme A genes were evaluated by real time RT-PCR. The results showed protection against challenge with the M-41. Lachrymal IgG, IgM and IgA anti-IBV specific antibodies and the levels of expression of CD8 and granzyme A genes correlated significantly with the protection to challenge. Overall, the results provided the kinetics on the development of memory mucosal immune responses against IBV at the primary replication site and indicate that tracheal humoral and cellular immune mechanisms may be very important in protecting natural hosts against IBV infection.