Nature uses sunlight either as energy source or as information carrier. Photoreception is achieved by two groups of specialised proteins: photo-enzymes that catalyse photoreactions and photosensors that initiate physiological functions. In the present work mechanistic studies were conducted on one representative of each group by using site-directed mutagenesis as well as stationary and time-resolved spectroscopy. The photo-enzyme NADPH:Protochlorophyllide Oxidoreductase (POR) catalyses the light-dependent C17-C18 double bond reduction of protochlorophyllide, including a hydride and a proton transfer, to produce chlorophyllide, the immediate precursor of chlorophyll. POR provides a unique opportunity to study the hydride transfer mechanism in detail. Three distinct intermediates, prior to product formation, were observed that were interpreted as electron and proton-coupled electron transfer reactions from NADPH indicating a sequential hydride transfer mechanism. An active-site mutant, POR-C226S, yields distinct different intermediates compared to POR wild type but ends in the same chlorophyllide stereoisomer most likely due to an altered protochlorophyllide binding. This work provides the first direct observation of a stepwise hydride transfer mechanism in a biological system. Cryptochromes (CRY) are so far defined as flavoprotein blue-light photosensors that regulate the circadian clock throughout nature and are suggested as the candidate magnetoreceptor in animals. Animal CRY are subdivided into two classes of proteins: the light-responsive Type I (invertebrates) and the light-independent Type II (mainly vertebrates). The molecular basis of their different roles in the circadian clock is still unknown. Animal Type I CRY are suggested to undergo conformational changes - required for induction of subsequent signalling cascades - induced by the change in the FAD redox state due to light absorption. The study shows that in contrast to Type I animal Type II CRY do not bind tightly FAD as a cofactor due to the lack of structural features and therefore provide the molecular basis for their different biological roles ruling out a direct photomagnetoreceptor function. Further, detailed studies on a fruit fly (Dm)CRY reveal that it does not undergo a photocycle as FAD release and Trp decomposition were observed. Thus, it is suggested that light is a negative regulator of DmCRY stability linking the initial photochemistry to subsequent dark processes leading to signal transduction on a molecular level.

Poon Lok-man. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (leaves 126-128). / Abstracts in English and Chinese. / ABSTRACT --- p.ii / ACKNOWLEDGEMENT --- p.v / LIST OF TABLES --- p.vi / LIST OF FIGURES --- p.vii / GLOSSARY --- p.viii / Chapter CHAPTER 1: --- INTRODUCTION --- p.1 / Chapter CHAPTER 2: --- AIR POLLUTANTS AND ENVIRONMENTAL MONITORING --- p.8 / Chapter CHAPTER 3: --- PRINCIPLE OF LEAD FINGERPRINTING --- p.15 / Chapter CHAPTER 4: --- INSTRUMENTATION AND THEORY --- p.20 / Chapter CHAPTER 5: --- OPTIMIZATION OF ANALYTICAL PERFORMANCE IN LEAD ISOTOPE ANALYSIS --- p.29 / Chapter CHAPTER 6: --- DETERMINATION OF LEAD CONTENTS AND ISOTOPIC RATIOS IN POTENTIAL AIRBORNE LEAD SOURCES --- p.55 / Chapter CHAPTER 7: --- DETERMINATION OF LEAD CONTENT IN PARTICULATES COLLECTED ONTO HV-FILTERS --- p.69 / Chapter CHAPTER 8: --- ENVIRONMENTAL SURVEY --- p.74 / Chapter CHAPTER 9: --- "CONCLUSIONS, LIMITATIONS AND FURTHER DIRECTION" --- p.97 / APPENDICES --- p.105 / BIBLIOGRAPHY --- p.126

A transesterificação metílica em meio homogêneo é catalisada por bases, tais como hidróxidos e alcóxidos de sódio ou potássio e se processa em baixa temperatura de reação, mesmo em escala industrial. A utilização de catalisadores formados por sólidos básicos aparece como uma alternativa promissora aos processos homogêneos convencionais, tendo em vista as inúmeras vantagens como a redução da ocorrência das reações indesejáveis de saponificação e redução de custos dos processos pela diminuição do número de operações associadas. Em estudos anteriores realizados pelo grupo, catalisadores a base de Mg/La com diferentes composições químicas (9:1, 1:1 e 1:9) mostraram-se promissores para a obtenção de ésteres metílicos via reação de transesterificação, porém não foi possível fazer uma correlação entre atividade catalítica e as propriedades físico-químicas quando toda a série foi considerada. Assim, a realização de um estudo de caráter fundamental, baseado em reações modelo e uso de moléculas sonda, permite avançar no entendimento das propriedades de superfície destes catalisadores. Portanto, o presente trabalho estuda a reação entre metanol e acetato de etila em catalisadores a base de Mg/La utilizando espectroscopia de reflectância difusa no infravermelho com transformada de Fourier (DRIFTS) acoplada a espectrometria de massas (MS) identificando os intermediários e produtos formados para determinar a rota reacional. As análises de difração de raios X mostram que os precursores são predominantemente compostos por carbonatos hidratados de magnésio (Mg/La 1:1 e 9:1) e de lantânio (Mg/La 1:9). Os perfis de decomposição térmica e difratogramas de raios X obtidos a partir de tratamento térmico in situ indicaram que estes carbonatos se decompõem apenas a partir de 750 C. As análises de Dessorção a Temperatura Programada realizadas com moléculas sonda, metanol e acetato de etila, mostraram a adsorção em maior quantidade do metanol independente da composição química do sólido. A partir dos resultados obtidos por DRIFTS-MS foi proposta uma rota reacional para a reação de transesterificação do acetato de etila e metanol, que ocorre via adsorção do metanol e do acetato de etila na superfície do catalisador, seguida da formação de um intermediário tetraédrico formado pelas moléculas adsorvidas, que sofre um rearranjo formando etanol, acetato de metila, acetona e metano. Simultaneamente, parte do metanol adsorvido como metoxi monodentado é desidrogenado formando formiatos que são dessorvidos na forma de formaldeído e decompostos formando CO2 e H2 / The methylic transesterification of vegetable oils catalyzed by sodium or potassium hydroxides or alkoxides is carried out in homogeneous media at a low reaction temperature, even on an industrial scale. However, the homogeneous reaction has some disadvantages such as the sensitivity of the catalyst to the presence of free fatty acids and/or water in the oil feedstock, which causes the occurrence of undesirable saponification reactions. On the other hand, the use of basic solid catalysts appears as a promising alternative to conventional homogeneous processes, since it reduces the occurrence of undesirable reactions of saponification and decreases the process costs due to the reduction of the number of operations associated. In a previous studies of the group, Mg/La catalysts with different chemical compositions (9:1, 1:1 and 1:9) showed good results for the production of methyl esters via transesterification reaction. However, it was not possible to make a correlation between catalytic activity and the basic properties when the whole series was considered. Therefore, the realization of a fundamental study based on model reactions and the use of probe molecules may lead to the comprehension of the surface properties of these catalysts. Thus, in this work, the reaction between methanol and ethyl acetate catalyzed by a series of Mg/La-catalysts was studied using diffuse reflectance infrared Fourier transform spectroscopy (DRIFTS) coupled to mass spectrometry (QMS) aiming at identify the intermediates and products formed to determine the reaction route. The analysis of X-ray diffraction showed that the precursors are mainly hydrated carbonates of magnesium (Mg/La 1:1 and 9:1) and lanthanum (Mg/La 1:9). The TG profiles and in situ X-ray difratograms obtained during the thermal decomposition of the precursors indicate that these carbonates decompose at 750 C or above. Temperature Programmed Desorption analysis carried out with probe molecules, methanol and ethyl acetate, showed a higher amount of methanol adsorbed on the catalyst surface. From the results obtained by DRIFTS-MS a reaction route for the transesterification reaction of methanol and ethyl acetate was proposed. The reaction occurs via adsorption of methanol and ethyl acetate on the catalyst surface. These adsorbed species react forming an adsorbed tetrahedral intermediate which undergoes rearrangement producing ethanol, methyl acetate, acetone and methane. Simultaneously, the methanol adsorbed as a monodentate methoxy specie is dehydrogenated forming formates species that are decomposed in CO2 and H2

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriel Hector Fontana.pdf: 3326725 bytes, checksum: 0537b69671db327278e7294ee7cfec00 (MD5) Previous issue date: 2012-12-03 / Monitoring water quality in the inner Continental Shelf (CS) has shown to be costly when conventional methods are employed. Orbital Remote Sensing appears as an alternative tool to monitoring important variables such as sea surface temperature (SST) and suspended sediment concentration (SSC). This study aims at assessing spatial distribution of SST and SSC in the continental shelf area of the Brazilian State of Espírito Santo using, respectively, Band 2 (0.569μm) and Band 6 (11.435μm) data from Thematic Mapper (TM) sensor on board of satellite Landsat 5. Thus, a data bank was built out of 127 images pre-processed and registered by the TM sensor. Of these 127 images, only 4 were selected for SST and SSC analyses. During image pre-processing, geometric and reflectance corrections are made. Geometric correction is carried out based on a second image orthorectified so that there is correct georeferencing. Reflectance correction is performed using an atmospheric compensation model. Through this model, sea surface reflectance is obtained. SST is estimated based on the adjustment of Brightness Temperature (BT) derived from Band 6 with data from the Multi-scale Ultra-high Resolution Sea Surface Temperature (MURSST). In case of not enough sediment field data to carry out curve adjustment, SSC calculation is performed using the empirical logarithm algorithm proposed by Tassan (1987), which uses Band 2 data. The corrected reflectance spectrum is compared to TOA reflectance spectrum. The corrected spectrum complied with the literature on natural targets analyzed: cloud, vegetation, water and water with sediments. Landsat BT adjustment with SST of MURSST showed to be significant, according to statistical F-test and to r2 = 0.87. Results of the 4 scenes for SST and SSC fields. For winter SST, a more homogeneous temperature of ~23ºC is observed, whereas the summer scene is characterized by thermal contrasts between the area closer to the coast (~21ºC) and the area further from the coast (~26ºC). Further, hotspot plumes associated to the mouths of Jucu and Doce Rivers and Espírito Santo Bay are also verified. For the SSC fields, higher-concentration plumes are observed, which are advected southeast. The highest concentrations are associated to the Doce River (over 60 mg/L). SSC values comply with the values reported in the relevant literature, i.e. close to the coastal line, in the summer scene, values of ~15mg/L were verified. On the other hand, for autumn and winter scenes, these values are about ~35mg/L. Both atmospheric correction and SSC distribution values found in this study are according to the data and studies reported in the relevant literature. Therefore, we can conclude that the method employed showed to be functional to process the data gathered in this study / O monitoramento da qualidade da água nas regiões internas à Plataforma Continental (PC) apresenta-se dispendioso quando são usados métodos convencionais. O Sensoriamento Remoto Orbital apresenta-se como uma ferramenta alternativa ao monitoramento de variáveis importantes como a Temperatura da Superfície do Mar (TSM) e a Concentração de Sedimentos em Suspensão (CSS). Este trabalho tem como objetivo avaliar a distribuição espacial da TSM e da CSS na região da PC capixaba usando, respectivamente, os dados da Banda 2 (0,569μm) e da Banda 6 (11,435μm) do sensor Thematic Mapper (TM) abordo do satélite Landsat 5. Sendo assim, é construído um banco de dados a partir de 127 imagens pré-processadas e registradas pelo sensor TM, e destas imagens, 4 foram selecionadas para a análise dos campos de TSM e CSS. No pré-processamento é realizada a correção geométrica e a correção da reflectância. A correção geométrica é realizada tomando como referência uma segunda imagem ortoretificada para que haja um correto georreferenciamento. A correção da reflectância é feita utilizando um modelo de compensação atmosférica, e através desse modelo é obtida a reflectância superficial da água do mar. A TSM é estimada a partir do ajuste da Temperatura de Brilho (TB) derivada da Banda 6 com os dados do produto Multi-scale Ultra-high Resolution Sea Surface Temperature (MURSST). Na falta de dados de campo de sedimento para realizar o ajuste de curva, o cálculo da CSS é feito utilizando o algoritmo logarítmico empírico proposto por Tassan (1987) que usa os dados da Banda 2. O espectro da reflectância corrigida é comparado com o espectro da reflectância TOA. O espectro corrigido mostrou-se condizente com o da literatura para os alvos naturais analisados: nuvem, vegetação, água e água com sedimento. O ajuste da TB do Landsat com a TSM do MURSST apresentou-se significante, segundo a Estatística teste F e com um r2 = 0,87. Os resultados das 4 cenas para os campos de TSM e CSS. Para a TSM de inverno observa-se uma distribuição de temperatura mais homogênea de ~23ºC, enquanto a cena de verão é caracterizada por contrates térmicos entre a região junto da costa (~21ºC) e a região mais afastada (~26ºC). Além disso, verificam-se plumas térmicas associadas às desembocaduras de rios, Jucu e Doce, e à Baía do Espírito Santo. Para os campos de CSS são observadas plumas de maior concentração sendo advectadas para sudoeste, sendo as maiores concentrações associadas ao Rio Doce, acima de 60 mg/L. Os valores de CSS apresentam-se em concordância com os valores reportados na literatura, de forma que, próximo à linha de costa, na cena de verão, são observados valores de~15mg/L. Já para cenas de outono e inverno os valores são entorno de ~35mg/L. Ambos os resultados, de correção atmosférica e de distribuição da CSS, apresentam-se em conformidade com os dados e trabalhos da literatura e portanto, concluiu-se que o método utilizado se mostrou funcional para o processamento dos dados deste trabalho

Orientador: José Manoel Balthazar / Banca: Júlio Cesar Ruiz Claeyssen / Banca: Bento Rodrigues de Pontes Junior / Resumo: O propósito deste trabalho foi estudar as não linearidades na dinâmica de sistemas mecânicos e eletromecânicos. Entre eles inclui-se um corpo em levitação. As não linearidades levam o movimento da estrutura para o Efeito Sommerfeld. Por este fato, o trabalho do motor fica próximo ou na frequência de ressonância. Quando a estrutura atinge a condição de ressonância, a melhor parte da energia é consumida para gerar vibrações de grande amplitude sem nenhuma mudança sensível na frequência do motor. Neste trabalho, foi verificado o fenômeno para alguns sistemas não ideais inclusive o sistema com levitação magnética, discutindo uma forma de conduzir o sistema à condição de ressonância e evitar o "absorvedor de energia" que ocorre com o efeito Sommerfeld / Abstract: This paper studies the nonlinearities in dynamics of mechanics and electro mechanics non ideal systems. One of them is a magnetically levitated body. These nonlinearities lead the motion of the structure to the Sommerfeld Effect. For this reason the motor's near or in resonance frequency. When the structure achieves resonance condition, the best part of the energy is consumed to generate large amplitude vibration, with no sensitive change in the motor frequency. In this paper, is checked whether the phenomenon in some non ideal systems and also, if occurs with magnetic levitation. Will be discussed how to drive the system to ressonance condition and to avoid the "energy sink" that occurs with the Sommerfeld effect / Mestre

O TSPO (Translocator protein 18 KDa) é uma proteína intracelular localizada na membrana mitocondrial externa, mas também na membrana citoplasmática, e no núcleo. O TSPO está envolvido na biossíntese de esteroides, proliferação celular, apoptose, estresse oxidativo, e na modulação da inflamação, principalmente no sistema nervoso central, onde a proteína é considerada um marcador da neuroinflamação. Os neutrófilos representam células-chave no processo inflamatório sendo as primeiras células a chegarem no foco inflamatório onde exercem atividades fagocíticas, secretórias e microbicidas. O presente trabalho investigou os efeitos de diferentes ligantes de TSPO Diazepam, Ro5-4864 (agonistas parciais) e PK-11195 (antagonista) na ativação dos neutrófilos in vitro focando na via de ativação do Toll-like receptor (TLR) e de receptores transmembranas ligados a proteína G (GPCR). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BalbC machos quatro horas após injeção do glicogênio de ostra (1%), foram tratados in vitro com meio de cultura, veículo, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM), e estimulados ou não com Lipopolissacarídeo (LPS) ou Leucotrieno B4 (LTB4). Foram avaliados em condições basais e após estímulo: a expressão de TSPO e de moléculas de adesão por citometria de fluxo; a migração pelo ensaio de quimiotaxia em placa; a produção de citocinas e do óxido nítrico por ELISA e pela reação de Griess, respectivamente; e finalmente, a geração de espécies reativas de oxigênio por espectrofotômetro de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que o TSPO é expresso em neutrófilos em condições basais, e que os estímulos inflamatórios com LPS ou LTB4 não alteram essa expressão. Os ligantes de TSPO não afetam as funções de neutrófilos ativados pelo LPS, salvo a acentuação da geração de espécies reativas (ROS) observada com Ro5-4864 em células estimuladas com LPS. Os neutrófilos estimulados pelo LTB4, quando pré-tratados com os ligantes de TSPO, apresentaram redução na clivagem da L-selectina, redução de quimiotaxia, e indução da geração de ROS. Baseado nestes resultados e nos dados da literatura, concluímos que os efeitos dos ligantes de TSPO sobre as funções neutrofílicas concentram-se na expressão de moléculas de adesão, no estresse oxidativo e na migração. Estes efeitos dependem da via de ativação e do tipo celular. / TSPO (Translocator protein 18 kDa) is an intracellular protein located on the out mitochondrial membrane, but also on the cytoplasmatic membrane and in the nucleus. TSPO is involved in endogen steroids substances biosynthesis, cellular proliferation, apoptosis, oxidative stress and in the modulation of inflammatory process, principally in the central nervous system where the protein is a marker of neuroinflammation. Neutrophils are key-cells in the inflammatory process, being the first cell line that reach the inflammatory focus, where they realize their phagocytic, secretory and microbicidal activities. This study assessed the effects of TSPO ligands Diazepam, Ro5-4864 (partial agonists) and PK-11195 (antagonist) on in vitro neutrophils activation, focusing on the Toll-like receptor (TLR) and G protein coupled receptors (GPCRs) pathways. Neutrophils obtained from de peritoneal cavity of male BalbC mouse after four hours of Oyster glycogen injection (1%), were treated in vitro with culture medium, vehicle, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) or Leukotriene B4 (LTB4). We assessed in basal conditions and after stimulus:The TSPO and adhesion molecules proteic expression by flow cytometry; the migration by a plate chemotaxis assay; Nitric oxide and cytokines production by ELISA and the Griess reaction, respectively; and finally the reactive oxygen species generation by a fluorescence spectrophotometer. The results show that TSPO is expressed in neutrophils in basal conditions, and that inflammatory stimulus with LPS and LTB4 did not alter this expression. We also show that TSPO ligands did not affect neutrophil function activated by LPS. However, neutrophils stimulated by LTB4, when pre-treated with TSPO ligands shown a reduced L-selectina cleavage, chemotaxis reduction and induction of ROS generation. Based on these data and in literature data, we concluded that the effects of TSPO ligands in neutrophilic functions is concentrated on adhesion molecules expression, on oxidative stress and on the migration. These effects depend to the activation pathways and to the cellular type.

Proteins are synthesised as linear polymeric chains. The subtle energetic interplay of interatomic interactions results in chain folding, through which proteins may acquire defined structures. This spatial organisation is encoded by the protein sequence itself; the so-called thermodynamic hypothesis formulated by Anfinsen in 1961. A defined structure is often considered a pre-requisite to protein function, but widespread existence of intrinsically disordered proteins (IDPs) has prompted a re- evaluation of the ways biological function may be encoded into polypeptide chains. Furthermore, proteins often exist as part of multi-component entities, where regulation of assembly is integral to their properties. The interplay between disorder, oligomerisation and function is the focus of this thesis. Some IDPs fold conditionally upon interacting with a partner protein; a process known as coupled folding and binding. What are the biophysical advantages and consequences of disorder in the context of these interactions? A common feature of IDPs is their sequence composition bias, with charged residues being often over-represented. It is therefore tempting to speculate that electrostatic interactions may play a major role in coupled folding and binding reactions. Surprisingly, the opposite was found to be true. Charge-charge interactions only contributed about an order of magnitude to the association rate constants of two contrasting model systems. The lack of pre-formed binding interfaces-a consequence of disorder-might preclude electrostatic acceleration from complementary patches. By looking at the role of the sequence, many studies have taken a protein-centric approach to understanding disorder. Yet there is paucity of data about the effect of extrinsic factors on interactions involving disordered partners. Investigating the role of co-solutes, it was discovered that the kinetic and thermodynamic profiles of coupled folding and binding reactions were sensitive to ion-types. This effect followed the Hofmeister series, and occurred at physiological concentrations of salt. The sensitivity of coupled folding and binding reactions-a consequence of the lack of stability of IDPs-might be advantageous. Given the role of ions in biology, this 'biophysical sensing' could be a mechanism of physiological relevance, allowing modulation of protein-protein interactions involving disordered partners in response to changes in their environments. In cells, signalling networks are often multi-layered, and involve competing protein-protein interactions. The interplay between the biophysical characteristics of the components, and the behaviour of the network were investigated in a model tripartite system composed of folded and disordered proteins. The BCL-2 family regulates the intrinsic pathway of apoptosis through control of mitochondrial outer-membrane permeabilisation; a result of BAK and BAX oligomerisation. Through a shared homology motif (termed BH3), the subtle balance of their interactions determines cellular fate at the molecular level. Characterisation of the model under simple biochemical conditions revealed large differences in affinities among binary interactions; the consequence of the lifetime of the complexes, not their speed of association. A membrane-like environment, re-created using detergents, allows the oligomerisation of BAK and BAX in vitro. Furthermore, investigation of the tripartite system under detergent conditions showed that regulation of the network was the result of competing hetero- and homo-oligomerisation events. Relationships to their biophysical properties were gained by probing their energy landscapes using protein folding techniques. The connection between the biophysical properties of the components of the network and their interactions provides a molecular explanation for the regulation of apoptosis. This thesis offers insights into the ways structured assemblies and environmentally responsive disorder elements may encode functions into proteins.

[pt] Esse trabalho apresenta um modelo numérico para a análise de processos acoplados de efeitos mecânicos e escoamento bifásico em meios porosos fraturados, com a utilização de diferentes métodos numéricos combinados (Elementos finitos contínuos e descontínuos), e utilizando uma mesma malha de elementos finitos para representar uma célula de modelo de simulação de reservatório. As descontinuidades são inseridas na malha como elementos de nós duplicados colapsados. Empregam-se procedimentos numéricos desenvolvidos em dois grupos distintos. Um primeiro grupo de simulações trata de um procedimento numérico de escoamento bifásico, com ênfase à obtenção de um balanço de volumes verdadeiramente conservativo. Nesta fase, avalia-se uma formulação numérica que emprega um processo em três etapas: o método dos elementos finitos (EF), para a aproximação da equação da pressão; intermediariamente, utiliza-se o método de Raviart-Thomas de mais baixa ordem para aproximação da velocidade; e a aproximação da equação da saturação pelo método dos elementos finitos descontínuos (MEFD), que utiliza um limitador de inclinação multidimensional de modo a evitar oscilações na reconstrução dos dados de saturação. Para fins de validação da formulação desenvolvida, comparam-se os resultados obtidos com simulações utilizando o Método do Volumes Finitos (VF). O segundo grupo de simulações trata de acoplar o módulo mecânico (em EF) ao simulador de escoamento bifásico, de modo que a variação do estado de tensões, decorrente da explotação, seja considerada nas simulações. Essa análise permite uma melhor representação do fenômeno estudado além de proporcionar melhores resultados quanto à chegada da água nos poços produtores, afetando a produtividade do modelo. / [en] This work presents a numerical model for the analysis of coupled processes of mechanical effects and two-phase flow in fractured porous media using different numerical methods (continuous and discontinuous finite elements), and using the same finite element mesh to represent a cell of reservoir simulation model. The discontinuities are inserted into the mesh as elements of collapsed duplicate nodes. Numerical procedures developed in two distinct groups are used. A first group of simulations deals with a numerical two-phase flow procedure, with special emphasis on obtaining a truly conservative volume balance. At this stage, a numerical formulation using a three-step process is evaluated: The Finite Element Method (EF), for the approximation of the pressure equation; the lower order of Raviart-Thomas method is used to velocity approximation; and the approximation of the saturation equation by the discontinuous finite element method (MEFD), using a multidimensional slope limiter in order to avoid oscillations in the reconstruction of the saturation data. For the validation of the developed formulation, the results obtained are compared with simulations using the Finite Volume Method (VF), with focus on the analysis of the conservation of volumes. The second group of simulations couple the mechanical module (in EF) to twophase flow computer program, so the variation of the stress state, due to exploitation, is considered in the simulations. This analysis allows a better representation of the phenomenon. In addition to providing better results regarding the arrival of water in the producing wells, affecting the productivity of the model.

O TSPO (Translocator protein 18 KDa) é uma proteína intracelular localizada na membrana mitocondrial externa, mas também na membrana citoplasmática, e no núcleo. O TSPO está envolvido na biossíntese de esteroides, proliferação celular, apoptose, estresse oxidativo, e na modulação da inflamação, principalmente no sistema nervoso central, onde a proteína é considerada um marcador da neuroinflamação. Os neutrófilos representam células-chave no processo inflamatório sendo as primeiras células a chegarem no foco inflamatório onde exercem atividades fagocíticas, secretórias e microbicidas. O presente trabalho investigou os efeitos de diferentes ligantes de TSPO Diazepam, Ro5-4864 (agonistas parciais) e PK-11195 (antagonista) na ativação dos neutrófilos in vitro focando na via de ativação do Toll-like receptor (TLR) e de receptores transmembranas ligados a proteína G (GPCR). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BalbC machos quatro horas após injeção do glicogênio de ostra (1%), foram tratados in vitro com meio de cultura, veículo, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM), e estimulados ou não com Lipopolissacarídeo (LPS) ou Leucotrieno B4 (LTB4). Foram avaliados em condições basais e após estímulo: a expressão de TSPO e de moléculas de adesão por citometria de fluxo; a migração pelo ensaio de quimiotaxia em placa; a produção de citocinas e do óxido nítrico por ELISA e pela reação de Griess, respectivamente; e finalmente, a geração de espécies reativas de oxigênio por espectrofotômetro de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que o TSPO é expresso em neutrófilos em condições basais, e que os estímulos inflamatórios com LPS ou LTB4 não alteram essa expressão. Os ligantes de TSPO não afetam as funções de neutrófilos ativados pelo LPS, salvo a acentuação da geração de espécies reativas (ROS) observada com Ro5-4864 em células estimuladas com LPS. Os neutrófilos estimulados pelo LTB4, quando pré-tratados com os ligantes de TSPO, apresentaram redução na clivagem da L-selectina, redução de quimiotaxia, e indução da geração de ROS. Baseado nestes resultados e nos dados da literatura, concluímos que os efeitos dos ligantes de TSPO sobre as funções neutrofílicas concentram-se na expressão de moléculas de adesão, no estresse oxidativo e na migração. Estes efeitos dependem da via de ativação e do tipo celular. / TSPO (Translocator protein 18 kDa) is an intracellular protein located on the out mitochondrial membrane, but also on the cytoplasmatic membrane and in the nucleus. TSPO is involved in endogen steroids substances biosynthesis, cellular proliferation, apoptosis, oxidative stress and in the modulation of inflammatory process, principally in the central nervous system where the protein is a marker of neuroinflammation. Neutrophils are key-cells in the inflammatory process, being the first cell line that reach the inflammatory focus, where they realize their phagocytic, secretory and microbicidal activities. This study assessed the effects of TSPO ligands Diazepam, Ro5-4864 (partial agonists) and PK-11195 (antagonist) on in vitro neutrophils activation, focusing on the Toll-like receptor (TLR) and G protein coupled receptors (GPCRs) pathways. Neutrophils obtained from de peritoneal cavity of male BalbC mouse after four hours of Oyster glycogen injection (1%), were treated in vitro with culture medium, vehicle, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) or Leukotriene B4 (LTB4). We assessed in basal conditions and after stimulus:The TSPO and adhesion molecules proteic expression by flow cytometry; the migration by a plate chemotaxis assay; Nitric oxide and cytokines production by ELISA and the Griess reaction, respectively; and finally the reactive oxygen species generation by a fluorescence spectrophotometer. The results show that TSPO is expressed in neutrophils in basal conditions, and that inflammatory stimulus with LPS and LTB4 did not alter this expression. We also show that TSPO ligands did not affect neutrophil function activated by LPS. However, neutrophils stimulated by LTB4, when pre-treated with TSPO ligands shown a reduced L-selectina cleavage, chemotaxis reduction and induction of ROS generation. Based on these data and in literature data, we concluded that the effects of TSPO ligands in neutrophilic functions is concentrated on adhesion molecules expression, on oxidative stress and on the migration. These effects depend to the activation pathways and to the cellular type.

Introdução: A apneia do sono é condição prevalente e apresenta forte correlação com as principais causas de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. A perda do controle neuromotor proveniente de estágios mais profundos do sono está associada ao colapso faríngeo e a patogênese da apneia obstrutiva do sono (SAOS). A língua é implicada como principal protagonista na patogênese da obstrução das vias aéreas superiores (VAS) durante o sono. Não há farmacoterapia para SAOS. Novas tecnologias moleculares para controle neuronal através da inserção de um receptor de membrana geneticamente modificado, denominado Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs], o qual pode ser ativado por uma droga inicialmente inerte, de alta especificdade, clozapina-n-oxide (CNO). Objetivos: 1) Modificar geneticamente os neurônios motores do núcleo do hipoglosso utilizando-se de DREADDs, o qual permite regular sua atividade; 2) Analisar a atividade do músculo genioglosso sob administração de CNO; 3) Desenvolver abordagens para rastreamento dos músculos protrusores e retratores da língua por marcadores retrógrados, injecção de subunidade B de toxina colérica (CTB-AF) e do vírus de pseudoraiva (PRV) 267 transportando um gene repórter, nos músculos efetores. Métodos: Receptores muscarínicos mutados em um vetor adenoviral associado (AAV) foram infundidos no núcleo do hipoglosso de camundongos via injeção esterotáxica bilateral. Após quatro semanas, período para expressão fenotípica, foram comparadas a atividade eletromiográfica do músculo genioglosso (EMGGG) em resposta a administração de ligante (CNO) versus solução salina. Em um segundo grupo foram realizadas infusões com vírus controle e comparação da EMGGG pré e pós infusão de CNO. Para rastreamento neural a CTB-AF foi injetado nos músculos protusores e retratores da língua e para expressão de Cre o vírus PRV-267 foi injetado no músculo genioglosso. A expressão dessas substâncias no núcleo do hipoglosso foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Resultados: Dos dezoito camundongos injetados com DREADDs, dezesseis foram transfectados pelo vetor de AAV. Em camundongos onde o núcleo motor do hipoglosso foi corretamente atingido a EMGGG apresentou importante aumento após a administração de CNO. Em contraste, a atividade do genioglosso não apresentou alteração após a administração de soro fisiológico. Em três camundongos onde a transfecção ultrapassou os limites do núcleo foi observado arritmia respiratória após infusão do ligante. Todos animais infundidos com vírus controle foram adequadamente transfectados mas não apresentaram alteração eletromiográfica após a infusão de CNO. Foram diferenciados no núcleo do hipoglosso os neurônios motores da musculatura retratora e protusora da língua. A expressão intranuclear da enzima Cre-recombinase foi identificada no núcleo hipoglosso. Conclusão: A utilização de métodos quimiogenéticos para ativar grupos selecionados de neurônios motores em áreas cerebrais específicas representa técnica promissora para o estudo do controle neuromotor das VAS. Estes resultados sugerem que a terapia transgênica pode ser eficaz no tratamento da SAOS além de uma vasta gama de patologias que resultam de perturbações no controle neural das VAS. Através da manipulação das fibras musculares efetoras na língua foi possível a identificação do seu respectivo neurônio motor no núcleo do hipoglosso e induzi-lo a sintetizar uma enzima específica (Cre-recombinase) / Introduction: Sleep Apnea is a prevalent condition and strongly correlates with the major causes of morbidity and mortality in Western Society. The loss of motor input from deeper sleep stages is associated with pharyngeal collapsibility and the pathogenesis of obstructive sleep apnea (OSA). The tongue plays a major role in the pathogenesis of upper airway (UA) obstruction during sleep. There is no pharmacotherapy for OSA. New molecular techniques allow to control neuronal function by inserting a genetically modified membrane receptor termed the Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs] which can be activated by a highly specific and otherwise pharmacologically inert drug clozapine-N-oxide (CNO) Objectives: 1) To genetically modify the hypoglossal nucleus motor neurons using DREADDs, which allows to regulate their activity; 2) To analyze the genioglossal activity upon administration of CNO; 3) to develop novel approaches to targeting tongue protruders and retractors by retrograde tracers, cholera toxin subunit B (CTB-AF) and pseudorabies virus (PRV) 267 injection carrying a reporter gene into the effector muscles. Methods: Mutated muscarinic receptors in an adenoviral associated vector (AAV) were delivered to the hypoglossal nucleus via stereotactically bilateral injection. Four weeks after adenoviral delivery (expression period), responses in genioglossal electromyography (EMGGG) activity to intraperitoneal administration of CNO ligand vs. Saline (control) were compared in mice. In a second group, control-virus was infused and genioglossus muscle EMGGG was compared before and after CNO infusion. For neuronal tracing CTB-AF was injected into the protrusor and retractor muscles of the tongue and for Cre induction PRV-267 virus was injected in the genioglossus muscle. Expression of these substances in the hypoglossal nucleus were evaluated by fluorescence histology. Results: Of eighteen DREADDs injected mice, sixteen were transfected with AAV vector. After CNO administration EMGGG activity increased in mice where the hypoglossal motor nucleus was correctly targeted. In contrast, genioglossal activity was not augmented following saline administration. In three mice where transfection surpassed the nucleus limits, breathing arrhythmia was observed following ligand infusion. All animals infused with control virus were adequately transfected but did not present electromyographic change following CNO infusion. The motor neurons of the rectractor and protrusor musculature of the tongue were well differentiated in the hypoglossal nucleus. Intranuclear expression of Cre recombinase enzyme was identified in the hypoglossal nucleus. Conclusion: Utilizing chemogenetic methods to activate motor neuron groups in selected brain areas show promise to UA neuromotor control, and suggest that transgenic therapy may be effective in treating OSA and a wide range of pathologies that result in disturbances of UA neural control. By manipulating the effector muscle fibers of the tongue, it was possible to identify its respective motor neuron in the hypoglossal nucleus and to induce synthesis of a specific enzyme (Cre recombinase)