Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales) / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo / Los objetivos perseguidos en la presente memoria, apuntan a demostrar que es posible aceptar los procesos de criopreservación de gametos, pronúcleos, y embriones, no solo porque representa una realidad en muchas partes del mundo. Si fuera ese el argumento para aceptarla, sería lo mismo que no dar fundamento alguno. Entonces, lo primero que debemos lograr, es demostrar que nuestro ordenamiento jurídico, debe dar acogida a los procesos antes referidos. Para ello, deberemos preocuparnos de manera previa, de la naturaleza jurídica de gametos, pronúcleos, y embriones. Nuestro análisis apuntará a dejar en evidencia, que de las células mencionadas, solamente los embriones, ya implantados en las paredes del útero de una mujer, podrán tener conocimiento legal, como si se tratase de personas, o al menos de una que está por nacer. Antes de ese momento, consideramos que el tratamiento, y por ende el tutelaje del que pueden ser merecedores, será más cercano al otorgado a las cosas.

Trabajo final del curso de informática para las ciencias de la salud

Actualmente se han desarrollado trabajos sobre la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca, demostrando disminución en los parámetros de viabilidad, motilidad e integridad de la membrana plasmática luego del proceso de descongelación, debido principalmente a especies de oxígeno reactivas producidas durante el proceso de congelamiento. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la criopreservación sobre las proteínas antioxidantes GPX1 y GPX4 de espermatozoides del epidídimo de alpaca, usamos muestras (n: 30) de espermatozoides provenientes de la cola del epidídimo, se usó un método de congelamiento lento usando dimetilacetamida (0,375 M) como agente crioprotector, analizamos los parámetros de la motilidad, viabilidad e integridad de la membrana plasmática antes y después del proceso de congelamiento; así mismo evaluamos los extractos de proteínas de espermatozoides antes y después del congelamiento para evaluar el estado de estas proteínas mediante Western blott, la evaluación de la localización intracelular de estas proteínas se realizó mediante la técnica de inmunofluorescencia. Se usó la técnica de RT-PCR-RT para evaluar el nivel de expresión del gen GPX4 en biopsias de tejido testicular. Los resultados mostraron una disminución en los porcentajes de los parámetros de viabilidad, motilidad e integridad de la membrana plasmática luego del proceso de congelamiento, la localización intracelular de las proteínas GPx1 (cabeza del espermatozoide) y GPx4 (flagelo del espermatozoide) muestran los principales lugares de acción de estas proteínas, por Western blot obtuvimos bandas de peso molecular variado para GPx1 (formas inactivas de la proteína) y bandas de peso molecular de 27kDa para GPx4 (forma activa); obtuvimos una relación significativa positiva y débil entre el nivel de expresión molecular del gen GPx4 y la motilidad pre y post congelamiento. La ubicación de las proteínas GPx1 y GPx4 demuestra sus funciones de protección del espermatozoide de alpaca, la cual no se vio afectada por el proceso de criopreservación, pero el estado (forma activa) de la proteína GPx1 si se vio afectada. Existe una relación positiva significativa (p<0.01) entre el nivel de expresión relativa del gen GPx4 respecto a la movilidad espermática. Palabras clave: Alpaca, criopreservación, espermatozoides, glutatión peroxidasa / --- Currently works about cryopreservation of epididymal alpaca sperm have been developed, showing decrease of the parameters of viability, motility and plasma membrane integrity after thawing process, mainly due to reactive oxygen species produced during cooling process. The aim of this study was to evaluate the effect of cryopreservation over the antioxidant proteins GPx1 and GPx4 from epididymal alpaca sperm. We used samples (n:30) of sperm obtained from the cauda of epididymis, and a slow freezing process with dimethylacetamide (0.375M) as a cryoprotectant agent. It was analyzed the parameters of motility, viability and integrity of plasma membrane before and after cooling process; the protein extracts from sperm was evaluated before and after cooling to examine the state of this protein by western blott technique; the intracellular localization of this proteins was done by immunofluorescence technique, the expression level of gene Gpx4 in testicular tissue biopsies was quantified by RT-PCR-RT. The results showed a decrease in the percentage of viability, motility and plasma membrane integrity after thawing process; the intracellular localization of GPx1 and GPx4 were identified in regions such as the head (GPx1) and flagellum (GPx4) of sperm, by western blot we got bands of GPx1 inactive forms of the protein and the active form of GPx4 (27 kDa); It was obtained a significant positive relationship between the level of molecular gene expression of GPx4 and motility before and after cooling process The location of proteins GPx1 and GPx4 demonstrate its functions of protection of alpaca sperm, which was not altered by the cryopreservation process, but the state (active form) of protein GPx1 was affected. There is a positive weak correlation between the level of GPx4 gene relative expression with sperm motility. Key words: Alpaca, cryopreservation, spermatozoa, glutation peroxidase. / Tesis

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de dos métodos de riopreservación sobre la sobrevivencia in Vivo e in Vitro de embriones de llama. Setenta y tres embriones en estadío de blastocisto eclosionado fueron recuperados no quirúrgicamente al día 6.5 después de la monta de llamas tratadas con 1000 UI de eCG, y fueron distribuidos aleatoriamente a cada uno de los 3 grupos experimentales: Control (n=14), Vitrificación (n=30) y congelación lenta (n=29). Vitrificación: / The aim of the present study was to evaluate the effect of two cryopreservation methods on the llama embryo in Vivo and in vitro survival. Seventy three hatched blastocysts were collected non-surgically at day 6.5 after mating from llamas treated with 1000 IU eCG, and were randomly allocated to each one of three experimental groups: Control (n=14), Vitrification (n=30) and slow freezing (n=29). Vitrification

La inseminación artificial es una de las tecnologías que han contribuido al progreso genético en diversas especies domesticas de interés económico; sin embargo, la información sobre la colección, características, evaluación y conservación del semen en la alpaca sigue siendo insuficiente. Una de las principales limitantes es la gran viscosidad que presenta el eyaculado, por lo que se requiere evaluar métodos que contribuyan a la licuefacción del semen fresco, someterlo a un protocolo de criopreservación y relacionarlo con la calidad espermática post congelamiento. Para el presente estudio, se utilizó 4 alpacas machos adultos entrenados para la colección de semen por vagina artificial. Se realizó la colección una vez a la semana por 6 semanas hasta un total de 24 muestras. Cada muestra fue evaluada en fresco e inmediatamente se dividió en dos fracciones iguales y se les agregó un dilutor comercial. Cada fracción fue sometida a un esquema diferente en el tratamiento del semen: una fracción (A) fue sometida a la acción mecánica mediante pasajes por una aguja nº 18 y la otra fracción (B) fue sometida a agitación manual. Luego, ambas fracciones fueron centrifugadas a 802 g x 10 minutos. Cumplido el proceso, se retiró el sobrenadante y el pellet fue reconstituido con el dilutor comercial y se sometió a un descenso de la temperatura hasta 5°C y una reevaluación del semen. Posteriormente, se procedió a colocar el semen en pajuelas de 0.5 ml y fueron expuestas al vapor del nitrógeno líquido para luego ser almacenadas en el tanque. Después de 7 días de almacenamiento, las pajillas fueron descongeladas en agua a 37°C por un minutoy se realizaron las respectivas evaluaciones. En los resultados obtenidos post congelación, entre los tratamientos A y B con respecto al porcentaje de motilidad no se halló diferencias estadísticamente significativas entre los dos tratamientos (K-Wkallis:1.67; p>0.05). En relación al porcentaje de espermatozoides vivos, porcentaje de espermatozoides positivos al test de endosmosis (HOST) y al porcentaje de espermatozoides normales tampoco se encontró diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (ANVA, p>0.05). / An important biotechnology with a great impact on the genetic improvement in domestic species is the develop of Artificial Insemination (AI). However, information on the collection, characteristics, evaluation and preservation of semen from the alpaca is still insufficient. The highly viscous nature of camelid semen represents a further challenge to the development of AI technology, which requires evaluation methods that contribute to liquefaction, submit to a cryopreservation protocol and study sperm quality post-thaw. For the present study, 4 male adult alpacas were trained for collection with artificial vagina. Semen collection was performed once a week for 6 weeks for a total of 24 samples. Each sample was assessed for quality parameters in fresh and immediately split into two equal fractions and were added a commercial dilutor. Each fraction was exposed to a different treatment of semen: a fraction (A) was submitted to the mechanical action by passages through a needle N°18 (needling) and the other fraction (B) was submitted to manual shaking. Then, both fractions were centrifuged at 802 × 10 minutes. Completed the process, the supernatant was removed and the pellet was reconstituted with commercial dilutor to be submitted to a temperature drop to 5 ° C and a reassessment of the semen. Then, 0.5 ml straws were loaded with the final dilution and they exposed to liquid nitrogen vapor before they were storaged in the tank. After 7 days, the straws were thawed in water at 37°Cfor a minute to be tested.The results obtained after post-thawed between treatment A (needle passages) and B (hand shaking) for percent motility no statistically significant difference between the two treatments (K-Wkallis: 1.67; p> 0.05) was found. In relation to the percentage of live sperm, percentage of sperm to test positive endosmosis (HOST) and the percentage of normal sperm was not statistically significant differences between treatments (ANOVA, p> 0.05). Keywords: alpaca, cryopreservation, needling, shaking, centrifugation

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de dos métodos de riopreservación sobre la sobrevivencia in Vivo e in Vitro de embriones de llama. Setenta y tres embriones en estadío de blastocisto eclosionado fueron recuperados no quirúrgicamente al día 6.5 después de la monta de llamas tratadas con 1000 UI de eCG, y fueron distribuidos aleatoriamente a cada uno de los 3 grupos experimentales: Control (n=14), Vitrificación (n=30) y congelación lenta (n=29). Vitrificación: / The aim of the present study was to evaluate the effect of two cryopreservation methods on the llama embryo in Vivo and in vitro survival. Seventy three hatched blastocysts were collected non-surgically at day 6.5 after mating from llamas treated with 1000 IU eCG, and were randomly allocated to each one of three experimental groups: Control (n=14), Vitrification (n=30) and slow freezing (n=29). Vitrification

El objetivo de esta tesis fue optimizar un protocolo de refrigeración y uno de congelación de semen canino para implementarlos en Argentina. Se realizaron 4 experimentos.

Magíster en ciencias biológicas y médicas mención biología celular / El tejido adiposo cumple distintas funciones tales como protección mecánica, reserva de energía, función endocrina, etc. Durante los últimos años se ha documentado su uso como fuente abundante y accesible de células estromales multipotenciales para medicina regenerativa. Actualmente, el protocolo estandarizado comprende el procesamiento del tejido adiposo con una digestión enzimática (colagenasa) para posteriormente rescatar la fracción vascular estromal (SVF). Ésta se siembra en una matriz de plástico apta para cultivos celulares, obteniéndose un subgrupo de células elongadas que comienzan a adherirse a la placa de cultivo (SVF-AC), permitiendo la aparición de una población celular adherente denominada “células estromales derivadas del tejido adiposo”. Diversos estudios han demostrado que éstas mantienen su capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares (endo, meso y ectodérmico), siendo candidatas adecuadas para muchas aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Sin embargo, una de las limitantes para la aplicación clínica de estas células, es contar con una masa celular critica que permita un adecuado tratamiento. Ante ello, surge la interrogante de cómo criopreservarlas, manteniendo a su vez, la viabilidad y el potencial de diferenciación luego de un ciclo de congelación. El uso de compuestos que tengan propiedades criopreservantes ha mostrado ser un prerrequisito para el éxito de un proceso de congelación. Idealmente, un medio para criopreservar SVF-AC debe tener una baja toxicidad y lograr una alta viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciación. En nuestro laboratorio, luego de criopreservar SVF-AC utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) 10%, no logramos obtener tasas de viabilidad descritas en la literatura. Nuestra hipótesis es que una combinación de un medio basal (medio DMEM/F12 con rojo fenol) suplementado con DMSO, trehalosa y albúmina humana puede mejorar significativamente las tasas de recuperación celular post criopreservación, en comparación con medios que utilizan sólo DMSO. En el presente trabajo, medimos la tasa de viabilidad celular post criopreservación de SVF-AC obtenidas de 5 pacientes utilizando medios definidos y libres de suero bovino: DMSO 10%; DMSO 10% + Trehalosa 7,6%; DMSO 10% + Albúmina humana 10% y DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina humana 10%; mediante ensayo metabólico midiendo absorbancia (MTT) e indeminidad de membranas cuantificado por citometría de flujo con ioduro de propidio (PI). Los resultados obtenidos nos demuestran que no existen diferencias estadísticamente significativas en las tasas de viabilidad de SVF-AC posterior a un ciclo de criopreservación a diferentes niveles, desde el punto de vista metabólico con el ensayo de MTT, y a nivel de estructura de membrana por marcación de PI por citometría de flujo. Sin embargo, se observa una tendencia a mejorar la tasa de recuperación de células vitales al agregar albúmina humana. Por otro lado no se lograron obtener tasas de viabilidad tan altas como las reportadas por otros autores. Se discuten las posibles causas y se proponen alternativas para estudiarlas. En conclusión, podemos decir que no existe ninguna condición estudiada que sea superior a las demás en cuanto a rendimiento. Es así como en respuesta a la hipótesis de trabajo podemos afirmar que la criopreservación de las SVF-AC en un medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina humana 10% no logra una tasa de recuperación de células vitales significativamente mayor que aquellas congeladas sólo con DMSO 10%. / Adipose tissue has different functions such as mechanical protection, energy reserve, endocrine function, etc. In recent years has been documented it use as abundant and accessible source of multipotent stromal cells for regenerative medicine. Currently, a standardized protocol comprises processing adipose tissue with enzymatic digestion (collagenase) and then rescue the stromal vascular fraction (SVF). This is sown in a plastic matrix suitable for cell cultures to yield a subset of elongated cells to adhere to the culture plate (SVF-AC), allowing the appearance of an adherent cell population called "stromal cells derived from adipose tissue". Several studies have shown that they maintain their ability to differentiate into multiple cell types (endo, meso and ectodermal), being suitable candidates for many applications in regenerative medicine and tissue engineering. However, one of the limitations for the clinical application of these cells is to have a critical cell number to provide an adequate treatment. In response, the question is how to cryopreservate them, while maintaining the viability and differentiation potential after a freeze cycle. Use of compounds with cryoprotective properties have shown to be a prerequisite for the success of a freezing process. Ideally, a cryoprotectant for SVF-AC must have low toxicity and achieve high cell viability without decreasing the differentiation potential. In our laboratory, after SVF-AC cryopreservation using 10% dimethyl-sulfoxide (DMSO) it is unable for us to obtain the viability rates reported in the literature. Our hypothesis is that a combination of a basal medium (DMEM / F12 medium with phenol red) supplemented with DMSO, trehalose and human albumin, can significantly improve cell recovery rates after cryopreservation compared to using only DMSO. In this study, we measured the rate of cell viability after cryopreservation of SVF-AC obtained from 5 patients using a defined and serum-free medium: 10% DMSO; 10% DMSO + 7.6% Trehalose; 10% DMSO + 10% human albumin and 10% DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin; by measuring absorbance with a metabolic assay (MTT) and membrane indemnity quantified by flow cytometry with propidium iodide (PI). The results show us that there are no statistically significant differences in rates of SVF-AC viability after a cryopreservation cycle at different levels, from a metabolic point of view with the MTT assay, and membrane structure level with IP by flow cytometry. However, a tendency is observed to improve the recovery rate of vital cells by adding human albumin. On the other hand we could not get viability rates as high as those reported by other authors. Possible causes are discussed and proposed alternatives for study. In conclusion, we can say that there were not a studied condition better than others in terms of efficiency. Thus, in response to the working hypothesis we can say that the cryopreservation of the SVF-AC in a medium that combines DMEM / F12 with 10% DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin fails in obtaining a significantly higher recovery rate of vital cells than those frozen with only 10% DMSO.

La logística de un Trasplante de Progenitores Hematopoyéticos (TPH) incluye en la mayoría de casos (TPH autólogo y de Sangre de Cordón Umbilical (SCU)), una etapa de criopreservación a temperaturas de -196ºC. Las técnicas de congelación más extendidas utilizan DMSO como crioprotector para optimizar la viabilidad y funcionalidad de las células reduciendo la proporción de agua congelada y la deshidratación intracelular durante el proceso de congelación.La presencia del crioprotector hace que las suspensiones celulares descongeladas sean hipertónicas y como las células responden importando y exportando agua frente a un cambio de osmolaridad, el retorno a condiciones isotónicas puede resultar en la superación de los límites mecánicos de las membranas plasmáticas por una entrada masiva de agua al citoplasma (choque osmótico). Este fenómeno es de especial importancia durante la reconstitución y manipulación de células descongeladas debido a que la membrana celular es un conjunto de lípidos y proteínas organizados que por debajo de los 20ºC pierde fluidez, limitando su resistencia y por tanto su capacidad de respuesta osmótica.En 1978, el profesor John Goldman95 publicó las primeras evidencias del fenómeno de choque osmótico sobre la reducción de capacidad clonogénica en médula ósea (MO) descongelada. Sin embargo, este trabajo no ha tenido una gran repercusión en los protocolos de criopreservación seguramente porque el número de Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) en MO y en Aféresis (CPH-A) está por encima del umbral mínimo definido para uso clínico. Esta situación cambia en el momento que la SCU se define como fuente de células progenitoras debido a su limitada proporción en estos productos. Así, en 1995 el Dr. Pablo Rubinstein139 reabre el debate de la relevancia del choque osmótico en productos hematopoyéticos descongelados e introduce la estabilidad osmótica previa a la infusión para reducir el efecto del cambio brusco de osmolaridad durante el retorno a condiciones isotónicas.Para la práctica diaria de un laboratorio de procesamiento celular, y por extensión para el equipo clínico de trasplante, el choque osmótico afecta a los controles de calidad del descongelado si estos incluyen manipulaciones que impliquen cambios bruscos de osmolaridad. En este sentido, un caso muy llamativo es el de la citometría de flujo (CMF), no en vano, casi ningún laboratorio realiza este tipo de análisis en muestras descongeladas debido seguramente a la falta de correlación con los datos precongelación.Más alarmante es el hecho de que la infusión directa de los inóculos descongelados pueda ser también una fuente de choque osmótico que comprometa la viabilidad celular resultando, en el caso de TPH con dosis límite de CPH, determinante para el éxito de la recuperación hematopoyética.En este ámbito se ha desarrollado el trabajo experimental de esta Tesis Doctoral que proporciona evidencias, cuantifica el efecto del choque osmótico en los controles de calidad de productos hematopoyéticos descongelados, propone un método de CMF para su análisis y valida dos sistemas automáticos aptos para la clínica que rinden productos estabilizados osmóticamente, listos para trasplante y sin pérdida celular ni de viabilidad significativas. / Current logistics of Hemopoetic Progenitor Cells Transplant (HPT) usually includes (Autologous HPT and Umbilical Cord Blood Cells (UCB) Transplant) a cryopreservation step at temperatures of -196ºC. Dimethyl sulfoxide, the most used cryoprotector raises cellular viability and function both by reducing frozen water proportion as well as intracellular dehydration during the freezing process of cells.Presence of cryoprotector makes thawed cellular suspension hypertonic and as cells respond importing and exporting water from their cytoplasm in front of changes of osmolarity, the return to isotonic conditions may surpass the mechanical limits of plasmatic membranes by means of a massive entry of water into the cytoplasm (osmotic shock).This is specially important during the reconstitution and manipulation of thawed cells because cell membrane is a set of organized lipids and proteins that below of 20ºC loose fluidity thus limiting resistance and so capacity of response in front of an osmotic shock.In 1978, first evidences about the reduced clonogenicity in thawed cells from Bone Marrow (BM) were published by professor John Goldman. However, these results have not had great repercussion on cryopreservation protocols possibly because the huge number of progenitor cells in BM and Apheresis (HPC-A). This situation changes when UCB is defined as a suitable source of progenitor cells due to the limited number of cells in these products. In this regard, Dr. Pablo Rubinstein reopens in 1995 the debate about the relevance of osmotic shock in thawed progenitor cells grafts. In that work, osmotic stability before infusion was introduced to reduce deleterious effect of sudden changes in osmolarity during the return to isotonic conditions.Considering Cell Processing laboratories current practices, osmotic shock concerns quality controls of thawed cells when sudden changes in osmolarity are included in these techniques. It is specially relevant when Flow Cytometry is considered because almost no laboratory uses this technique to analyze thawed samples because of the lack of correlation with pre freeze data.In addition, direct infusion of thawed grafts could be a source of osmotic shock altering cells viability which, in case of limiting number of progenitor cells in the graft, could affect hemopoètic recovery of the transplanted patient.In this field has been developed the experimental of the present Doctoral Thesis which provides evidences and quantify the effect of the osmotic shock in quality controls of thawed hemopoetic grafts as well as proposes a method of Flow Cytometry to analyze them. Finally, in this work two automatic systems available for the clinic were validated to wash DMSO and producing osmotically stabilized products without significant looses of viability and progenitor cells.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La adecuada interacción de los gametos depende de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la capacitación y reacción acrosómica, procesos esenciales para la fecundación del ovocito y que pueden verse afectados por el proceso de refrigeración espermática. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides refrigerados de perro, a través de la capacidad de unión y penetración a la zona pelúcida de ovocitos de perra madurados in vitro. El semen se obtuvo de la estimulación digital a 5 perros adultos. Un total de 9 eyaculados provenientes de los mismos perros, fueron procesados como muestras frescas o refrigeradas. Posterior a la evaluación seminal, el plasma seminal fue retirado por centrifugación. Los espermatozoides frescos se resuspendieron inmediatamente en Fert Talp y los espermatozoides a refrigerar se resuspendieron en diluyente en base a TRIS - yema de huevo - ácido cítrico - fructuosa y se conservaron a 4ºC por 24 horas, para luego ser mantenidos a 37°C por 10 minutos y posteriormente centrifugados para retirar el diluyente. Luego, los espermatozoides frescos (control) y refrigerados, fueron incubados en Fert Talp para capacitación in vitro, a temperatura ambiente (20°C) durante 0 a 3 horas y, posterior a cada tiempo de incubación, co-incubados con ovocitos madurados in vitro. Posterior a la co-incubación, los ovocitos inseminados fueron lavados y luego procesados separadamente para ser examinados bajo microscopia electrónica de barrido (MEB) y microscopia de epifluorescencia. Para MEB, se evaluaron un total de 318 ovocitos (174 y 134 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente). El análisis de MEB consideró un ovocito con espermatozoides unidos cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides adheridos a la zona pelúcida ovocitaria (ZP), y un ovocito con espermatozoides penetrados cuando se encontraron uno o más espermatozoides atravesando la ZP. Para la microscopia de epifluorescencia se evaluaron un total de 466 ovocitos (219 y 247 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente), considerando un ovocito con espermatozoides unidos cuando se encontraron uno o más espermatozoides adheridos a la ZP y ovocito con epermatozoides penetrados cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides atravesando la ZP, en el espacio perivitelino o dentro del citoplasma ovular. Los resultados se analizaron mediante un procedimiento de Regresión Logística Binomial (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA). Tanto en MEB como en microscopia de epifluorescencia, los resultados de fecundación in vitro con espermatozoides frescos y refrigerados, no mostraron diferencias significativas en la unión ni en la penetración espermática (p≥0,05), a través de los diferentes tiempos de capacitación. Asimismo, al comparar entre ambos tipos de espermatozoides, la unión y penetración en los diferentes tiempos de capacitación, no se evidenciaron diferencias significativas entre ellos (p≥0,05). En conclusión, los espermatozoides frescos y refrigerados caninos, capacitados in vitro durante 0 a 3 horas, no difieren en su capacidad para unirse y penetrar la ZP de ovocitos de perra madurados in vitro / Proyecto Fondecyt 1060602