Resumo não disponível.

Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.

A criptococose acomete pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com a resposta imune mediada por células T debilitada, sendo portanto, suscetíveis a patógenos oportunistas. C. neoformans possui um repertório de fatores de virulência que permitem o estabelecimento da infecção e sua disseminação para o sistema nervoso central, causando meningoencefalite. O tratamento da criptococose é baseado apenas na utilização prolongada de antifúngicos e provoca muitos efeitos colaterais nos pacientes. Por estes motivos, novas terapias estão sendo abordadas, com o intuito de promover a ativação do sistema imune do hospedeiro para debelar a infecção. Para que tais terapias possam ser desenvolvidas se faz necessário identificar moléculas que estimulem a resposta imune celular. Proteínas de choque térmico de patógenos têm sido utilizadas como alvo no tratamento de muitas doenças infecciosas em seres humanos. Estas proteínas estimulam a resposta imune mediada por células T e apresentam resultados promissores em tratamentos contra infecções fúngicas. Da mesma forma, proteínas que fazem parte do sistema de defesa antioxidante, como as catalases, por exemplo, desempenham um papel importante no combate a radicais livres produzidos pelo hospedeiro e parecem ter outras funções no processo da infecção. O entendimento da biologia destas proteínas bem como a sua participação na interação com células do sistema imune do hospedeiro é fundamental para a validação da sua aplicabilidade no tratamento da criptococose. Nesse contexto, apresentamos aqui um estudo das funções biológicas de uma das proteínas de choque térmico (Hsp70) e de uma das enzimas envolvidas na detoxificação de espécies reativas de oxigênio (catalase 2) do fungo C. neoformans. Também foram avaliados os efeitos terapêuticos destas proteínas no tratamento da criptococose. Demonstramos que a proteína Hsp70 de C. neoformans está localizada na cápsula polissacarídica, sendo importante no processo de adesão da levedura a células epiteliais A549. Demonstramos também que Cn_rHsp70 co-localiza com o principal componente da cápsula polissacarídica a glucuronoxilomanana (GXM) na superfície de macrófagos. A Cn_rHsp70 quando em contato com células do fungo, diminui sua viabilidade celular e não altera o tamanho da cápsula, mas interfere na secreção de GXM. Em relação à catalase 2, foi demonstrado que a proteína é localizada na parede celular do fungo e possui atividade de degradação de peróxido de hidrogênio quando associada à superfície celular. Em ensaios de infecção experimental em animais imunizados com construções de DNA contendo as sequências de Hsp70 e catalase 2, nenhuma das proteínas conferiu proteção, mas ocorreu estímulo da resposta mediada por células Th1 e Th2. O mecanismo pelo qual estas proteínas estimulam o sistema imune ainda precisa ser elucidado. / Cryptococcus neoformans affects immunocompromised patients, especially patients with impaired T cell-mediated immune response, and therefore are susceptible to opportunistic pathogens. C. neoformans has a repertoire of virulence factors that allows the establishment and dissemination of the infection in the central nervous system, causing meningoencephalitis. The virulence factors of Cryptococcus has been subject of many studies that have showed the involvement of gene products in the infection process. However, the treatment of cryptococcal meningoencephalitis consists of antifungal therapy and displays many side effects. For these reasons, new therapies are being addressed, in order to promote the activation of the host immune system to overcome the infection. To develop these therapies, it is necessary to identify molecules that stimulate cell-mediated immune response. Heat shock proteins from many pathogens have been used as a target for the treatment of many humans infectious diseases. These proteins stimulate the T cell-mediated immune response and show promising results in treatment against fungal infections. Similarly, proteins from antioxidant system such as catalase for example, play an important role against free radicals produced by the host and appear to have other functions in the infection process. The understanding of these proteins biology and their involvement with host immune system cells is essential for the validation of its applicability in the treatment of cryptococcosis. In this context, we present here a study of the biological function of a heat shock protein (Hsp70) and one of the enzymes involved in detoxification of reactive oxygen species (catalase 2) of the fungus C. neoformans. We evaluated the therapeutic effects of these proteins in the treatment of cryptococcosis. We have demonstrated that the protein Hsp70 from C. neoformans is located in the polysaccharide capsule, and it is important in the adhesion process of the yeast to epithelial cells A549. Also demonstrated that Cn_rHsp70 co-localizes with the main component of the polysaccharide capsule, glucuronoxilomanana (GXM), on the surface of macrophages. When Cn_rHsp70 are in contact with fungal cells, the cellular viability decreased and does not change the capsule size however, interferes with the GXM secretion. Catalase 2 is deposited on the fungal cell wall and showed activity by hydrogen peroxide degradation. In vivo experiments using animals infected and treated with Hsp70 DNA vaccines and catalase 2, no protection were observed, but there are immune response mediated by Th1 and Th2 cells. The mechanism by which these proteins stimulate the immune system has yet to be elucidated.

O complexo Cryptococcus possui 37 espécies descritas, das quais se destacam C. neoformans e C. gattii devido a sua capacidade de causar doença tanto em humanos como animais. A fim de se prevenir de organismos patogênicos, o hospedeiro pode reduzir a disponibilidade de nutrientes em um processo conhecido como imunidade nutricional. Além disso, é bem descrito o papel central de metais essenciais em relação à expressão dos fatores de virulência nas espécies patogênicas do gênero Cryptococcus. MicroRNAs (miRNAs) são importantes mediadores da expressão gênica em resposta a estresses, incluindo privação de metais ou toxicidade causada pelos mesmos. Entretanto, pouco é conhecido sobre expressão de miRNAs ou miRNAs-like em C. gattii. Portanto, o objetivo desde trabalho foi determinar o perfil miRNAs ou miRNAs-like produzidos por C. gattii durante privação de ferro e privação de zinco. Células de C. gattii R265 foram cultivadas em três condições: privação de zinco, privação de ferro e condição controle. As sequências dos pequenos RNAs foram obtidas por RNA-Seq. A fim de identificar miRNAs em C. gattii, as sequências não redundantes foram alinhadas às sequências dos genomas das linhagens de C. gattii R265 e WM276. Foi realizada a predição de miRNAs ou microRNA-like com ferramentas de bioinformática que resultou em 31 possíveis miRNAs na linhagem R265 e 26 na linhagem WM276, respectivamente. Análises in silico da expressão diferencial dos miRNAs mostraram que a maioria está presente nas três condições, ao passo que apenas dois estão presentes apenas nas condições de privação de metais. Desta forma, estes miRNAs-like podem estar exercendo algum papel importante na homeostase de metais em resposta a condições que mimetizam o ambiente de infecção. Visto que a linhagem R265 de C. gattii não possui um gene codificador da proteína Argonauta, a qual desempenha um papel central na via de RNA de interferência (RNAi), esta via possivelmente não seria responsável pelo silenciamento de outros genes. Levanta-se a hipótese que estes miRNAs-like poderiam ser exportados da célula e, então, modular a expressão gênica no hospedeiro. Esta análise foi iniciada pela avaliação de possíveis alvos expressos pelos genomas de camundongo e humano. Alguns destes alvos mostraram relação com a resposta imune nos hospedeiros. Esta identificação deve esclarecer o papel desenvolvido por miRNAs na regulação da expressão gênica na interação patógeno-hospedeiro. / The Cryptococcus complex has 37 species described, from which C. neoformans and C. gattii stand out for their ability to cause disease in humans and animals. To prevent infection with pathogenic microorganisms, host may reduce the availability of nutrients in a process known as nutritional immunity. Furthermore, it is well described that essential metals have central roles related to the regulation of expression of virulence factors in pathogenic Cryptococcus species. MicroRNAs (miRNAs) are important mediators of gene expression in response to several stresses, including metal deprivation or toxicity. However, little is known about microRNAs or miRNAs-like expression in C. gattii. Therefore, the aim of this work was to profile miRNAs produced by C. gattii during iron and zinc deprivation. C. gattii R265 cells were incubated in three conditions: zinc deprivation, iron deprivation and control condition. The sequences of small RNAs were obtained by RNA-Seq. To identify miRNAs or miRNAs-like in C. gattii, non-redundant reads were aligned to sequences of C. gattii R265 and WM276 strains genomes. MiRNAs prediction was and resulted in 31 possible miRNAs in R265 strain and 26 in WM276 strain, respectively. In silico analysis of miRNAs differential expression showed that the majority of them are present in the three conditions, while two are present only in metal deprivation. Thereby, these miRNAs-like may be exerting some important role at metal homeostasis in response to infection environment mimicry conditions. As the C. gattii R265 strain does not have an Argonaut encoding gene, the protein that plays a central role in the RNA interference (RNAi) pathway, we assumed that probably this pathway would not be responsible for silencing of others genes. We hypothesized that these miRNAs-like could be exported and modulate the gene expression in host cells. This analysis was initialized by evaluating the potential targets expressed by human and mouse genome. Some of these targets were related to immune response in the host. This identification should clarify the role played by miRNAs in the regulation of gene expression in the host-pathogen interaction.

Interações patógeno-hospedeiro geram alterações em diversos mecanismos, tanto no hospedeiro quanto no patógeno. Neste contexto, nas células do sistema imune do hospedeiro ocorre modulação para impedir o desenvolvimento de patógenos, culminado em sua eliminação, como no caso de infecções por Cryptococcus neoformans. Macrófagos alveolares constituem o primeiro tipo celular a responder à levedura, a qual, após a fagocitose, é capaz de se proliferar e disseminar no hospedeiro. Como mecanismo de defesa, células hospedeiras podem reduzir a concentração de micronutrientes essenciais para o patógeno, mecanismo conhecido por imunidade nutricional. Zinco (Zn) é o segundo metal de transição mais abundante e um micronutriente essencial para todos os organismos e, com isto, macrófagos podem responder a patógenos com redução dos níveis de Zn para auxiliar na eliminação de patógenos. A fim de avaliar se macrófagos respondem com privação de Zn a a fungos, a alteração na homeostase de Zn em macrófagos infectados por C. neoformans foi avaliada bem como a influência da ativação celular nesta resposta. Demonstramos que macrófagos respondem com privação de Zn à infecção por C. neoformans uma vez que ocorreu (i) diminuição nos níveis intracelulares de Zn livre em macrófagos infectados com a levedura viável, (ii) redução na expressão de importadores do metal, (iii) redução nos níveis de Zn livre em leveduras após exposição a macrófagos, (iv) aumento na proliferação no interior de macrófagos e diminuição da taxa de exocitose de C. neoformans em condições de disponibilidade de Zn. Tal modulação de Zn na resposta a C. neoformans foi exercida por alguns transportadores de Zn que respondem significativamente a condições de privação de Zn, principalmente os da família ZnT, e a privação de Zn como mecanismo de imunidade nutricional foi evidente em macrófagos ativados com IFN- e LPS. Macrófagos ativados com PMA não mostraram redução nos níveis intracelulares de Zn em reposta a C. neoformans ou modulação significativa nos níveis de transcritos de transportadores de Zn, como ZIP2 e ZnT7, em comparação a macrófagos ativados com IFN- e LPS. Além disso, de forma geral, macrófagos ativados continham maiores níveis intracelulares de Zn livre em comparação a macrófagos não ativados, sugerindo modulação do processo de ativação na homeostase de Zn em macrófagos J774.A1. / Host-pathogen interactions cause alterations on several mechanisms in both host and pathogen. In this context, host immune system cells are modulated to prevent pathogens growth, aiding in their elimination, as it occurs during Cryptococcus neoformans infections. Alveolar macrophages are the first cell type to respond to yeast infection. Once phagocytosed, cryptococcal cells are capable to proliferate and disseminate in the host. As a defense mechanism, host cells can reduce essential micronutrients concentration to the pathogen, a mechanism known as nutritional immunity. Zinc (Zn) is the second most abundant transition metal and an essential micronutrient for all organisms and thus, macrophages may respond to pathogens with reduced levels of Zn to aid pathogens elimination. In order to evaluate whether macrophages respond with Zn deprivation to fungi, alterations on Zn homeostasis in C. neoformans-infected macrophages was evaluated as well as the influence of cellular activation in this response. We demonstrate that macrophages respond with Zn deprivation to C. neoformans infection, as we could observe (i) a reduction of free intracellular Zn levels in macrophages infected with viable yeast, (ii) a reduced expression of Zn importers, (iii) a decreased free Zn concentration in yeasts exposed to macrophages, (iv) increased yeast proliferation within macrophages and decreased yeast exocytosis under Zn rich conditions. This Zn modulation in response to C. neoformans was exerted by some Zn transporters which respond significantly to Zn deprivation conditions, especially those of the ZnT family, and Zn deprivation as a nutritional immunity mechanism was evident in IFN- and LPS-activated macrophages. PMA-activated macrophages showed no reduction in intracellular Zn levels in response to C. neoformans or a significant modulation in Zn transporters transcript levels, such as ZIP2 and ZnT7, in comparision to IFN-- LPS-activated macrophages. In addition, in general, activated macrophages contained increased free intracellular Zn levels in comparision to non-activated macrophages, suggesting activation process modulation on Zn homeostasis in J774.A1 macrophages.

A imunidade nutricional é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro. A mesma é caracterizada pela privação de nutrientes durante interação patógeno e hospedeiro, mostrando-se essencial tanto para eliminar quanto para conter a disseminação de micro-organismos patogênicos. Dentre os nutrientes sequestrados pelo hospedeiro, está o metal zinco, é um micronutriente essencial para o metabolismo de todos os seres vivos. Em contrapartida, micro-organismos patogênicos desenvolveram mecanismos para capturar esse metal. O nosso modelo de estudo, a levedura encapsulada Cryptococcus gattii, é um dos principais agentes causadores da criptococose. A doença inicia pela inalação de propágulos fúngicos, os quais irão depositar-se no interior dos alvéolos pulmonares onde irão encontrar células fagocíticas, representando a primeira linha de defesa do hospedeiro e onde possivelmente seja empregada a imunidade nutricional para conter a disseminação desta levedura. No presente trabalho, objetivamos avaliar o papel da biodisponibilidade de zinco na virulência de C. gattii. No primeiro capítulo, descrevemos a caracterização da função de dois transportadores de zinco da família ZIP em C. gattii. O transportador de zinco Zip1 é o principal envolvido na captação de zinco, já que linhagens mutantes para o seu gene codificador, assim como a linhagem duplo mutante zip1Δzip2Δ, apresentaram baixo nível de zinco intracelular, crescimento reduzido quando na condição de privação de zinco e altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando cultivados na condição de privação do metal. Tais características não foram observadas na linhagem zip2Δ. Ensaios de virulência demonstraram que zip1Δ e zip1Δzip2Δ são mais susceptíveis à fagocitose por macrófagos, ao passo que ensaios de infecção em modelo murino demonstraram que apenas a linhagem duplo mutante possui virulência atenuada. Tais dados evidenciam que a homeostase de zinco, mais especificamente o transporte, é essencial para a patogenicidade de C. gattii. No segundo capítulo do presente trabalho, abordamos homeostase de zinco durante a interação C. gattii com macrófagos. Por meio de analises de microscopia, demonstramos que leveduras contidas em fagossomos apresentam eventos de aumento transitório na concentração de zinco, o que parece estar diretamente envolvido com a permeabilização dos fagossomos. Adicionalmente, determinamos que macrófagos infectados com C. gattii apresentam uma compartimentalização de zinco, provavelmente no complexo de Golgi, dessa maneira reduzindo a disponibilidade do metal em fagossomos infectados. Concluindo, o presente trabalho demonstrou que o metal zinco é essencial para a patogenicidade de C. gattii, e que transportadores do metal estão diretamente envolvidos com a virulência deste patógeno. Além disto, levantamos importantes dados quanto à imunidade nutricional de macrófagos contra C. gattii, sugerindo que um processo de privação de zinco é realizado por parte do macrófago. / Nutritional immunity is an important defence mechanism used by host. It is characterised by nutrients deprivation during host-pathogen interaction and has important role in growth hampering and microbe killing. Among the nutrients sequestered by host is the metal zinc, which plays essential role in cell metabolism of all living organisms. However, microorganisms developed diverse mechanisms for zinc acquisition. Our model of study is the intracellular fungal pathogen Cryptococcus gattii, one of the main agents of cryptococcal disease. The disease starts with inhalation of fungal propagules, which will deposit inside the lug alveoli and being in contact with phagocytes, representing the first line of host defence. In such host cells, nutritional immunity occur in order to hamper cryptococcal growth. In the present work, we sought to determine the role of zinc availability on the C. gattii virulence. In the first chapter, we describe the functional characterization of two of zinc transporters in C. gattii of the ZIP family. Zip1 transporter is the pivotal zinc transporter in C. gattii, as mutant strains zip1Δ and double mutant strain zip1Δ zip2Δ had lower intracellular content, reduced growth under zinc limitation and higher reactive oxygen species than wild type strain. Such characteristics were not observed in zip2Δ strain. Virulence tests demonstrated that zip1Δ and zip1Δzip2Δ are more susceptible to macrophage phagocytosis, and murine infection assay showed that only double knockout strain had alterations in virulence. Such data lead us to conclude that zinc, acquired by zinc transporters, is essential for C. gattii pathogenicity. In the second chapter, we demonstrated important data about zinc homeostasis during C. gattii and macrophage interaction. Microscopy analysis demonstrated that internalised yeasts cells have events of temporary increase on zinc concentration. These events are directly associated with phagosomal permeabilisation. Moreover, C. gattii infected macrophages have a zinc content compartmentalisation, most probably in the Golgi apparatus. Thus, we conclude that zinc is essential for C. gattii virulence and zinc transporters play an important role on its pathogenicity. In addition, we described important data about zinc nutritional immunity during macrophage and C. gattii interaction.

Criptococose é uma levedurose que acomete o homem e vários animais, podendo ocorrer em indivíduos imunocompetentes, mas freqüentemente está associada a um estado de comprometimento imunológico. Atualmente a etiologia desta micose é atribuída a três espécies: Cryptococcus neoformans, C. grubii (isolados no solo rico em fezes de pombos), e C. gattii (isolado nos eucaliptos). A via mais freqüente de contaminação é a inalatória, com posterior colonização do trato respiratório superior, podendo atingir aos alvéolos e desenvolver a sintomatologia respiratória, ou ocorrer disseminação hematógena com possível comprometimento do Sistema Nervoso Central. É notável o aumento na procura de animais de companhia nos grandes centros urbanos e, também, se verifica uma significativa população de pombos nas cidades, alojados em igrejas, prédios, parques e praças. A exposição dos cães a locais possivelmente contaminados e a saúde destes animais constituise uma preocupação e, visto que existem relatos na literatura, ainda que poucos, sobre a criptococose em cães, realizamos uma pesquisa sobre a presença da levedura nesta espécie. Este trabalho teve como objetivo verificar a ocorrência do Cryptococcus em cães com sintomatologia respiratória e/ou neurológica, atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), localizado na cidade de Porto Alegre, Brasil. A amostragem foi composta por 112 cães. Realizou-se o exame direto, com nigrosina, do líquido cefalorraquidiano (n=17); o cultivo da secreção nasal (112), do sangue total (112) e do líquido cefalorraquidiano (n=17) em ágar níger (Guizotia abissynica), com incubação a 370C durante dez dias; e o teste de aglutinação em látex, utilizando-se o teste Crypto-LA (Wampole), com o soro (n=112) e o líquido cefalorraquidiano (n=17) Para o teste de aglutinação em látex foi realizado, também, tratamento com Pronase em 32 (28,57%) amostras de soro e 4 (23,52%) amostras de líquido cefalorraquidiano. Os resultados do exame direto, do cultivo e do teste de aglutinação em látex foram negativos para o Cryptococcus em todas as amostras testadas. Não se excluiu a possibilidade de ter ocorrido resultados falsos negativos, por não ter sido realizado um lavado nasal para coleta de material para cultivo e, também, porque o Cryptococcus poderia estar presente em pequenas quantidades no organismo e/ou ser pouco capsulado e, portanto, não sendo detectado através do teste de aglutinação em látex. Apesar dos resultados desta amostragem, é plausível a suposição que deva existir a ocorrência da infecção pelo Cryptococcus, embora haja a falta de uma suspeita clínica desta enfermidade, posto que, na região de abrangência do estudo existe uma população canina constantemente exposta ao risco por coabitarem com uma grande população de pombos.

Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética causadora da criptococose, doença que acomete diferentes órgãos de pacientes imunocompetentes, entre eles, pulmões, pele e sistema nervoso central. Durante o processo infeccioso, o fungo expressa diversos fatores de virulência, como a produção de melanina e cápsula polissacarídica, além de possuir a capacidade de replicar-se no interior de macrófagos. Em contrapartida, as células do hospedeiro também possuem estratégias para conter a disseminação do patógeno, uma delas é a imunidade nutricional, na qual ocorre redução da disponibilidade de nutrientes no sítio de infecção. A disponibilidade de zinco é um fator crucial para o desenvolvimento de uma infecção fúngica, mesmo assim, pouco se sabe sobre o metabolismo desse metal na espécie C. gattii. No presente trabalho, primeiramente, descrevemos o fator de transcrição Zap1 em C. gattii, a partir da análise in silico foi identificado um ortólogo do gene regulador da homeostase de zinco ZAP1 de Saccharomyces cerevisiae do genoma de C. gattii. Foram realizadas análises de expressão, demonstrando que o gene selecionado possui sua expressão aumentada na condição de privação de zinco, comprovando assim, sua relação com a homeostase desse metal. Para caracterizar funcionalmente a proteína Zap1, linhagens mutante e mutante complementada para o gene ZAP1 foram construídas e caracterizadas. A diminuição dos níveis de transcritos dos genes codificadores para os transportadores de zinco da família ZIP na linhagem mutante, concluímos que Zap1 regula positivamente a expressão desses genes. Na caracterização fenotípica, a linhagem mutante zap1Δ demonstrou maior sensibilidade à condição de privação de zinco do que a linhagem selvagem e mutante complementada, além de demonstrar altos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs) e maior sensibilidade as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) características que explicam a menor virulência da linhagem mutante quando comparada com a linhagem selvagem. Por meio da análise do transcriptoma demonstramos que Zap1 regula a expressão de genes envolvidos no metabolismo de zinco, estresse oxidativo e de genes codificadores para proteínas ligadoras de zinco. Secundariamente, na caracterização inicial de sistemas de aquisição de zinco em C. gattii, foram realizadas análises por PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos dos genes que codificam para transportadores de zinco da família ZIP. Um aumento significativo nos níveis de transcritos referentes ao gene ZIP3 (CNBG_5361), foi observado quando C. gattii foi cultivado em meio definido contendo o quelante de ferro BPDS ou o quelante de zinco TPEN, quando comparados à condição controle. Este fato sugere que o transportador Zip3 pode apresentar baixa seletividade, podendo transportar outros metais, em contraste aos transportadores Zip1 e Zip2, cuja modulação da expressão por BPDS foi menos acentuada. / Cryptococcus gattii is a basidiomycetous yeast that causes cryptococcosis, a lifethreatening disease that can affect different organs of immunocompetent hosts, including, lungs, skin and central nervous system. During the infection process, the fungus express several virulence factors, such as melanin production and polysaccharide capsule, besides the ability to replicate inside macrophages. In contrast, the host cells express strategies to stop the spread of the pathogen, one of them is nutritional immunity, reducing nutrient availability in the infection site. Zinc availability is a crucial factor for fungal infection development, nevertheless, little is known about zinc metabolism in C. gattii. In the present work, firstly, we described Zap1 transcription factor in C. gattii. In silico analyses identified a Saccharomyces cerevisiae ZAP1 ortholog in C. gattii genome. Expression analyses demonstrated that, ZAP1 is positively regulated in zinc deprivation condition, confirming that the selected gene is involved in zinc metabolism. With the purpose to characterize the role of Zap1 in zinc metabolism, mutant and complemented strains were constructed and characterized. Expression analyses demonstrated that genes codifying for ZIP family of zinc transporter are up regulated by Zap1. On phenotypic characterization, mutant strain demonstrated higher sensibility to zinc deprivation condition when compared to wild type or complemented strain. Moreover, mutant strain demonstrated higher levels of reactive oxygen species (ROS) and higher sensibility to reactive nitrogen species (RNS). Transcriptomic analyses demonstrated that Zap1 regulates the expression of genes involved on zinc homeostasis, oxidative stress and genes codifying for zinc-binding proteins. Taken together, these results, explain the low virulence of mutant strain when compared to wild type and complemented strain. On the second part, on initial characterization of ZIP family of zinc transporters, relative transcript levels of ZIP family codifying genes was measured on different conditions. ZIP3 (CNBG_5361) demonstrated higher transcript levels when C. gattii cells were cultured on iron deprivation condition, for that, iron chelating agent (BPDS) was add to the medium. These results suggest that, Zip3 may present low selectivity, and may carry other metal, in contrast to Zip1 and Zip2, that expression modulation by BPDS was less pronounced.

PERDIGÃO NETO, Lauro Vieira. Aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais da criptococose no Estado do Ceará entre os anos de 1985 e 2010, bem como efeitos de antirretrovirais inibidores de protease sobre virulência e crescimento de Cryptococcus neoformans in vitro. 2011. 124 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-26T15:13:50Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T16:13:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T16:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) Previous issue date: 2011 / A criptococose é a infecção causada a partir da inalação de leveduras do gênero Cryptococcus. A doença costuma acometer mais freqüentemente pacientes com alguma imunodepressão e evoluir de forma subaguda ou crônica. Tem predileção por sistema nervoso central, manifestando-se como meningite, mas também pode apresentar-se como doença pulmonar ou de forma disseminada, com envolvimento de outros órgãos. A atividade proteolítica em leveduras do gênero Cryptococcus tem sido associada a sua patogenicidade. A atividade da enzima fosfolipase também se faz importante para este gênero, uma vez que está relacionada à nutrição e à capacidade invasiva do microrganismo. Outro mecanismo de virulência de maior relevância para a patogenicidade de Cryptococcus spp. é a cápsula polissacarídica presente em sua superfície, responsável principal pelo escape aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Esta pesquisa teve como objetivo traçar um perfil clínico, epidemiológico e laboratorial dos pacientes com criptococose entre os anos de 1985 e 2010, bem como investigar os efeitos dos inibidores de protease Saquinavir, Darunavir, Ritonavir e Indinavir sobre o crescimento, espessura da cápsula, atividade de protease e expressão de fosfolipase em cepas de Cryptococcus neoformans isoladas de humanos. A comparação entre grupo soropositivo para o HIV com grupo soronegativo mostrou que o primeiro apresenta maiores médias de idade e maior freqüência de sexo masculino acometido; por outro lado, o grupo soropositivo demonstra menores proteinorraquia e celularidade no líquor, bem como menores valores de leucometria e plaquetometria em sangue periférico. Após a realização do teste de sensibilidade por microdiluição em caldo, os fungos foram expostos a três concentrações distintas dos fármacos e avaliados com relação à expressão das duas enzimas e espessura da cápsula. Os resultados mostraram inibição significativa (p<0,05) da atividade de protease pelo menos na maior concentração testada para todas as drogas, bem como estreitamento da cápsula em algumas combinações de drogas e cepas. Por outro lado, quanto à atividade de fosfolipase, observou-se um aumento na expressão dessa enzima, especialmente nas concentrações mais elevadas das quatro drogas. Conclui-se, portanto, que apesar de estes antirretrovirais não inibirem o crescimento de Cryptococcus neoformans, são capazes de alterar mecanismos de virulência destas leveduras.

A imunidade nutricional é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro. A mesma é caracterizada pela privação de nutrientes durante interação patógeno e hospedeiro, mostrando-se essencial tanto para eliminar quanto para conter a disseminação de micro-organismos patogênicos. Dentre os nutrientes sequestrados pelo hospedeiro, está o metal zinco, é um micronutriente essencial para o metabolismo de todos os seres vivos. Em contrapartida, micro-organismos patogênicos desenvolveram mecanismos para capturar esse metal. O nosso modelo de estudo, a levedura encapsulada Cryptococcus gattii, é um dos principais agentes causadores da criptococose. A doença inicia pela inalação de propágulos fúngicos, os quais irão depositar-se no interior dos alvéolos pulmonares onde irão encontrar células fagocíticas, representando a primeira linha de defesa do hospedeiro e onde possivelmente seja empregada a imunidade nutricional para conter a disseminação desta levedura. No presente trabalho, objetivamos avaliar o papel da biodisponibilidade de zinco na virulência de C. gattii. No primeiro capítulo, descrevemos a caracterização da função de dois transportadores de zinco da família ZIP em C. gattii. O transportador de zinco Zip1 é o principal envolvido na captação de zinco, já que linhagens mutantes para o seu gene codificador, assim como a linhagem duplo mutante zip1Δzip2Δ, apresentaram baixo nível de zinco intracelular, crescimento reduzido quando na condição de privação de zinco e altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando cultivados na condição de privação do metal. Tais características não foram observadas na linhagem zip2Δ. Ensaios de virulência demonstraram que zip1Δ e zip1Δzip2Δ são mais susceptíveis à fagocitose por macrófagos, ao passo que ensaios de infecção em modelo murino demonstraram que apenas a linhagem duplo mutante possui virulência atenuada. Tais dados evidenciam que a homeostase de zinco, mais especificamente o transporte, é essencial para a patogenicidade de C. gattii. No segundo capítulo do presente trabalho, abordamos homeostase de zinco durante a interação C. gattii com macrófagos. Por meio de analises de microscopia, demonstramos que leveduras contidas em fagossomos apresentam eventos de aumento transitório na concentração de zinco, o que parece estar diretamente envolvido com a permeabilização dos fagossomos. Adicionalmente, determinamos que macrófagos infectados com C. gattii apresentam uma compartimentalização de zinco, provavelmente no complexo de Golgi, dessa maneira reduzindo a disponibilidade do metal em fagossomos infectados. Concluindo, o presente trabalho demonstrou que o metal zinco é essencial para a patogenicidade de C. gattii, e que transportadores do metal estão diretamente envolvidos com a virulência deste patógeno. Além disto, levantamos importantes dados quanto à imunidade nutricional de macrófagos contra C. gattii, sugerindo que um processo de privação de zinco é realizado por parte do macrófago. / Nutritional immunity is an important defence mechanism used by host. It is characterised by nutrients deprivation during host-pathogen interaction and has important role in growth hampering and microbe killing. Among the nutrients sequestered by host is the metal zinc, which plays essential role in cell metabolism of all living organisms. However, microorganisms developed diverse mechanisms for zinc acquisition. Our model of study is the intracellular fungal pathogen Cryptococcus gattii, one of the main agents of cryptococcal disease. The disease starts with inhalation of fungal propagules, which will deposit inside the lug alveoli and being in contact with phagocytes, representing the first line of host defence. In such host cells, nutritional immunity occur in order to hamper cryptococcal growth. In the present work, we sought to determine the role of zinc availability on the C. gattii virulence. In the first chapter, we describe the functional characterization of two of zinc transporters in C. gattii of the ZIP family. Zip1 transporter is the pivotal zinc transporter in C. gattii, as mutant strains zip1Δ and double mutant strain zip1Δ zip2Δ had lower intracellular content, reduced growth under zinc limitation and higher reactive oxygen species than wild type strain. Such characteristics were not observed in zip2Δ strain. Virulence tests demonstrated that zip1Δ and zip1Δzip2Δ are more susceptible to macrophage phagocytosis, and murine infection assay showed that only double knockout strain had alterations in virulence. Such data lead us to conclude that zinc, acquired by zinc transporters, is essential for C. gattii pathogenicity. In the second chapter, we demonstrated important data about zinc homeostasis during C. gattii and macrophage interaction. Microscopy analysis demonstrated that internalised yeasts cells have events of temporary increase on zinc concentration. These events are directly associated with phagosomal permeabilisation. Moreover, C. gattii infected macrophages have a zinc content compartmentalisation, most probably in the Golgi apparatus. Thus, we conclude that zinc is essential for C. gattii virulence and zinc transporters play an important role on its pathogenicity. In addition, we described important data about zinc nutritional immunity during macrophage and C. gattii interaction.