PERDIGÃO NETO, Lauro Vieira. Aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais da criptococose no Estado do Ceará entre os anos de 1985 e 2010, bem como efeitos de antirretrovirais inibidores de protease sobre virulência e crescimento de Cryptococcus neoformans in vitro. 2011. 124 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-26T15:13:50Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T16:13:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T16:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) Previous issue date: 2011 / A criptococose é a infecção causada a partir da inalação de leveduras do gênero Cryptococcus. A doença costuma acometer mais freqüentemente pacientes com alguma imunodepressão e evoluir de forma subaguda ou crônica. Tem predileção por sistema nervoso central, manifestando-se como meningite, mas também pode apresentar-se como doença pulmonar ou de forma disseminada, com envolvimento de outros órgãos. A atividade proteolítica em leveduras do gênero Cryptococcus tem sido associada a sua patogenicidade. A atividade da enzima fosfolipase também se faz importante para este gênero, uma vez que está relacionada à nutrição e à capacidade invasiva do microrganismo. Outro mecanismo de virulência de maior relevância para a patogenicidade de Cryptococcus spp. é a cápsula polissacarídica presente em sua superfície, responsável principal pelo escape aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Esta pesquisa teve como objetivo traçar um perfil clínico, epidemiológico e laboratorial dos pacientes com criptococose entre os anos de 1985 e 2010, bem como investigar os efeitos dos inibidores de protease Saquinavir, Darunavir, Ritonavir e Indinavir sobre o crescimento, espessura da cápsula, atividade de protease e expressão de fosfolipase em cepas de Cryptococcus neoformans isoladas de humanos. A comparação entre grupo soropositivo para o HIV com grupo soronegativo mostrou que o primeiro apresenta maiores médias de idade e maior freqüência de sexo masculino acometido; por outro lado, o grupo soropositivo demonstra menores proteinorraquia e celularidade no líquor, bem como menores valores de leucometria e plaquetometria em sangue periférico. Após a realização do teste de sensibilidade por microdiluição em caldo, os fungos foram expostos a três concentrações distintas dos fármacos e avaliados com relação à expressão das duas enzimas e espessura da cápsula. Os resultados mostraram inibição significativa (p<0,05) da atividade de protease pelo menos na maior concentração testada para todas as drogas, bem como estreitamento da cápsula em algumas combinações de drogas e cepas. Por outro lado, quanto à atividade de fosfolipase, observou-se um aumento na expressão dessa enzima, especialmente nas concentrações mais elevadas das quatro drogas. Conclui-se, portanto, que apesar de estes antirretrovirais não inibirem o crescimento de Cryptococcus neoformans, são capazes de alterar mecanismos de virulência destas leveduras.

FONSECA, Iêda Maria Rocha Lima Vieira da. Avaliação da concentração de proteínas totais na saliva humana frente a diferentes protocolos de tratamento da saliva. 2015. 40 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-11-19T12:39:00Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_imrlvfonseca.pdf: 763869 bytes, checksum: 7ff734931eddb02f3b4465dc7f77d0f5 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-11-19T12:39:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_imrlvfonseca.pdf: 763869 bytes, checksum: 7ff734931eddb02f3b4465dc7f77d0f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-19T12:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_imrlvfonseca.pdf: 763869 bytes, checksum: 7ff734931eddb02f3b4465dc7f77d0f5 (MD5) Previous issue date: 2015 / The need to preserve the stability of saliva samples during and/or after collection has been considered a factor that might influence its analytical results, compromising the reliability and reproducibility of these analytical methods. The main challenges related to saliva preservation include the complexity of saliva composition, and its inherent elevated proteolitic activity. Thus, collection and storage of saliva requires specific precautions to preserve its components. The present study aimed to evaluate the protein concentration of saliva samples obtained from 10 healthy adults, aged 23 – 65 years, with a mean age of 31 years, subject to different pre-analytical sample preparation. Following collection, the salivary flow rate was calculated, and saliva samples from each volunteer were fractioned and divided in six different groups, in which each of these groups corresponded to a different type of pre-analytical sample preparation. The groups were as follows: G1- immediate centrifugation, no addition of protease inhibitor, room temperature during 24 hours; G2- immediate centrifugation, no addition of protease inhibitor, -80oC during 30 days; G3- immediate centrifugation, protease inhibitor added during collection, -80oC during 30 days; G4- immediate centrifugation, protease inhibitor added during analysis, -80oC during 30 days; G5- centrifugation 30 days after collection, no addition of protease inhibitor, -80oC during 30 days; G6- centrifugation 30 days after collection, protease inhibitor added during analysis, -80oC during 30 days. Total protein concentration was analyzed in duplicates, through the bicinchoninic acid assay. After analysis, the total protein concentration in each group was statistically correlated through Pearson and Spearman correlation tests and compared using repeated measure ANOVA (p<0.05). The mean total protein concentrations showed a negative correlation with salivary flow rate in G1 (P= 0,020), G4 (P= 0,027) and G5 (P= 0,05). Total protein concentration and age were only statistically correlated in G3 (P= 0,01). The mean total protein concentrations did not significantly differ between groups, F(5,45)= 1,132, P= 0,358. These results were also observed when comparing the mean total protein concentrations normalized by each individual’s salivary flow rate, F(5,45) = 2,068, P= 0,087. In conclusion, the methodological alterations proposed for the preparation of saliva samples before analysis did not generate significant quantitative alterations in total protein concentration within these samples. / A necessidade de preservar a estabilidade da saliva durante e/ou depois da coleta, tem sido considerado um fator que pode influenciar os resultados obtidos na análise desse fluido, comprometendo a confiabilidade e reprodutibilidade de tais métodos analíticos. Os principais desafios relacionados à preservação da saliva referem-se à complexidade da sua composição e da sua elevada atividade proteolítica inerente. Consequentemente, coleta e armazenamento da saliva exigem precauções especiais para preservação de seus componentes. O presente estudo se propôs a avaliar a concentração proteica de amostras de saliva total de dez voluntários adultos, saudáveis, com idades variando de 23 a 65 anos, com média de 31 anos submetidas a alterações metodológicas no preparo pré-analítico da amostra. Após coletadas, os fluxos salivares foram calculados e as amostras de saliva de cada indivíduo foram fracionadas e divididas em seis diferentes grupos, onde cada um desses grupos correspondeu a um tipo diferente de preparo pré-analítico da amostra. Os grupos foram conforme segue: G1- centrifugação imediata, inibidor ausente, temperatura ambiente por 24 horas; G2- centrifugação imediata, inibidor ausente, -80oC por 30 dias; G3- centrifugação imediata, inibidor no ato da coleta, -80oC por 30 dias; G4- centrifugação imediata, inibidor no ato da análise, -80oC por 30 dias; G5- centrifugação após 30 dias, inibidor ausente, -80oC por 30 dias; G6- centrifugação após 30 dias, inibidor no ato da análise, -80oC por 30 dias. As concentrações de proteínas totais foram avaliadas pelo método do ácido bicinconínico, em duplicatas. Após análise a concentração de proteínas totais em cada grupo foi estatisticamente correlacionada pelos testes de Pearson e Spearman, e comparações feitas realizadas por meio do teste ANOVA para medidas repetidas (p<0.05). As concentrações médias de proteínas totais demonstraram uma correlação negativa significativa com o fluxo salivar em G1 (P= 0,020), G4 (P= 0,027) e G5 (P= 0,05). Proteínas totais e idade só demonstraram correlação significativa em G3 (P= 0,01). As concentrações de proteínas totais médias não diferiram de forma significante entre os grupos, F(5,45)= 1,132, P= 0,358. Esses resultados foram, também, observados ao se comparar as médias de proteínas totais com base no fluxo salivar dos voluntários, F(5,45) = 2,068, P= 0,087. Em conclusão, as alterações metodológicas ora propostas no tratamento das amostras de saliva não redundaram em alterações quantitativas significantes nas concentrações de proteínas totais presentes nesse fluido.

SERPA, R. Biofilmes de Trichosporon asahii e Trichosporon inkin: aspectos morfofisiológicos, sensibilidade a antifúngicos e inibição mediada por ritonavir. 2016. 118 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:21:57Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / In recent years, several studies have considered Trichosporon genus as emerging opportunistic pathogens in immunocompromised patients. Although the dynamics are not well understood, it is known that events associated with biofilm formation on these fungi play an important role in the infectious process. Thus, the present study analyzed morphophysiological aspects of biofilms produced by Trichosporon spp., as well as the role of a protease inhibitor on T. asahii and T. inkin cells and biofilms. In the first part of the study, we investigated the biofilm formation of T. inkin (n=7) in RPMI broth, CLED broth and Sabouraud broth at pH 5.5 and pH 7.0, with initial inoculum of 1x104, 1x105 and 1x106 cells/ml, incubated at 28°C and 35°C in static or shaking at 80 rpm. Biofilms were evaluated for their biomass and metabolic viability, viable cell counts, quantification of nucleic acids and proteinase activity. It was also investigated the sensitivity of the biofilm front of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole and voriconazole. To evaluate the inhibitory activity of ritonavir on the structure and functioning of T. asahii and T. inkin biofilms, biofilms were formed in the presence of ritonavir and evaluated for cell adhesion, structural development and proteinase activity. Additionally, ritonavir was assessed on mature biofilms, matrix composition and structural changes. Planktonic cells of T. asahii and T. inkin (n=2 each) were also investigated for sensitivity to ritonavir alone and in combination with antifungals. Finally, planktonic cells were pre-exposed to ritonavir and evaluated for biofilm formation capacity, susceptibility to antifungal agents, and changes in their surface hydrophobicity. Maximum biofilms growth in RPMI pH 7.0 for inoculation of 1x106 cells/ml and incubation at 35°C under stirring. Biofilms produced under these conditions are formed by dynamic communities associated with an extracellular matrix, and show increased viability and biomass over time, reaching stability after 48 hours of cultivation. During the development of biofilms occurs release of viable cells and nucleic acids into the surrounding environment. T. inkin biofilms produce more proteases and tolerate higher concentrations of antifungals that planktonic cells related. Due to the presence of proteases in the development of T. inkin biofilm, it was hypothesized that these enzymes could be considered important targets in controlling biofilms. The results showed that ritonavir decreased cell adhesion and formation of mature biofilms, and reduce protease activity and change the structure of biofilms. Ritonavir did not affect the viability of mature biofilms, but changed the composition of the extracellular matrix of biofilms, which showed different protein spectra compared to the control group. Ritonavir was able to inhibit planktonic growth of T. asahii and T. inkin approximately 50%. However, there was no synergism between ritonavir and tested antifungals. In planktonic cells, pre-exposure to ritonavir significantly reduced values of minimum inhibitory concentration of Amphotericin B in T. asahii and T. inkin, although not change the response to azoles. Preincubation with ritonavir reduced cell adhesion, but not the formation of mature biofilms, in addition to changing the hydrophobicity of the cell surface. The article detailed characteristics of T. inkin biofilms and showed the potential use of a protease inhibitor in controlling these biofilms. / Nos últimos anos, diversos estudos têm considerado os fungos do gênero Trichosporon como patógenos oportunistas emergentes em pacientes imunocomprometidos. Embora a dinâmica não seja bem compreendida, sabe-se que eventos associados à formação de biofilme nestes fungos têm papel importante no processo infeccioso. Desta forma, o presente estudo analisou aspectos morfofisiológicos dos biofilmes produzidos por T. inkin, bem como o papel de um inibidor de proteases sobre as células e biofilmes de T. asahii e T. inkin. Na primeira parte da pesquisa, foi investigada a formação de biofilmes de T. inkin (n=7) nos meios RPMI, Caldo CLED e Caldo Sabouraud, em pH 5,5 e pH 7,0, com inóculos iniciais de 1x104, 1x105 e 1x106 células/mL, incubados a 28°C e 35°C, de forma estática ou agitação a 80 rpm, por 48h. Os biofilmes formados foram avaliados quanto à biomassa e atividade metabólica, contagem de células viáveis, quantificação de ácidos nucléicos e atividade proteásica. Investigou-se ainda a sensibilidade dos biofilmes frente à anfotericina B, caspofungina, fluconazol, itraconazol e voriconazol. Para avaliação da atividade inibitória do ritonavir sobre a estrutura e o funcionamento dos biofilmes de T. asahii e T. inkin, biofilmes foram formados na presença de ritonavir e avaliados quanto à adesão celular, desenvolvimento estrutural e atividade proteásica. Adicionalmente, o ritonavir foi avaliado sobre biofilmes maduros, composição de matriz e alterações estruturais. Células planctônicas de T. asahii e T. inkin (n=2 cada) também foram investigadas quanto à sensibilidade ao ritonavir isolado e em combinação com antifúngicos. Por fim, células planctônicas foram pré-expostas ao ritonavir e avaliadas quanto à capacidade de formação de biofilmes, sensibilidade a antifúngicos e alteração na hidrofobicidade de suas superfícies. A produção de biofilmes foi máxima em RPMI pH 7,0, em inóculo de 1x106 células/mL, e incubação a 35°C, sob agitação. Os biofilmes produzidos nessas condições são formados por comunidades dinâmicas, associadas a uma matriz extracelular, e mostram aumento da atividade metabólica e biomassa ao longo do tempo, atingindo estabilidade após 48 h de cultivo. Durante o desenvolvimento dos biofilmes, ocorre liberação de células viáveis e ácidos nucléicos para o ambiente circundante. Os biofilmes de T. inkin produzem mais proteases e toleram maiores concentrações de antifúngicos que as células planctônicas relacionadas. Dada à presença de proteases durante o desenvolvimento do biofilme de T. inkin, foi hipotetizado que essas enzimas poderiam ser consideradas alvos importantes no controle dos biofilmes. Os resultados mostraram que o ritonavir diminuiu a adesão celular e formação de biofilmes maduros, além de reduzir a atividade proteásica e alterar a estrutura dos biofilmes. O ritonavir não interferiu na atividade metabólica de biofilmes maduros, mas alterou a composição da matriz extracelular dos biofilmes, as quais apresentaram diferentes espectros protéicos em comparação com o grupo controle. O ritonavir inibiu o crescimento planctônico de T. asahii e T. inkin a 100 μg/mL. Entretanto, não foi observado sinergismo entre o ritonavir e os antifúngicos testados. Em células planctônicas, a pré-exposição ao ritonavir reduziu significativamente os valores de concentração inibitória mínima da anfotericina B em T. asahii e T. inkin, embora não tenha alterado a resposta aos azólicos. A pré-incubação com ritonavir reduziu a adesão das células, mas não a formação de biofilmes maduros, além de alterar a hidrofobicidade da superfície celular. O presente artigo detalhou características dos biofilmes de T. inkin e mostrou o potencial do uso de um inibidor de proteases no controle dos biofilmes de T. asahii e T. inkin.

As plantas são utilizadas no tratamento e na cura de enfermidades desde a antiguidade, quando o homem começou a usar a natureza em seu favor. Estas plantas, pela sua riqueza química e farmacológica, têm sido estudadas no intuito de comprovar atividades atribuídas pela crença popular ou mesmo obter novos compostos ativos. Neste contexto, a família Clusiaceae que compreende quarenta e nove gêneros de plantas de ampla distribuição tem sido investigada. Entre eles está o gênero Garcinia, também conhecido como Rheedia, que é rico em uma considerável diversidade de compostos, tais como benzofenonas polipreniladas e flavonóides. Neste trabalho foram obtidos os extratos hexânico, acetato-etílico e etanólico do pericarpo dos frutos de Garcinia brasiliensis. Após avaliação da atividade leishmanicida in vitro, o extrato hexânico se mostrou o mais ativo. Desta forma, foi fracionado e dele obteve-se três benzofenonas, 7-epi-clusianona, garciniafenona e guttiferona-a, que foram avaliadas quanto as suas atividades leishmanicida e toxicidade. No intuito de determinar um possível mecanismo de ação, os extratos foram avaliados quanto a sua capacidade de inibir proteases isoladas de amastigotas, sendo o extrato acetato etílico o que apresentou melhor resultado. Assim, este foi fracionado e dele se obteve o biflavonóide fukugetina, que também foi avaliado quanto à capacidade de inibir proteases, apresentando resultados muito satisfatórios. Todavia, quando o extrato acetato etílico e a fukugetina foram avaliados quanto à atividade leishmanicida in vitro não foi observado o mesmo efeito. Com estes resultados podemos observar que a polaridade dos extratos e das moléculas testados neste estudo pode ser um fator imprescindível na atividade leishmanicida, possivelmente por dificultar o transporte destas substâncias através de membrana plasmática. / The plants have been used in the treatment and cure of illnesses since the antique. When the men started to use the nature in your service. These plants, due to their chemical and pharmaceutical characteristics, have been studied in order to prove their theoretical medicinal capabilities or to obtain new active components. In this context, the Clusiaceae family is made up of forty nine species that are widely distributed, have been studied. Among these species is the genus Rheedia, also known as Garcinia, which is rich in a wide range of components, such as polyprenylated benzophenones and flavonoids. In this work were obtained the hexanic, ethyl-acetate and ethanolic extracts from pericarp of fruits from Garcinia brasiliensis. After the evaluation of leishmanicidal activity in vitro, the hexanic extract shown the more active, thus, this was fractioned yielding three benzophenones - 7-epi-clusianone, garciniaphenone and guttiferone-a – that were evaluated how their leishmanicidal and toxicity activities. With the intention of to determine a possible mechanism of action, these components were then evaluated of their capacity of to inhibit proteases isolated from amastigote forms of Leishmania, have been the ethyl-acetate extract the more effective. Thus this was fractioned yielding the biflavonoid fukugetin, witch also was evaluated in relation your proteases inhibition capacity, showing results very satisfactory. However, when the ethyl-acetate extract and the fukugetin were evaluated in relation the leishmanicidal activity in vitro, not was find the same effect. With these results, we might realize that the hydrophilic of extracts and molecules evaluated in this study can be an essential factor in the leishmanicidal activity, possible by to make transport difficult of this compounds across the plasmatic membrane. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T04:42:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 285029.pdf: 700907 bytes, checksum: 0b15ab2a05efe94828d644e1103f043c (MD5) / Nas larvas de Tenebrio molitor (verme do trigo) são encontrados variados tipos de proteinases digestivas serínicas e cisteínicas, quando alimentados com uma dieta controle de farinha de trigo. Quando alimentados com farinha do feijão comum (Phaseolus vulgaris), pelo menos cinco proteinases apresentam atividade mais elevadas, enquanto a expressão de três enzimas pré-existentes foi reprimida. A indução dessas proteinases ocorreu entre 30 min e 1 h após a alimentação. Aqui nós relatamos o fracionamento das proteinases envolvidas na adaptação de T. molitor a inibidores de proteinases em sementes de leguminosas incorporadas em uma dieta controle usando cromatografia de troca iônica e filtração em gel, seguida pela caracterização das enzimas com substratos e inibidores naturais e sintéticos. Os inibidores utilizados neste estudo (todos incorporados na concentração de 0,4% no farelo de trigo) foram: inibidor de tripsina de soja (STI), inibidor de tripsina e quimotripsina de soja (SBI), inibidor de tripsina de Adenanttera pavonina (ApTI) e o inibidor de tripsina de P. vulgaris (BTI). As atividades proteolíticas foram ensaiadas para azoalbumina, para os substratos fluorogênicos z-PR-MCA, z-RR-MCA e succinil-GGR-MCA e os substratos cromogênicos suc-AAPF-pNA e benzoil-R-pNA. As atividades também foram monitoradas através de zimogramas e de fracionamento em géis bidimensionais. Dos quatro inibidores testados, o ApTI foi capaz de inibir as enzimas proteolíticas majoritárias sem induzir enzimas insensíveis a este inibidor, enquanto os outros inibidores além de inibir as proteinases constitutivas causaram indução de um conjunto diferente de proteinases serínicas. Entre as proteinases induzidas, uma era de interesse particular, pois foi induzida após sessenta minutos após a ingestão de SBI, STI e BTI. Esta proteinase teve sua atividade caracterizada como uma quimotripsina através de análise eletroforética bidimensional seguida de sequenciamento por espectrometria de massas.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10907a.pdf: 1648639 bytes, checksum: bf4fac985206b2244ac3ec1870393d34 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10907a.pdf: 1648639 bytes, checksum: bf4fac985206b2244ac3ec1870393d34 (MD5) Publico-10907b.pdf: 902711 bytes, checksum: 9db986617af48f452457bb57d5021d5e (MD5) / As infestinas são inibidores de serinoproteases do tipo Kazal encontrados no intestino médio anterior do barbeiro Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae), um dos principais vetores da doença de Chagas. Neste trabalho, o cDNA do precursor das infestinas foi clonado mostrando a presença de um peptídeo sinal hipotético e sete domínios de inibidores de proteases do tipo Kazal sendo quatro correspondentes as infestinas 1-2 e infestina 3-4, e três novos domínios. Por análise em Northern blot, foi confirmada a síntese de apenas um transcrito de infestina 1-7, de aproximadamente 1800 pb, no intestino médio anterior do inseto. Os três novos domínios de infestina foram denominados de infestina 1R, 2R e 3R. As infestinas 2R-3R são 77% idênticas em seqüência de aminoácidos a infestina 1-2. Em contraste as demais infestinas, a infestina 1R apresenta duas características diferentes marcantes: 1) aminoácido hidrofóbico na posição P1 do sítio reativo do inibidor e, 2) ser processado como um domínio único do tipo Kazal de acordo com predição. Estas duas características foram demonstradas experimentalmente pela purificação da infestina 1R nativa de intestino de T. infestans a qual inibiu elastase de neutrófilos, quimotripsina e subtilisina A e a análise por espectroscopia de massas confirmou o processamento como um único domínio do tipo Kazal. A infestina 1R recombinante foi expressa em bactéria E. coli e apresentou a mesma constante de dissociação para elastase de neutrófilos em relação a proteína nativa. rINF1R também foi capaz de inibir subtilisina A, quimotripsina e proteinase K, mas não foi capaz de inibir trombina nem os ensaios de coagulação (TP e TTPA). Procurando pela função biológica de infestina 1R e atividades biologicas da molecula, verificamos que a forma recombinante foi capaz de interagir com o parasita da doenca de Chagas Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) ligando-se as formas tripomastigotas de T. cruzi e interferiu na invasao de celulas epiteliais em cultura. Na concentracao final de 10 ƒÊM, rINF1R bloqueou completamente a invasao e, na mesma concentracao, foi capaz de inibir o crescimento das formas epimastigotas em cultura. Para elucidar qual regiao de rINF1R era responsavel por esta atividade, um peptideo ciclico contendo a regiao do sitio reativo de rINF1R baseado na estrutura de SFTI-1 (Sun Flower Trypsin Inhibitor 1) denominado 1RSFTI foi sintetizado o qual tambem foi capaz de interferir na invasao celular de T. cruzi. Ensaios de invasao de celulas LLCMK2 por T. cruzi cepa Y utilizando diferentes inibidores de proteases sugerem que atividade proteolitica do tipo subtilisina pode ser importante para a invasao de celulas por T. cruzi. O perfil de expressao do precursor das infestinas alimentando artificialmente com sangue humano contendo extrato das formas tripomastigotas de T. cruzi mostrou aumento de expressao de duas vezes apos 12 h em relacao aos que se alimentaram apenas com sangue nas mesmas condicoes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5) Publico-00268b.pdf: 2029279 bytes, checksum: 0ce31c253ab625a6b402e5c0b4abffe0 (MD5) / O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5. / Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted peptides could be explained for all positions except P5. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:22:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345765.pdf: 1663042 bytes, checksum: f22ad918f66ad46925ac96dc3733d829 (MD5) Previous issue date: 2017 / O vírus da hepatite C (HCV) é um vírus RNA simples, com diferentes genótipos e subtipos. Aproximadamente 350 mil pessoas infectadas por HCV morrem por ano no mundo. O tratamento objetiva eliminar o HCV e prevenir complicações hepáticas. É eficiente quando alcançada a resposta viral sustentada (RVS). Em 2013, novos antivirais inibidores de protease (IP), telaprevir TVR e boceprevir (BOC), foram incorporados ao SUS. No entanto, a prática clínica foi insatisfatória e, rapidamente, esses IP foram substituídos por novos fármacos. Este trabalho objetivou analisar os eventos adversos (EA) e a efetividade do tratamento com TVR e BOC em pacientes com hepatite C, no Polo de Aplicação e Monitoramento de Medicamentos Injetáveis do Hospital Nereu Ramos (PAMMI/HNR), Florianópolis - SC. Foi realizado estudo de coorte retrospectivo observacional, com análise descritiva e estatística, baseado nos registros de prontuários, durante o período de 2012 a 2015. Foram incluídos 209 pacientes, dos quais 63,2% utilizaram TVR e 36,8% utilizaram BOC. Os EA foram semelhantes em ambos. Cerca de 90% dos pacientes apresentaram EA hematológicos. 63% necessitaram fazer uso eritropoietina, 28% de filgrastima e 9% de transfusão. Os demais eventos foram reações de pele (TVR-87% e BOC-70%), náuseas (TVR?69% e BOC-80%), alterações de humor (TVR?60% e BOC-66%) e diarreia (TVR-42% e BOC-39%). Não houve diferença estatisticamente significativa para RVS entre os dois tratamentos. O total de pacientes que concluíram o tratamento foi de 149 (71,3%), sendo que 60 (28,7%) interromperam o tratamento, 28 (13,4%) por evento adverso e 28 (13,4%) por não resposta ao tratamento. A taxa de abandono foi de 2,4% e 11,9% dos pacientes apresentaram recidiva. Ocorreu um óbito. A RVS por intenção de tratar foi de 62,8% para os tratados com TVR e de 55,8% para os tratados com BOC. Cirrose e tratamento prévio foram fatores associados a uma menor RVS. Por fim, observou-se que os IP aumentaram a efetividade do tratamento em relação à terapia com interferon peguilado e ribavirina, mas induziram um maior número de EA.<br> / Abstract : Hepatitis C virus (HCV) is a single stranded RNA vírus with different genotypes and subtypes. About 350,000 people infected with HCV die every year around the world. The treatment aims to eliminate HCV and prevent liver complications and is effective when achieve sustained viral response (SVR). In 2013 new antiviral protease inhibitors (PI), telaprevir (TVR) and boceprevir (BOC), were incorporated into brazilian Public Health System (SUS). However, the clinical practice of PI was unsatisfactory, leading to the replacement of these PI by new drugs. Thus, the present study aimed to analyze the adverse events (AE) and an effectiveness of HCV treatment with TVR and BOC at the ambulatory service of Nereu Ramos Hospital, in Florianopolis-SC. A retrospective observational cohort study was conducted. A descriptive and statistical analysis were performed, based on medical records, between 2012 and 2015. Were included 209 patients, 63.2% used TVR and 36.8 % BOC. The AE were similar in both groups. The hematological occurred in 90% of patients, which 63% needed to use erythropoietin, 28% filgrastim and 9% blood transfusion. The SVR was similar between the two treatments. The number of patients who completed the treatment was 149 (71.3%). The therapy discontinuation was 60 (28.7%), which 28 (13.4%) ocurred due adverse events and 28 (13.4%) due no response to the treatment.. The rate of abandonment was 2.4% and relapse 11.9%. One death was reported. SVR by intention to treat was 62.8% to TVR and 55.8% to BOC. Cirrhosis and previous treatments were associated factors with lower SVR. The present study has demonstrated that the PI use increased treatment effectiveness over pegylated interferon and ribavirin therapy, however, induced a greater number of AEs.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T21:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 190352.pdf: 281352 bytes, checksum: b4a4269a93a10bd03c26a7e3343b8c16 (MD5)

O filo Cyanobacteria constitui um grupo filogeneticamente coerente, embora, apresente grande diversidade morfológica, sendo sua sistemática constantemente revisada. Esses micro-organismos são, ainda, alvos de estudos biotecnológicos em razão da produção de toxinas e na busca por substâncias de interesse farmacológico. Dentre as linhagens analisadas neste estudo, sete sequências do gene rRNA 16S foram geradas e avaliadas com sequências previamente obtidas. Ao menos dois grupos podem representar novos gêneros de cianobactérias, sendo que um grupo demonstra ser endêmico de manguezais brasileiros. Os genes de inibidores de proteases, aeuruginosina, cianopeptolina e microviridina, foram detectados e a produção de aeruginosina foi confirmada por LC-MS nos gêneros Cyanobium e Nostoc. Sequências de aminoácidos do precursor de microviridina indicaram a produção de três novas variantes em quinze linhagens de cianobactérias dos gêneros Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nodosilinea e Nostoc. O potencial genético para produção de cilindrospermopsina (cyrJ) foi confirmado em vinte e seis linhagens. Em cinco linhagens dos gêneros Cyanobium e Nostoc foram encontrados os genes mcyD, mcyE e mcyG, envolvidos na biossíntese de microcistina. A sequência McyG da linhagem Nostoc sp. CENA175 agrupou-se filogeneticamente com outras de linhagens produtoras de microcistina. Os genes sxtA e sxtI, envolvidos na biossíntese de saxitoxina, foram encontrados em nove linhagens dos gêneros Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea e Nostoc. A sequência de SxtI da linhagen Leptolyngbya sp. CENA134 apresentou similaridade >= 70 % com proteínas hipotéticas enquanto as de Nostoc sp. CENA159 e Nostoc sp. CENA160 apresentaram similaridade >= 82 % com O-carbamoiltransferase. Na análise filogenética, a sequência de SxtI da linhagem Nostoc sp. 160 agrupou-se com sequências de linhagens produtoras de saxitoxina. Nas análises químicas, a fração 3 do extrato da linhagem Oxynema sp. CENA135 revelou uma substância com características de ácidos graxos poli-insaturados e a fração 2 do extrato da linhagem Nostoc sp. CENA175 apresentou uma estrutura aromática ligada a uma cadeia alifática. Outros três extratos, obtidos das linhagens Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 e Nostoc sp. CENA184 mostraram-se promissores quanto à presença de substâncias nitrogenadas. Os ensaios de bioatividade revelaram que 48 % dos extratos metanólicos inibiram o crescimento de ao menos um isolado de bactéria e/ou levedura. Os extratos das linhagens Cyanobium sp. CENA142 e Cyanobacterium sp. CENA169 foram eficientes contra o crescimento de seis bactérias patogênicas. Nos ensaios de inibição de células tumorais, o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiu moderadamente culturas de células 3LL. Os extratos etanólicos de Oxynema sp. CENA135 (20 ?gomL-1) e Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiram as células CT-26. Em ensaios conduzidos com linhagens de células de glioma (U251), câncer de mama (MCF-7) e câncer de pulmão (NCI-H460), o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA136 inibiu 50 % do crescimento das respectivas células tumorais nas concentrações 7,8; 27,1 e 14,0 ?gomL-1. Desta forma, além de filogeneticamente diversas, as cianobactérias isoladas de ambiente marinho do Estado de São Paulo constituem fonte promissora de inibidores de proteases, cianotoxinas e substância bioativas com ação antibacteriana, antifúngica e antitumoral. / The phylum Cyanobacteria is a phylogenetically coherent group, although presenting great diversity, and its systematic have been constantly reviewed. These microorganisms are also targets of biotechnological studies due to the production of toxins and the search for novel substances of pharmacological interest. Among the strains analyzed in this study, sequences of the 16S rRNA gene were generated for seven and, than, analyzed with sequences previously obtained. At least two groups may represent new cyanobacterial genera, while a group of Cyanobium proves to be endemic of Brazilian mangroves. Genes of the proteases inhibitors, aeuruginosin, cyanopeptolin and microviridin, were detected and the production of aeruginosin was confirmed by LC-MS for Nostoc and Cyanobium. The amino acid sequences of microviridin precursor indicated the production of three new variants in fifteen cyanobacterial strains of the genera Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nostoc and Nodosilinea. The genetic potential for production of cylindrospermopsin (cyrJ) was confirmed in twenty-six strains. In five strains of the genera Nostoc and Cyanobium the mcyD, mcyE and mcyG genes, which are involved in the microcystin biosynthesis, were found. The McyG sequence of Nostoc sp. CENA175 was phylogenetically grouped with sequences of microcystin-producing strains. The sxtA and sxtI genes, from saxitoxin biosynthesis, were found in nine strains of the genera Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea and Nostoc. The SxtI sequence of Leptolyngbya sp. CENA134 showed similarity >= 70 % with hypothetical proteins, while the sequences of Nostoc sp. CENA159 and Nostoc sp. CENA160 showed similarity >= 82% with O-carbamoyltransferase. In the phylogenetic analysis, the SxtI sequence of Nostoc sp. CENA160 grouped with sequences of strains that produce saxitoxin. In chemical analysis, the fraction 3 of the Oxynema sp. CENA135 extract revealed a substance with poly-unsaturated fatty acids characteristics and the fraction 2 of Nostoc sp. CENA175 extract indicated an aromatic structure, attached to an aliphatic chain. Other three extracts obtained from Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 and Nostoc sp. CENA184 were promising for the presence of nitrogenous substances. Bioactivity assays revealed that 48 % of the methanolic extracts inhibited the growth of at least one isolate of bacteria and/or yeast. The extracts of Cyanobium sp. CENA142 and Cyanobacterium sp. CENA169 were efficient against six pathogenic bacteria. In the inhibition assays of tumor cells, the DCM extract of Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) moderately inhibited the growth of 3LL cells. Ethanol extracts of Oxynema sp. CENA135 (20 mgomL-1) and Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) were able to inhibit cultures of CT- 26 cells. In tests conducted with glioma cell lines (U251), breast cancer (MCF-7) and lung cancer (NCI-H460), the DCM extract of Cyanobium sp. CENA136 caused 50 % of growth inhibition, respectively, when used at concentrations of 7.8, 27.1 and 14.0 mgomL-1. Thus, besides their phylogenetically diversity, the cyanobacteria strains from marine environment of the São Paulo state are a promising source of protease inhibitors, cyanotoxins and bioactive compounds with antibacterial, antifungal and antitumor activities.