Reservatórios são sistemas aquáticos artificiais que reúnem propriedades semelhantes a rios e lagos, ou seja, eles possuem características dinâmicas horizontais de rios e verticais dos lagos. Devido a estas propriedades, muitos fatores são responsáveis pela distribuição e composição do fitoplâncton tais como: estabilidade da coluna de água, tempo de detenção hidráulico, operação da barragem, disponibilidade de nutrientes, RSFA (radiação solar fotossinteticamente ativa), temperatura. Nos últimos anos, devido às ações antrópicas, os reservatórios estão em processo de eutrofização, que contribui para o florescimento de Cianobactérias, que podem trazer problemas em mananciais e comprometer a saúde da população, pois estes organismos podem produzir toxinas extremamente agressivas. Com isso, torna-se importante o estudo da comunidade fitoplanctônica, no Reservatório de Itupararanga, pois ele é utilizado para recreação, irrigação, abastecimento público dos municípios de Votorantim e Sorocaba e geração de energia elétrica. O objetivo principal desta pesquisa é estudar a variabilidade temporal (variação sazonal, diária e nictemeral) e a heterogeniedade espacial (variação hotizontal e diferentes profundidades) e da comunidade fitoplanctônica e avaliar o potencial tóxico de espécies de Cianobactérias predominantes neste reservatório. Para atingir este objetivo foram realizadas coletas em dois pontos (próximo a barragem e na cabeceira), na estação chuvosa (fevereiro 2011) e seca (julho 2011), com amostragem de 4 em 4 horas, em 10 dias consecutivos e em diferentes profundidades da coluna de água. Foi realizada a caracterização da comunidade quanto a sua estrutura (biomassa e diversidade) e a análise de cianotoxinas (microcistina, cilindrospermopsina e saxitoxina) pelo método ELISA. Para relacionar com as variáveis biológicas foram analisadas variáveis hidrometeorológicas e abióticas. Durante o período estudado, o reservatório de Itupararanga pode ser classificado como polimítico, apresentando estratificação térmica no período chuvoso e circulação da coluna de água no período seco. No período estudado não foram observadas variações da estrutura da comunidade fitoplanctônica nas escalas diária e nictemeral, somente foi observada variação sazonal. A média da densidade fitoplanctônica total foi de 41,86x103 ind.mL-1, na estação chuvosa e 39,31x103 ind.mL-1, na seca. Foi observada alternância de dominância de duas esécies fitoplânctônicas, no período chuvoso houve dominância da Chlorophyceae Monoraphidium contortum, e no seco, da Cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii. Ocorreram altas relações entre nutrientes totais (NT:PT) e dissolvidos (NID:PTD), nos dois período estudados, observando-se assim que não houve limitação de nitrogênio. Não foram detectadas a presença de microcistina e cilindrospermopsina e as concentrações de saxitoxina estiveram abaixo do limite permitido pela Portaria MS n°2.914/2011 (3μg.L-1). Portanto, torna-se essencial a realização de um plano de manejo sustentável na bacia hidrográfica do Sorocaba e Médio Tietê, visando o monitoramento de ocorrência de Cianobactérias e cianotoxinas, para garantir a qualidade da água utilizada pela população do entorno do reservatório de Itupararanga. / Reservoirs are artificial aquatic systems which show similar features to lakes and rivers, like the dynamic horizontal characteristics of rivers and the vertical ones of lakes. Due to these properties, there are many factors which are responsible for the distribution and composition of phytoplankton, as there are: stability of the water column, hydraulic retention time, dam operation, availability of nutrients, photosynthetically active solar radiation (PASR), and temperature. As a result of human actions during the past years, the reservoirs are undergoing a process of eutrophication, and therefore contributing to the growth of cyanobacteria, causing problems for wells and thus compromising the health of the population, as these organisms can produce highly aggressive toxins. The study of phytoplankton in the Itupararanga Reservoirs has so become more and more important, as it is a place for recreation, irrigation, public water supply for the counties Votorantim and Sorocaba, and the generation of electricity. The objective of this research is to study the temporal variability (in a seasonal or daily context) and spatial heterogeneity (horizontal axle and diferents deep) in the phytoplankton and to evaluate the potential toxic of predominant cyanobacteria species in this reservoir. In order to reach this aim, a sample collection took place at two sites- one near the dam and the other near the headwaters- during the rainy season (February 2011) and the dry season (July 2011), at a rhythm of every four hours during 10 consecutive days at different depths of the water column. The Phytoplankton community was characterized in relation to its structure (biomass and diversity) and its analysis of cyanotoxins (microcrystin, cylindospermopsin and saxitoxin), using the ELISA method. In order to relate the biological variables, hydrometeorological and abiotic variables have been analyzed. During the studied period, the Itupararanga Reservoir could be classified as polymictic, showing thermal stratification in the rainy season and circulation of the water column in the dry season. Variations in the phytoplankton structure could not be observed on a daily but only a seasonal basis. The average total phytoplankton density was 41,86x103 ind.mL-1 in the rainy season, and in the dry season 39,31x103 ind.mL-1. Two phytoplankton species altered in their dominance, in the rainy season the Chlorophyceae Monoraphidium contortum showed more presence, whereas in the dry season Cyanobacteria Cylindrospermopsis raciborskii was found in a higher quantity. There was a high relation between the total nutrients (NT:PT) and the dissolved ones (NID:PTD), in both periods, as well as no limitation in the nitrogen level. Microcrystin and cylindrospermposin could not be detected, and the concentrations of saxitoxin were below the limit set by the Brazilian Ministry of Health - MS n°2.914/2011 (3μg.L-1). However, it is essential to achieving a sustainable management plan for the catchment of Sorocaba and Middle Tietê, aimed at monitoring the occurrence of cyanobacteria and cyanotoxins, to ensure the quality of the water used by the population around the Itupararanga Reservoir.

Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixa massa molecular, que tem como principal função a regulação dos níveis de metais nos organismos. A caracterização das MTs da cianobactéria Synechococcus PCC 7942 por eletroforese capilar foi feita em comparação com os padrões comerciais de MTs de rim de cavalo e de fígado de coelho. As MTs de mamíferos apresentam diferentes arranjos moleculares, classificadas em isoformas. Na aplicação da eletroforese capilar como metodologia analítica para a otimização da separação das isoformas existentes, foram investigados a influência da composição da solução eletrolítica, variações da voltagem, comprimento do capilar e diâmetro interno do capilar. Os perfis eletroforéticos das misturas das MTs purificadas a partir de rim de cavalo e fígado de coelho comparados com a de cianobactéria mostraram uma diferenciação no tempo de migração. Para a separação foram testados eletrólitos tais como fosfato, borato e TRIS-HCl, sendo que os melhores resultados foram obtidos com o tampão TRIS-HCl (70 mM, pH 8,2) com adição de 5% de metanol. A separação eletroforética foi testada em capilares de sílica fundida de 75 e 25 m d.i., comprimento de 40, 50 e 60 cm. As soluções das amostras em volume de 327 nL foram introduzidas por injeção hidrodinâmica. As diferenças de potencial testadas foram de 10, 15, 20 e 25 kV. As melhores condições de separação foram atingidas empregado TRIS-HCl com 5% metanol como solução eletrolítica, em capilar de 60 cm e diferença de potencial de 20 kV o que estabilizou a corrente de separação em 42 \'mü\'A. Os resultados mostraram que a eletroforese capilar mostrou-se eficiente para separação das MTs de mamifero e da Synechococcus devido às diferenças de carga e tamanho das moléculas / Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins, which main functions are the regulation of metals levels in the body and detoxification. The capillary electrophoresis (CE) characterization of MT from Synechococcus cyanobacteria was attained by comparison with commercial standards of horse kidney and rabbit liver MTs. The influence of electrolyte, such as phosphate, borate and TRIS-HCl buffers on the separation performance were tested. Also, parameters such as voltage potential, capillary length and capillary inner diameter were investigated to attain optimized separation of mammal and Synechococcus MTs. The electrophoretic profiles of MTs revealed four abundant metallothionein isoforms for the horse kidney sample, one for rabbit liver MTII and two for cyanobacteria Synechococcus. The separation by CE of horse and cyanobacteria MTs mixtures differentiated two sets of signals, the first with four peaks corresponding to the horse sample and the last to Synechococcus. The mixture of rabbit liver MT and cyanobacteria MTs presented a first peak for rabbit MTII and a second for cyanobacteria. Tests were performed trying phosphate, borate and TRIS-HCl buffers, however the best results were attained with TRIS-HCl buffer (70 mM, pH 8.2) with addition of 5% methanol. Different capillary lengths of 40, 50 and 60 cm and two internal diameters of 75 and 25m were tested. Also, voltages of 10, 15, 20 and 25 kV were studied. The best experimental conditions were attained using a 60 cm long capillary, TRIS-HCl plus 5% methanol as electrolyte, the application of 20 kV which allowed maintaining a separation current of 42 \'mü\'A. Results demonstrated that capillary electrophoresis was efficient for separation of MTs of mammals from that of Synechoccocus due their differences on size to charge

A ampla diversidade metabólica das cianobactérias é associada não somente a sua importância nos ciclos biogeoquímicos, mas também a sua distribuição global. Tal característica também é responsável pela capacidade destes organismos em produzir uma ampla variedade de substâncias de estruturas incomuns e atividades de interesse para o homem. Microcystis é um gênero cianobacteriano reconhecido como produtor de mais de duas centenas de produtos naturais, incluindo cianotoxinas. Microcystis aeruginosa é uma espécie frequentemente encontrada em florações, portanto causando preocupações sobre sua influência ecológica, especialmente em corpos d\'água doce utilizados para consumo humano. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi o levantamento da diversidade e quantidade de metabólitos secundários que podem ser produzidos pela espécie, através de análises genômicas, além de variáveis que podem potencialmente interferir nas análises computacionais, procurando-se por padrões na espécie, e comparando-se 18 linhagens de todos os continentes. Foi encontrado o total de 235 agrupamentos relacionados ao metabolismo secundário, categorizados em 12 classes segundo as estruturas de seus produtos, nas 18 linhagens, evidenciando a riqueza de agrupamentos relacionados ao metabolismo secundário encontrados nesta espécie. Destes agrupamentos, os mais abundantes pertencem às categorias dos Terpenos, Híbridos, Bacteriocinas e NRPS. Entre as NRPS, nenhuma foi comum a todas as linhagens. Ainda, a quantidade de agrupamentos variou entre 6 e 21, e a quantidade de categorias de produtos variou entre 4 e 10, mostrando uma distribuição heterogênea de agrupamentos e tipos de metabólitos preditos. Esta distribuição heterogênea foi detalhada para melhor compreensão deste padrão encontrado na espécie. Dos agrupamentos de NRPS, os três mais frequentes foram selecionados para uma análise pormenorizada de sua estrutura e sequência: aeruginosina (15 linhagens), microcistina (11 linhagens), e micropeptina (15 linhagens). O agrupamento de micropeptina encontrado nas linhagens SPC777, TAIHU98 e PCC 9806 se mostrou amplamente dissimilar com relação à referência utilizada, potencialmente indicando um erro de identificação causado pela plataforma antiSMASH utilizada para a localização dos agrupamentos. Análises de colinearidade genômica mostram uma baixíssima sintenia entre os genomas das linhagens em análise, sugerindo frequentes eventos de reorganização genômica. Ainda, análises de pangenoma mostram um cenário em que mais genomas desta espécie são necessários para a estimativa da quantidade total de genes diferentes que a espécie pode possuir, o que é interessante para futuros estudos de procura de metabólitos secundários. Análises do genoma cerne apontam para uma estimativa segura de 1.944 genes comuns a todos os genomas desta espécie, o que corresponde entre 35% e 50% dos genes em cada linhagem. Análises estatísticas apontam para diferentes graus de interferência não linear da quantidade de sequências contíguas na observação de diferentes padrões de outras características genômicas, sugerindo precaução nas expectativas com relação ao metabolismo secundário em caso de linhagens em que a montagem gênica ultrapasse o limite superior aproximado de 100 sequências contíguas. / The wide metabolic diversity of cyanobacteria is associated not only with their importance in biogeochemical cycles, but also with their global distribution. Such a feature is also responsible for the ability of these organisms to produce a wide variety of substances with unusual structures and activities of interest to man. Microcystis is a cyanobacterial genus recognized as a producer of more than two hundred natural products, including cyanotoxins. Microcystis aeruginosa is a species frequently found in cyanobacterial blooms, thus causing concerns about its ecological influence, especially in freshwater bodies used for human consumption. In this way, the objective of this work was the survey of the diversity and quantity of secondary metabolites that can be produced by the species, through genomic analyzes, besides variables that can potentially interfere in the computational analyzes, searching for patterns in the species, and comparing 18 strains from all the continents. A total of 235 clusters, categorized in 12 classes according to the structure of their products, were found in the 18 strains, evidencing the richness of clusters related to the secondary metabolism found in this species. Of these clusters, the most abundant belong to the categories of Terpenes, Hybrids, Bacteriocins and NRPS. Among NRPS, none were common to all strains. Also, the number of groups ranged from 6 to 21, and the number of product categories ranged from 4 to 10, showing a heterogeneous distribution of predicted groupings and types of metabolites. Such a heterogeneous distribution was detailed for a better understanding of this pattern found in the species. Of the NRPS clusters, the three most frequent were selected for a detailed analysis of their structure and sequence: aeruginosin (15 strains), microcystin (11 strains), and micropeptin (15 strains). The micropeptide cluster found in the SPC777, TAIHU98 and PCC 9806 strains was widely dissimilar to the reference, só potentially indicating an identification error caused by the antiSMASH platform used to locate the clusters. Genomic collinearity analyzes showed a very low synteny among the genomes of the strains under analysis, suggesting frequent events of genomic reorganization. Also, pangenome analyzes show a scenario in which more genomes of this species are needed for the estimation of the total amount of different genes the species may possess, which is interesting for future studies conserning secondary metabolites. Coregenome analyzes point to a reliable estimate of 1,944 genes common to all genomes of this species, which corresponds to 30% up to 50% of the genes in each strain. Statistical analyzes point to different degrees of non-linear interference of the number of contiguous sequences on the observation of different patterns of other genomic characteristics, suggesting necessary caution about expectations regarding the secondary metabolism in case of strains in which the gene assembly exceeds the approximate upper limit of 100 contiguous sequences.

O crescimento acelerado da aqüicultura no estado de São Paulo, ou seja, a implantação de pesque-pagues e pisciculturas pode estar causando uma série de problemas ambientais. A contribuição para o processo de eutrofização é uma das conseqüências desses empreendimentos, pois tanto os tanques utilizados na piscicultura como os afluentes em torno desses estabelecimentos, estão sendo eutrofizados pelo excesso de nutrientes. Uma das conseqüências da eutrofização é o aparecimento de florações de cianobactérias, e a principal preocupação está nas toxinas liberadas por estas cianobactérias, que se ingeridas pelos seres humanos e animais, podem causar efeitos de intoxicação, como fraqueza, cefaléia, vômito e dependendo da concentração ingerida pode levar à morte. Desta forma é necessário que haja um programa de controle da qualidade da água dos tanques e reservatórios e também dos peixes que ali são criados, pois florações de cianobactérias vêm sendo encontradas em diversos corpos d\'água. Este estudo teve como foco a determinação da cianotoxina microcistina-LR, empregando técnicas como a extração em fase sólida e a cromatografia líquida para a detecção e quantificação da microcistina-LR em amostras de florações de cianobactérias. Os testes feitos com a extração em fase sólida demonstraram que esse procedimento não se faz necessário para todas as amostras, pois houve casos em que não se obteve diferença nos picos interferentes mais próximos ao tempo de retenção do analito de estudo. Como as matrizes desse tipo de amostras são muito complexas e variam muito conforme o meio em que se encontram, recomenda-se que sejam avaliados caso à caso a necessidade de se promover a extração em fase sólida, pois o mesmo é um processo que demanda um tempo maior de análise e conseqüente aumento nos custos. Foi determinado e validado um método cromatográfico considerado capaz de fornecer dados reproduzíveis e confiáveis, por meio de testes de seletividade, limite de detecção e de quantificação, linearidade, precisão, exatidão e recuperação, conforme critérios de aceitação da Resolução n°899 de 2003, da ANVISA. O limite de detecção do método ficou estipulado em 0,1 µg mL-1, e o limite inferior de quantificação em 0,5 µg mL-1, determinados conforme a relação sinal-ruído proposta pelo Guia de Validação de Métodos Bioanalíticos da ANVISA. A quantificação da microcistina-LR foi feita utilizando o método de superposição de matriz, que minimiza e/ou compensa o efeito de matriz ou de possíveis interferentes presentes na amostra, e a curva analítica obtida y = 1,5888+21,849 x, com um coeficiente de correlação de 0,997 mostra uma boa linearidade. Foram analisadas amostras de florações de cianobactérias, coletadas em pesque-pagues e pisciculturas situadas na região do Alto Mogi (subdivisão da bacia do Mogi Guaçu), conforme o método de extração e análise estudado. / The rapid growth of aquaculture in the state of São Paulo may be causing a number of environmental problems. The contribution to the eutrophication process is among the consequences of these undertakings, given that the tanks used in fish farming as well as the changes around these establishments are becoming eutrophic systems due to excessive nutrients. A frequent consequence of eutrophication in waters is the massive development of cyanobacteria.The occurrence of these blooms induces severe problems, as Microcystis aeruginosa, the most widespread distributed cyanobacteria, which can produce microcystin-LR. Toxic effects of MC have been described in liver, lungs, stomach, and intestine. Deaths in wildlife, livestock and human beings were also associated with microcystin exposition, which can occur directly by ingestion, inhalation, contact, intravenous inoculation of contaminated water (hemodialysis) or indirectly, by the consumption of animals, as fish and mollusks, the major ingestors of cyanobacteria and its toxins. Thus we need a program to control the quality of water tanks and reservoirs and also the fish breeded there, as cyanobacteria blooms have been found in various water bodies. This study focused on the determination of the cyanotoxins microcystin-LR, using techniques such as solid phase extraction and liquid chromatography for the detection and quantification of microcystin-LR in samples of cyanobacteria blooms. Tests performed with solid phase extraction showed that this procedure is not necessary for all the samples because there were cases where no difference was obtained in interfering peaks near the retention time of the analyte studied. As the parent of such samples are very complex and vary greatly, because the extracts contained too much coextrated material that interfered in the LC-UV detection, and depending on the way in which it is recommended to be assessed, case by case, the solid phase extraction needs to be promoted, because it is a process that demands a longer period of analysis and consequently an increase in costs. A liquid chromatography method was established and validated, which is deemed capable of providing reproducible and reliable data, by testing for selectivity, limit of detection and quantification, linearity, precision, accuracy and recovery, in accordance with the acceptance criteria of Resolution No. 899 of 2003 of ANVISA. The detection limit of the method was set at 0.1 µg mL-1, and the lower limit of quantification at 0.5 µg mL-1 determined according to the signal to noise ratio proposed by the Validation Guide of Bioanalytical Methods, ANVISA. Quantification of microcystin-LR was performed using the matrix-matched method, which minimizes and/or offsets the effect of possible matrix interference or present in the sample. The analytical curve obtained y = 1.5888 + 21.849 x, with a coefficient of correlation of 0.997 shows a good linearity. Real aquaculture samples were analyzed that were detected and quantified according to the method developed.

A crescente demanda por água doce de boa qualidade, associada ao aumento na frequência de florações tóxicas de cianobactérias em reservatórios utilizados para consumo humano, levou à publicação da Portaria nº. 518/04 pelo Ministério da Saúde. Entre outros parâmetros de potabilidade, as empresas fornecedoras de água tratada devem realizar o monitoramento de cianotoxinas. Para tanto, métodos analíticos rápidos e precisos para a determinação destes compostos são imprescindíveis. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo empregar a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para o estudo das principais cianotoxinas em território nacional: microcistinas, anatoxina-a(s), cilindrospermopsina e saxitoxinas. Os resultados obtidos estão distribuídos em capítulos específicos dedicados a cada grupo de toxinas. Dessa forma, o primeiro capítulo apresenta um estudo de fragmentação na fase gasosa de ânions de microcistinas em um equipamento do tipo orbitrap. É demonstrado que o modo negativo de ionização por electrospray fornece informações estruturais importantes e complementares ao modo positivo de ionização. Uma abertura seletiva do peptídeo cíclico é proposta e mecanismos discutidos, o que facilita a interpretação de resultados durante a caracterização de variantes desconhecidas. O modelo de fragmentação desenvolvido foi utilizado para identificar a variante [Leu1]MC-LR em um extrato de Microcystis spp. O segundo capítulo descreve metodologias qualitativas de LC/MS para o monitoramento e identificação do organofosforado natural anatoxina-a(s), cuja análise é prejudicada pela ausência de padrões comerciais. A cromatografia de interação hidrofílica foi empregada e mecanismos de fragmentação na fase gasosa propostos, discutindo-se os íons característicos desta estrutura química. Tal modelo permitiu a identificação desta toxina nas cepas de Anabaena oumiana ITEP-25 e ITEP-26 pela primeira vez. O terceiro capítulo disserta sobre os mecanismos de fragmentação na fase gasosa da toxina cilindrospermopsina quando ionizada por electrospray na forma de aduto com metais alcalinos. Diferenças nas vias de fragmentação são demonstradas de acordo com o raio atômico do metal formador do aduto, com implicações práticas na sua determinação cromatográfica. Já o quarto capítulo discute os mecanismos de fragmentação de variantes sulfatadas de saxitoxinas (GTX1e4, GTX2e3, dcGTX2e3, GTX5) após ionização por electrospray no modo positivo e negativo. É demonstrado pela primeira vez que uma conformação estrutural específica do grupamento sulfato explica a intensa eliminação de SO3 observada para as variantes GTX1, GTX2 e dcGTX2 no modo positivo de ionização. Por outro lado, o modo negativo de ionização apresenta vantagens uma vez que a dissociação na fonte é insignificante se comparada à dissociação observada no modo positivo. Como resultado, métodos quantitativos no modo negativo podem apresentar maior sensibilidade, permitindo a detecção destas toxinas em amostras ambientais em quantidades mais baixas. De maneira geral, conclui-se que a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas é ferramenta poderosa para a análise quali e quantitativa das principais cianotoxinas, podendo ser amplamente empregada para o monitoramento de água para consumo humano. / The increasing occurrence of toxic cyanobacterial blooms in reservoirs used to supply drinking water for human consumption has prompted the publication of resolution 518/04 by the Brazilian Ministry of Health. Among other quality requirements, the monitoring of cyanotoxins in treated water is mandatory for companies responsible for potable water distribution. Therefore, precise and rapid analytical methods are essential. In this context, the aim of this work is to employ liquid chromatography coupled to mass spectrometry to study the most important cyanotoxins in our country: microcystins, anatoxin-a(s), cylindrospermopsis and saxitoxins. The obtained results are distributed in four chapters, each one dedicated to a single group of toxins. In this way, chapter one presents the gas-phase fragmentation behavior of deprotonated microcystins in an Orbitrap instrument. It is demonstrated that electrospray negative ionization can provide significant structural information about microcystins. These results are complementary to the positive ionization mode. A selective ring opening process is proposed and possible mechanisms are discussed, which may facilitate data interpretation when unknown variants are considered. The general fragmentation model was further applied to the characterization of [Leu1]MC-LR in a Microcystis spp. cell extract. The second chapter describes qualitative analytical methods for the identification of anatoxin-a(s), a natural organophosphate whose determination is hampered by the lack of commercial standards. Hydrophilic interaction liquid chromatography was employed and fragmentation mechanisms proposed, identifying the characteristic product ions of this toxin. The developed methods were further used to identify anatoxin-a(s) for the first time in Anabaena oumiana strains ITEP-25 and ITEP-26. The third chapter presents data related to the gas-phase fragmentation behavior of cylindrospermospin when this toxin is ionized as metal adducts. Different fragmentation pathways are accessed depending on the atomic radius of the metal cation involved. Practical implications for the chromatographic analysis of this toxin are presented. The last chapter describes the fragmentation behavior of sulphate-containing saxitoxin variants (GTX1&4, GTX2&3, dcGTX2&3, GTX5) after electrospray ionization in both the positive and negative modes. A mechanism for the intense SO3 elimination from [M+H]+ ions from GTX1, GTX2 and dcGTX2 is proposed for the first time and relies on a specific structure conformation. On the other hand, the negative ionization mode shows much less in-source dissociation when compared to the positive mode. As a consequence, methods based on negative ionization might be more sensitive for sulfate-containing variants, allowing the detection of lower amounts of these toxins in environmental samples. At the end, it can be concluded that liquid chromatography is a well-suited and powerful technique for the qualitative and quantitative analysis of cyanotoxins, being an invaluable contribution to water safety evaluation.

As cianobactérias produzem substâncias tóxicas que são conhecidas como cianotoxinas. Inúmeros casos de intoxicações em humanos e animais têm sido reportados nos mais diversos países. Várias cianobactérias tóxicas são planctônicas e desenvolvem-se em ambientes de água doce formando florações intensas sob condições favoráveis. Florações de cianobactérias têm sido observadas durante todo o ano no reservatório Salto Grande (Americana, SP) que possui intenso uso recreacional, além de servir para abastecimento público de água, pesca e irrigação de culturas. Portanto, avaliar a comunidade de cianobactérias e identificar a presença de genes de cianotoxinas, bem como detectar a produção de toxinas em florações do reservatório de Salto Grande é de fundamental importância para os órgãos de saúde pública para permitir a utilização segura desses corpos d\'água. Neste estudo, três amostras de água com florações de cianobactérias foram analisadas, as quais foram coletadas em diferentes períodos, em dois locais com intenso uso recreacional. As investigações sob microscópio óptico das amostras preservadas com solução de lugol identificaram quinze gêneros cianobacterianos, sendo dois deles até então desconhecidos para o local (Plantothrix e Komvophorum). As contagens de células usando a técnica de Utermöl realizadas para duas das amostras de água mostraram valores que excedem os recomendados pela Portaria Nº 2914 do Ministério da Saúde, a qual estabelece análises e coletas semanais da água acima de 20.000 células/mL. O potencial genético para produção das toxinas cilindrospermopsina, saxitoxina e microcistina foi avaliado a partir da extração do DNA genômico total das amostras ambientais e observou-se amplificação por PCR dos genes cyrJ, sxtA, sxtI, mcyE e mcyG. Os produtos da PCR foram sequenciados e as análises filogenéticas das sequências de aminoácidos mostraram que elas se agruparam com sequências homólogas de cianobactérias conhecidas como produtoras das respectivas toxinas. No entanto, as análises químicas de LC-MS/MS das amostras ambientais buscando as três referidas toxinas detectaram a presença somente de microcistina. As variantes de microcistinas encontradas foram as MC-LR e MC-RR. Os resultados deste estudo contribuem para o aumento de informações sobre o reservatório Salto Grande, e mais uma vez alertam para a preocupante situação deste reservatório em relação à saúde pública. / Cyanobacteria produce toxic substances which are known as cyanotoxins. Numerous cases of poisoning in humans and animals have been reported in several countries. Several toxic cyanobacteria are planktonic and develop in freshwater environments forming intense blooms under favorable conditions. Cyanobacterial blooms have been observed throughout the year in the Salto Grande reservoir (Americana, SP) that has intense recreational use, besides serves to public water supply, fisheries and crop irrigation. Therefore, evaluate cyanobacterial community and identify the presence of cyanotoxin genes as well as assess the production of toxins in blooms from the Salto Grande reservoir is of fundamental importance to public health agencies to allow safe uses of these water bodies. In this study, three water samples with cyanobacterial bloom were analyzed, which were collected at different periods, in two locations with intense recreational use. Investigations under optical microscope of the samples preserved with Lugol\'s iodine solution identified fifteen cyanobacterial genera, being two of them hitherto unknown to the location (Plantothrix and Komvophorum). Cell counts using the Utermöl technique performed for two water samples showed values exceeding those recommended by the Regulation Nº 2.914 of the Brazilian Ministry of Health, which establish weekly analyzes and sampling of water above 20,000 cells/mL. The genetic potential for production of the toxins cylindrospermopsin, saxitoxin and microcystin was evaluated using total genomic DNA from the environment samples and it was observed PCR amplification of the genes cyrJ, sxtA, sxtI, mcyE and mcyG. The PCR products were sequenced and phylogenetic analyses of amino acid sequences showed that they grouped with homologous sequences of known cyanobacterial producers of the respective toxins. However, the chemical analyzes of LC-MS/MS of the environmental samples searching for the three referred toxins detected only the presence of microcystin. The microcystin variants found were MC-LR and MC-RR. The results of this study contribute to the increase of information on the Salto Grande reservoir, and once again warming to the alarming situation of this reservoir related to public health.

A ampla diversidade metabólica das cianobactérias é associada não somente a sua importância nos ciclos biogeoquímicos, mas também a sua distribuição global. Tal característica também é responsável pela capacidade destes organismos em produzir uma ampla variedade de substâncias de estruturas incomuns e atividades de interesse para o homem. Microcystis é um gênero cianobacteriano reconhecido como produtor de mais de duas centenas de produtos naturais, incluindo cianotoxinas. Microcystis aeruginosa é uma espécie frequentemente encontrada em florações, portanto causando preocupações sobre sua influência ecológica, especialmente em corpos d\'água doce utilizados para consumo humano. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi o levantamento da diversidade e quantidade de metabólitos secundários que podem ser produzidos pela espécie, através de análises genômicas, além de variáveis que podem potencialmente interferir nas análises computacionais, procurando-se por padrões na espécie, e comparando-se 18 linhagens de todos os continentes. Foi encontrado o total de 235 agrupamentos relacionados ao metabolismo secundário, categorizados em 12 classes segundo as estruturas de seus produtos, nas 18 linhagens, evidenciando a riqueza de agrupamentos relacionados ao metabolismo secundário encontrados nesta espécie. Destes agrupamentos, os mais abundantes pertencem às categorias dos Terpenos, Híbridos, Bacteriocinas e NRPS. Entre as NRPS, nenhuma foi comum a todas as linhagens. Ainda, a quantidade de agrupamentos variou entre 6 e 21, e a quantidade de categorias de produtos variou entre 4 e 10, mostrando uma distribuição heterogênea de agrupamentos e tipos de metabólitos preditos. Esta distribuição heterogênea foi detalhada para melhor compreensão deste padrão encontrado na espécie. Dos agrupamentos de NRPS, os três mais frequentes foram selecionados para uma análise pormenorizada de sua estrutura e sequência: aeruginosina (15 linhagens), microcistina (11 linhagens), e micropeptina (15 linhagens). O agrupamento de micropeptina encontrado nas linhagens SPC777, TAIHU98 e PCC 9806 se mostrou amplamente dissimilar com relação à referência utilizada, potencialmente indicando um erro de identificação causado pela plataforma antiSMASH utilizada para a localização dos agrupamentos. Análises de colinearidade genômica mostram uma baixíssima sintenia entre os genomas das linhagens em análise, sugerindo frequentes eventos de reorganização genômica. Ainda, análises de pangenoma mostram um cenário em que mais genomas desta espécie são necessários para a estimativa da quantidade total de genes diferentes que a espécie pode possuir, o que é interessante para futuros estudos de procura de metabólitos secundários. Análises do genoma cerne apontam para uma estimativa segura de 1.944 genes comuns a todos os genomas desta espécie, o que corresponde entre 35% e 50% dos genes em cada linhagem. Análises estatísticas apontam para diferentes graus de interferência não linear da quantidade de sequências contíguas na observação de diferentes padrões de outras características genômicas, sugerindo precaução nas expectativas com relação ao metabolismo secundário em caso de linhagens em que a montagem gênica ultrapasse o limite superior aproximado de 100 sequências contíguas. / The wide metabolic diversity of cyanobacteria is associated not only with their importance in biogeochemical cycles, but also with their global distribution. Such a feature is also responsible for the ability of these organisms to produce a wide variety of substances with unusual structures and activities of interest to man. Microcystis is a cyanobacterial genus recognized as a producer of more than two hundred natural products, including cyanotoxins. Microcystis aeruginosa is a species frequently found in cyanobacterial blooms, thus causing concerns about its ecological influence, especially in freshwater bodies used for human consumption. In this way, the objective of this work was the survey of the diversity and quantity of secondary metabolites that can be produced by the species, through genomic analyzes, besides variables that can potentially interfere in the computational analyzes, searching for patterns in the species, and comparing 18 strains from all the continents. A total of 235 clusters, categorized in 12 classes according to the structure of their products, were found in the 18 strains, evidencing the richness of clusters related to the secondary metabolism found in this species. Of these clusters, the most abundant belong to the categories of Terpenes, Hybrids, Bacteriocins and NRPS. Among NRPS, none were common to all strains. Also, the number of groups ranged from 6 to 21, and the number of product categories ranged from 4 to 10, showing a heterogeneous distribution of predicted groupings and types of metabolites. Such a heterogeneous distribution was detailed for a better understanding of this pattern found in the species. Of the NRPS clusters, the three most frequent were selected for a detailed analysis of their structure and sequence: aeruginosin (15 strains), microcystin (11 strains), and micropeptin (15 strains). The micropeptide cluster found in the SPC777, TAIHU98 and PCC 9806 strains was widely dissimilar to the reference, só potentially indicating an identification error caused by the antiSMASH platform used to locate the clusters. Genomic collinearity analyzes showed a very low synteny among the genomes of the strains under analysis, suggesting frequent events of genomic reorganization. Also, pangenome analyzes show a scenario in which more genomes of this species are needed for the estimation of the total amount of different genes the species may possess, which is interesting for future studies conserning secondary metabolites. Coregenome analyzes point to a reliable estimate of 1,944 genes common to all genomes of this species, which corresponds to 30% up to 50% of the genes in each strain. Statistical analyzes point to different degrees of non-linear interference of the number of contiguous sequences on the observation of different patterns of other genomic characteristics, suggesting necessary caution about expectations regarding the secondary metabolism in case of strains in which the gene assembly exceeds the approximate upper limit of 100 contiguous sequences.

Cyanobacteria produce a variety of secondary metabolites which possess amongst others antifungal, antibacterial, and antiviral properties. Being primary producers they are also a vital component within the food web. However, certain strains also produce toxic metabolites such as the hepatotoxins microcystin (MC) and nodularin (NOD). Their toxicity in combination with the increasing global occurrence has resulted in a drinking water guideline limit of 1 μg L-1 being issued by the World Health Organisation (WHO). However, these toxins are not only present in water, but can be accumulated by fish and shellfish. Currently, no regulations regarding cyanotoxin contaminated seafood has been established despite similar toxicity to routinely monitored marine toxins such as domoic acid (DA). To facilitate regular monitoring, a high performance liquid chromatography photo diode array (HPLC-PDA) analysis method for the detection of DA was optimised to enable the simultaneous detection of DA and nine cyanotoxins. This method was then utilised to determine cyanotoxin concentration in laboratory cyanobacteria strains. To assess the accumulation and depuration of cyanotoxins in the common blue mussel Mytilus edulis, three feeding trials were performed. During these, mussels were exposed to two cyanobacteria strains, Nodularia spumigena KAC66, Microcystis aeruginosa PCC 7813, both individually and simultaneously. A rapid dose dependent accumulation of cyanotoxins was observed with maximum concentration of 3.4 -17 μg g-1 ww accumulated by M. edulis, which was followed by a much slower depuration observed. During the final feeding trial, with N. spumigena KAC 66 and M. aeruginosa PCC7813, cyanotoxins were still detectable following 27 days of depuration. Mortality in all studies was 7% or less indicating that most mussels were unaffected by the maximum dose of 480 μg L-1 NOD (feeding study 1), 390 μg L-1 MC (feeding study 2), or 130 μg L-1 total cyanotoxins (feeding trial 3), respectively. Mortality in negative control tanks was lower throughout all three feeding trials ( < 1 - 2.6%). Consumption of a typical portion size (20 mussels) would result in ingestion of cyanotoxins at levels significantly higher than the WHO recommended tolerable daily intake (TDI) of 2.4 μg NOD and/or MCs for a 60 kg adult. This value was exceeded not only during the exposure period (maximum levels 270 - 1370 μg cyanotoxins per 20 mussels), but also at the end of the depuration period 39-600 μg cyanotoxins per 20 mussels. These results illustrated that cyanotoxin monitoring of seafood should be considered not only during, but also following bloom events. In an attempt to investigate the cyanotoxin budget of the experimental system, not only mussels, but cyanobacteria cultures, the tank water, and the mussel faeces were also analysed for their cyanotoxin content. Results showed that large quantities of MCs and NOD were unaccounted for during all exposure trials. The combined effect of cyanotoxin metabolism in M. edulis, biotic and/or abiotic degradation, protein binding, and losses during the extraction and analysis were thought to have contributed to the unaccounted cyanotoxin fraction. Mussel flesh was analysed for the presence of glutathione or cysteine conjugates, however, there was no evidence of their occurrence in the samples tested. Due to these discrepancies in the toxin budget of the system, the introduction of correction factors for the analysis of cyanotoxins in M. edulis was suggested in order to protect the general public.

Fundamental studies for the improvement of photo-microbial fuel cells (pMFCs) within this work comprised investigations into ceramic electrodes, toxicity of metal-organic frameworks (MOFs) and hot-pressing of air-cathode materials. A novel type of macroporous electrode was fabricated from the conductive ceramic Ti2AlC. Reticulated electrode shapes were achieved by employing the replica ceramic processing method on polyurethane foam templates. Cyclic voltammetry of these ceramics indicated that the application of potentials larger than 0.5 V with regard to a Ag/AgCl reference electrode results in the surface passivation of the electrode. Ti2AlC remained conductive and sensitive to redox processes even after electrochemical maximisation of the surface passivation, which was shown electrochemically and with four terminal sensing. Application of macroporous Ti2AlC ceramic electrodes in pMFCs with green algae and cyanobacteria resulted in higher power densities than achieved with conventional pMFC electrode materials, despite the larger surface area of the Ti2AlC ceramic. The effect of electrode surface roughness and hydrophobicity on pMFC power generation and on cell adhesion was examined using atomic force and confocal microscopy, contact angle measurements and long-term pMFC experiments. The high surface roughness and fractured structure of Ti2AlC ceramic was beneficial for cell adhesion and resulted in higher pMFC power densities than achieved with materials such as reticulated vitrified carbon foam, fluorine doped tin oxide coated glass or indium tin oxide coated plastic. Toxicity of the MOF MIL101 and its amine-modified version MIL-101(Cr)-NH2 on green algae and cyanobacteria was assessed on the basis of both growth in liquid culture and by exclusion zones of agar colonies around MOF pellets. MOF MIL101 was found harmless in concentrations up to 480 mg L-1 and MIL-101(Cr)-NH2 did not exhibit toxic effects at a concentration of 167 mg L-1. Air-cathodes were produced from a range of carbon materials and ion-exchange membranes. Hot-pressing of Zorflex Activated Carbon Cloth FM10 with the proton-selective Nafion® 115 membrane provided the best bonding quality and pMFC performance.

As cianobactérias são procariotos fotossintetizantes capazes de sobreviver em ambientes com condições adversas, inclusive na presença de metais pesados tal como o cádmio (Cd). Alguns mecanismos celulares de tolerância a metais pesados são o efluxo de íons e destoxificação intracelular. A proteína metalotioneína, a qual foi purificada e seqüenciada na cianobactéria Synechococcus sp. PCC7942, possui a capacidade de quelar alguns metais. A análise do produto gênico (RNAm e/ou proteínas) têm trazido informações interessantes sobre o metabolismo de células submetidas a situações estresse. Esse estudo teve como objetivo analisar as respostas das células da cianobactéria Synechococcus leopoliensis PCC7942 ao Cd. Para isto, foi analisado o padrão de crescimento das culturas, o acúmulo de Cd e a expressão de proteínas da cianobactéria na presença do metal. A concentração máxima de Cd tolerável pela cianobactéria de 3 µM foi determinada através do monitoramento do crescimento de culturas submetidas a diferentes concentrações do metal através da análise de DO750nm. As culturas crescidas nessa concentração do Cd apresentaram um prolongamento na fase de adaptação e maior tempo de duplicação comparando-se as culturas controles (sem metal). O cádmio acumulado pelas células analisado usando GFAAS apresentou valores variando entre 1,0 e 95 µg Cd•g-1 massa fresca, dependendo da fase de crescimento. A análise da especiação do Cd no meio de cultura BG-11 mostrou que havia disponível para as células 0,69 µM de Cd+2 quanto se utilizava a quantidade máxima tolerável (3 µM). A análise de expressão diferencial de proteínas foi feita em culturas expostas a duas concentrações do metal, 3 µM (tolerável) e 100 µM (letal), durante 1 hora, as quais mostraram acúmulo de 15 e 30 µg Cd•g-1 massa fresca, respectivamente. A maioria das proteínas da cianobactéria separadas por eletroforese bidimensional (pH 3-10 e 4,5-5,5) mostrou pontos isoelétricos ácidos, entre a faixa de pH 4 e 6, e a presença de várias isoformas. Trinta proteínas foram expressas diferencialmente, sendo que no tratamento com 3 µM de Cd, duas proteínas foram induzidas e 11 reprimidas, e no tratamento com 100 µM, duas proteínas foram induzidas e 20 reprimidas. Entre as proteínas reprimidas, duas foram comuns em ambos os tratamentos, enquanto que as duas proteínas induzidas em cada tratamento foram diferentes. Algumas dessas proteínas identificadas através de MALDI-TOF foram a rubisco, a qual foi reprimida em 3 µM de Cd; uma proteína da capa do carboxissoma, a qual foi induzida na presença de 100 µM de Cd; a proteína ligadora a DNA (Dpsa) e a isoleucil t-RNA sintetase, ambas induzidas em 3 µM de Cd e reprimidas em 100 µM de Cd. Dessa forma, esses dados mostraram que duas das proteínas afetadas pelo Cd são componentes do sistema fotossintetizante (rubisco e capa protéica do carboxissoma), uma é expressa em condições de estresse oxidativo (Dpsa) e a outra está relacionada com a síntese de proteínas contendo isoleucina (isoleucil-tRNA sintetase). / Cyanobacteria are photosynthetic prokaryotes capable of surviving in adverse environmental conditions, including the presence of heavy metals such as cadmium (Cd). Some cellular mechanisms of heavy metal tolerance are ion efflux and intracellular detoxification. The metallothionein protein, which was purified and sequenced in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942, possesses the ability to bind some metals. The analysis of gene products (mRNA and/or proteins) has provided interesting information about cell metabolism under stress conditions. The aim of this study was to analyze the Cd response of the cyanobacterium S. leooliensis PCC7942 cells. For this purpose, the pattern of culture growth, cadmium accumulation, and cyanobacterial protein expression in the presence of the metal was analyzed. The maximum tolerable Cd concentration of 3 µM by the cyanobacterium was determined by monitoring culture growth submitted to different concentrations of the metal using OD750nm analysis. The cultures grown in this Cd concentration had an extended lag phase and a higher doubling time compared to the control cultures (without metal). Cadmium accumulated by the cells analyzed using GFAAS showed values varying between 1.0 and 95 µg Cd•g-1 fresh matter, depending on the growth phase. Speciation analysis of Cd in the growth medium BG-11 showed that 0.69 µM of Cd2+ was available to the cells when the maximum tolerable amount was used (3 µM). Analysis of the proteins with differential expression was done using cultures exposed for 1 hour to two metal concentrations, 3 µM (non-lethal) and 100 µM (lethal), which showed accumulation of 15 and 30 µg Cd•g-1 fresh matter, respectively. The majority of the cyanobacterial proteins separated by two-dimensional electrophoresis (pH 3-10 and 4,5-5,5) showed pI between pH 4 and 6, and the presence of several isoforms. Thirty proteins were differentially expressed, where two proteins were up-regulated and 11 down-regulated in the treatment with 3 µM of Cd and two proteins were up-regulated and 20 down-regulated in the treatment with100 µM of Cd. Among the down-regulated proteins, two were common in both treatments while the two up-regulated proteins from each treatment were different. Some of the proteins identified by MALDI-TOF were rubisco, which was down-regulated in 3 µM of Cd; a carboxysome shell protein, which was up-regulated in100 µM of Cd; the DNA-binding protein, Dpsa, and a isoleucyl-tRNA sinthetase, both up-regulated in 3 µM of Cd and down-regulated in100 µM of Cd. Thus, these data showed that the two proteins affected by Cd are components of the photosynthetic system (rubisco and carboxysome shell protein), one is expressed under oxidative stress condition (Dpsa) and the other one is related to protein synthesis containing isoleucine (isoleucyl-tRNA sinthetase).