Les cyanobactéries des genres Microcystis et Planktothrix sont des micro-organismes capables de proliférer dans de nombreux plans d'eau douce. Ces proliférations sont associées à des risques pour la santé humaine et animale en raison de la production de produits naturels, parmi lesquels des toxines. Ces molécules présentent une diversité de structure chimique de d'activités biologiques d'intérêt pour l'industrie pharmaceutique et biotechnologique. Nous avons revisité le potentiel en produits naturels de Microcystis et Planktothrix. Par des approches complémentaires de biologie moléculaire, génomique et transcriptomique, nous avons caractérisé des gènes impliqués dans la synthèse de ces produits naturels ainsi qu'exploré leur évolution et la régulation de leur expression. Ces travaux ont permis de mettre à jour une distribution, des évènements évolutifs et des profils d'expression surprenants et permettent d'envisager de nouvelles applications pour les produits naturels. / Microcystis and Planktothrix are cyanobacterial genus commonly proliferating in freshwater ecosystems. These blooms are associated with human and animal health threat because of synthesis of natural products and cyanotoxins. These compounds are of great chemical diversity and of interest for biotechnological and pharmaceutical applications. We revisited the natural products potential of Microcystis and Planktothrix. Combining molecular biology, genomics and transcriptomics investigations, we characterized natural products gene clusters. We studied their distribution, evolution and transcription as well. This work uncovered new distribution pattern, evolutionary events and unexpected expression patterns. These insights will allow new investigations and applications for cyanobacterial natural products.

Thesis (Ph. D.)--Joint Program in Biological Oceanography (Massachusetts Institute of Technology, Dept. of Biology; and the Woods Hole Oceanographic Institution), 2005. / Includes bibliographical references (p. 157-171). / Bacteriophage have been proposed to be the most abundant organisms on the planet, at an estimated 10³¹ particles globally (Hendrix et al., 1999). The majority of bacteriophage isolates (96%) are double-stranded DNA tailed phages (Caudovirales). These phages possess a distinctive icosehedral head, with a protein tail structure protruding from a single vertex. This organelle determines host specificity and provides the mechanism of passage of the phage genome into the host cell. Phages infecting differing microbial hosts may have access to a global pool of genes, albeit at different levels. Marine cyanobacteria of the genera Prochlorococcus and Synechococcus are numerically dominant photosynthetic cells in the large oligotrophic gyres of the open oceans, and contribute an estimated 30% to the oceanic photosynthetic budget. Cyanophages have been isolated which propagate on many strains of Synechococcus and Prochlorococcus. Cyanophages can effect community structure and succession through lytic infection of their hosts, and have implications in lateral gene transfer, mediated through lysogeny, mixed infections, pseudolysogeny, and transduction. / (cont.) The broad host ranges (between genera) observed in some phages indicates that lateral gene transfer is not confined to cells of the same strain. These phage/host interactions begin by host recognition by the tail of the infecting phage. Few studies have examined the structural proteins of cyanophage, partially due to the lack of a robust protocol for the growth and purification of phage particles. Cyanophage Syn5 is a short-tailed phage isolated from the Sargasso Sea by Waterbury and Valois (1993) which infects Synechococcus strain WH8109. Methods of growing the host cells and the phage, and concentrating the phage by PEG precipitation were developed. These methods led to highly concentrated purified phage stocks, to titers of 1012 particles/ml. Preliminary characterization of the growth of Syn5 gave a burst size of approximately 30 phage/cell and a lytic period of approximately 10 hours when inoculated into exponentially growing host cells acclimated to a temperature of 26⁰C and a light intensity of 50[mu]E m⁻² s⁻¹. Isolation of the phage nucleic acid yielded dsDNA molecules of approximately 40kb. The Syn5 particles were comprised of twelve structural proteins, as determined by SDS-PAGE. / (cont.) The most intense band on the gel was assigned to the capsid protein of Syn5 ([approx.] 35kDa). However, it was not possible to distinguish putative tail proteins via this method. Purified Syn5 particles were sent to the Pittsburgh Bacteriophage Institute for genome sequencing. The completed Syn5 genome was 46,214 bp long with a 237bp terminal repeat. Annotation of the completed Syn5 genome identified 61 putative ORFs, and revealed that Syn5 appeared closely related to the enteric phage T7 and cyanophages P-SSP7 and P60, as determined by gene similarity and synteny, although the genome was [approx.] 10kb longer than T7. Syn5 appeared to possess a more extensive DNA replisome that T7, containing copies of genes that encoded proteins of known T7 host co-factors, such as thioredoxin, utilized by the T7 DNAP. Several large ORFs were identified between the gene encoding the putative tail fiber and the gene encoding the putative terminase. These ORFs encoded proteins similar to some fibrous sequences within the NCBI non- redundant (nr) gene sequence database as of March, 2005; but had unknown functions within the phage. Unlike other recently sequenced cyanophages, SynS did not contain any photosynthetic genes. / (cont.) The structural proteins of SynS, as visualized by SDS-PAGE, were characterized by mass-spectroscopy and N-terminal sequencing. This allowed the assignment of sequences to putative ORFs within the Syn5 genome. The Syn5 particle was comprised of eleven discreet protein chains of molecular weight 152kDa, 139kDa, 99kDa, 90kDa, 66kDa, 60kDa, 47kDa, 35kDa, 22kDa, 21kDa, and 16kDa. The identified proteins included the portal, capsid, two tail tube proteins, and three internal virion proteins. Each of the genes encoding these proteins were found in the same gene order in the Syn5 genome as the corresponding genes were ordered in the T7 genome. There were three unidentifiable proteins within the particle (66kDa, 47kDa, and 16kDa). These mapped to the area of the SynS genome between the gene encoding the putative tail fiber and the gene encoding the putative terminase. No minor capsid or decorative capsid proteins were detected. The copy numbers of the corresponding protein chains were similar to those known for T7, with the exception of the tail fiber, which was present at a number of three chains per particle in comparison to T7's eighteen per particle. / (cont.) Polyclonal antibodies were raised against Syn5 particles. A Western blot with these antibodies showed that the tail fiber and the two unknown fibrous sequences were highly antigenic. This evidence implies that the unknown structures may act as host recognition proteins in addition to the tail fiber. Characterization of these novel proteins may provide insight to the host recognition abilities of cyanophages. An additional study was also carried out, investigating the high temperature limit of the growth of phage P22. The results revealed that the production of infectious particles was limited by the temperature sensitivity of the folding and assembly of the P22 tailspike protein. This work has been published and is included in the Appendix. / by Welkin Hazel Pope. / Ph.D.

Microalgas e cianobactérias têm sido amplamente recomendadas para biomonitoração de metais pesados e outros poluentes, sendo considerados indicadores sensíveis às alterações ambientais e utilizados como organismos testes na regulamentação dos níveis de metal. Estes micro-organismos fotossintetizantes são produtores primários da base da cadeia alimentar aquática e são os primeiros a serem afetados pela poluição por metais pesados. O cobre é um metal normalmente considerado como nutriente essencial para a vida aquática mas pode ser tóxico para algumas espécies. Portanto, neste estudo foram avaliados o efeito tóxico e a bioacumulação de cobre (II) em quatro espécies de micro-organismos fotoautotróficos componentes do fitoplâncton dulcícola, duas cianobactérias filamentosas (Anabaena sp. e Oscillatoria sp) e duas microalgas da classe das clorofíceas (Monorraphidium sp. e Scenedesmus sp.). O meio de cultivo utilizado nos ensaios foi o ASM-1 com e sem a presença de cobre (0,6 mg/L a 12 mg Cu2+/L) onde, o efeito tóxico do metal foi monitorado por contagem celular para as microalgas e por peso seco para as cianobactérias. A bioacumulação do metal foi avaliada da mesma forma para todos os micro-organismos, através de coletas de amostras no decorrer do experimento e determinação da concentração de cobre em solução por espectrometria de absorção atômica com chama. Os resultados obtidos mostram que o efeito tóxico do metal é diretamente proporcional à concentração inicial para os micro-organismos estudados, mas que o cobre (II) foi mais tóxico para as cianobactérias que para as microalgas verdes. A bioacumulação teve uma relação direta com o efeito tóxico do metal sobre os micro-organismos. Os resultados obtidos permitem sugerir que cobre (II) tem efeito negativo no fitoplâncton, inibindo o crescimento e alterando parâmetros metabólicos como a fotossíntese. A bioacumulação do metal pode comprometer os níveis tróficos da cadeia alimentar, afetando seu transporte para seres superiores / Microalgal and cyanobacterial cells are widely used in the biomonitoring of metal contaminated areas as well as other pollutant agents, being considered sensitive microorganisms in relation to environmental changes and also used as test-organisms in the regulation of low levels of metals. These photosynthesizing microorganisms are primary producers in the aquatic food chain, and are the first ones to be affected by heavy metal pollution. Copper is a metal usually considered as an essential nutrient for aquatic forms of life, however toxic for some species. In this way, in the present study, the toxic effect of copper ion and its bioaccumulation by photoautotrophic microbes from freshwater phytoplankton: two filamentous cyanobacteria (Anabaena sp. and Oscillatoria sp) and two chlorophyte microalgae Monorraphidium sp. and Scenedesmus sp.). The culture medium used in the tests was the ASM-a medium in absence and contaminated with copper ion (0,6 mg/L to 12 mg Cu2+/L). The toxic effect of copper was monitored through cell count (microalgal cells) and dry weight measurements (cyanobacterial cells), and copper bioaccumulation was evaluated for all the species tested, through determination of the residual metal concentration in solution, by flame atomic absorption spectrometry. Results obtained indicated that the toxic effect of the metal was directly proportional to the initial concentration of the ion for all the species tested; however, copper ion was more toxic to cyanobacterial than to microalgal cells. The bioaccumulation of copper was directly related to the toxic effect of the ion over the microorganisms. Results obtained suggest that copper ion has a negative effect on the phytoplankton, inhibiting cell growth and also affecting metabolic parameters such as photosynthesis. The bioaccumulation of the metal can markedly affect the trophic levels in the food chain, thus affecting its transport to higher species

Le milieu marin représente une source d'inspiration pour les chimistes, grâce à l'incroyable diversité structurale des composés isolés des organismes et micro-organismes marins. Parmi eux, la laxaphycine B, un lipopeptide cyclique isolée de la cyanobactérie Anabaena torulosa est comme la plupart des peptides marins produit selon une voie de biosynthèse non ribosomale « NRPS /PKS » et présente une forte activité cytotoxique sur différentes lignées cellulaires cancéreuses. Une des problématiques de ce lipopeptide est l'absence d'information sur son mécanisme d'action. Afin d'identifier des cibles potentielles, mais surtout d'entreprendre des études des relations structure-activités, la confirmation de sa structure est nécessaire. C'est dans cette optique que nous avons entrepris la synthèse de la laxaphycine B en synthèse peptidique en phase solide (SPPS). Dans un premier temps, nous avons entrepris la synthèse des quatre aminoacides non ribosomaux. Dans un second temps, nos efforts se sont concentrés sur le développement d'une stratégie de synthèse pour l'obtention de ce lipopeptide. En dernier lieu, nous avons étudié la structure secondaire possible de la laxaphycine B, afin d'apporter une explication sur son mécanisme d'action. / Marine environment is a source of inspiration for chemists, thanks to the incredible structural diversity isolated from marine organisms and microorganism's compounds. Among them, laxaphycine B, a cyclic lipopeptide isolated from Anabena torulosa cyanobacteria, as like most marine peptides produced by a non-ribosomal biosynthesis pathway "NRPS/PKS”. Furthemore, this peptide has shown a strong cytotoxic activity on various cancer cell lines. One of the problems of this lipopeptide, is the lack of information on its mechanism of action. To identify potential targets and also to study in structure activity relationships, confirmation of its structure is necessary. It is in this context that we undertook laxaphycine B's synthesis using SPPS. In a first step, the four non-ribosomal aminoacids have been synthesized. In a second step, our efforts have focused on the development of a synthesis strategy to obtain laxaphycine B. Lastly, we studied the laxaphycin B's secondary structure to understand its mechanism of action.

A presente pesquisa propôs avaliar a presença de cianobactérias, tanto quantitativamente como qualitativamente e clorofila-a quantitativamente, em relação à legislação CONAMA Nº 357/05, em um sistema de tratamento de lagoas de estabilização com pré e pós-tratamento físico-químico, além de avaliar o comportamento de parâmetros convencionais, como Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO), Demanda Química de Oxigênio (DQO), Nitrogênio amoniacal (NNH3), Fósforo (P), Sólidos Suspensos Totais (SST), Potencial Hidrogeniônico (pH). Para tanto, utilizou-se a Estação de Tratamento de Efluentes da Riviera de São Lourenço - Bertioga - SP, para o estudo em questão, onde o sistema é composto de Tratamento primário quimicamente assistido (TPQA) com aplicação de produtos químicos (polímero como coagulante), seguido de duas lagoas facultativas, lagoa de maturação, Decantador de algas (decantador) com aplicação de produtos químicos (polímero e cal hidratada) e tanque de contato de cloro. Utilizou-se um período de estudo de nove meses (Outubro/2005 à Junho/2006), com coletas e análises semanais e quinzenais, dos efluentes das lagoas facultativas, da lagoa de maturação, do Decantador de algas e final do sistema. As análises foram realizadas no Laboratório de Controle Ambiental da Riviera de São Lourenço. Foram encontradas ao longo do sistema as seguintes espécies de cianobactérias: Planktothrix sp, Merismopedia sp, Microcystis sp, Phormidium sp, Chroococcus sp, Pseudonabaena sp, Aphanocapsa sp. Ao longo de todo o período, as maiores presenças de espécies foram de Planktothrix sp. e Merismopedia sp. Encontrou-se os seguintes valores ao longo do sistema para densidades de cianobactérias na baixa temporada: para lagoas facultativas - 18880 cel/mL; lagoa de maturação - 16350 cel/mL; Decantador de algas - 4680 cel/mL; saída do sistema - 6400 cel/mL; e na alta temporada: para lagoas facultativas - 26340 cel/mL; lagoa de maturação - 13170 cel/mL; Decantador de algas - 11840 cel/mL; saída do 1 sistema - 2910 cel/mL. As densidades de cianobactérias encontradas na baixa e alta temporada na saída do tratamento refletem valores sempre abaixo em relação à nova legislação CONAMA Nº 357/05 no que tange os limites de cianobactérias para águas classes I, II e III. As concentrações de clorofila-a no efluente da lagoa de maturação resultaram em 432 ±182?g/L, e 268 ± 185?g/L no efluente final do sistema. A eficiência de remoção foi de 53 ± 28%,. Estes resultados de clorofila-a para este sistema de tratamento de esgotos com as novas mudanças, ou seja, o sistema biológico precedido e sucedido por tratamento físico-químico, podem ser considerados satisfatórios, mas são mais elevados que os limites preconizados na Resolução CONAMA Nº 357/05 para águas classes I, II e III, havendo a necessidade se contar com algum grau de diluição para permitir o enquadramento. Para os parâmetros convencionais analisados ao longo do período, destacam-se as concentrações no efluente final de fósforo de 5 ± 2 mgP/L e de nitrogênio amoniacal de 22 ± 10 mgN/L. Com relação ao fósforo, observa-se a necessidade de diluição no corpo receptor para o enquadramento às classes mais restritivas e, com relação ao nitrogênio amoniacal, verifica-se que o valor médio é superior ao padrão de lançamento de 20 mgN/L estabelecido pela Resolução 357/2005 do CONAMA. / The present research proposes to evaluate the presence of cyanobacteria either quantitatively and qualitatively, as well as chlorophyll-a quantitatively, according to CONAMA Nº 357/05 legislation, for a stabilization ponds treatment system associated with physico-chemical treatment, as well as evaluating typical parameters behavior, such as Biochemical Oxygen Demand (BOD), Chemical Oxygen Demand (COD), Nitrogen (N), Phosphorus (P), Total Suspended Solids (TSS), power hydrogen (pH). For the research, It has been used the Riviera de São Lourenço effluent treatment station in Bertioga - SP, where the system includes an Chemical enhanced Primary Treatment (CEPT) with application of chemicals products (polymer with coagulant), followed by two Facultative ponds, maturation pond, Algae Removal (decanter) with application of chemical components (polymer and hydrated lime) and chlorine chicane. It has taken a period of 9 months (oct/2005 to jun/2006), with both weekly and fortnight sample and analysis, and the observed spots were the facultative pond output, maturation pond output, algae remover output and system output. The analyses were made by Riviera de São Lourenço environmental control laboratory, when the following sorts of cyanobacteries have been found: Planktothrix sp, Merismopedia sp, Microcystis sp, Phormidium sp, Chroococcus sp, Pseudonabaena sp, Aphanocapsa sp. During the whole period, the major presence of species detected were Planktothrix sp.(100%) and Merismopedia sp.(71%). The following values for cyanobacteria density were found at low season: facultative ponds - 18880 cel/mL; maturation pond - 16350 cel/mL; algae removal - 4680 cel/mL; system output - 2910 cel/mL. The cyanobacdteria density found during low 1 and high season at the system output always under the new legislation CONAMA Nº 357/05, according the cyanobacteria limits for I, II and III classes of water. The chlorophyll-a concentration on the maturation pond´s effluent and system output showed 432 ± 182?g/L and 268 ± 185?g/L, respectively. The removal efficiency was 53 ± 28%. These chlorophyll-a results for that wastewater system, with the improvements, were satisfatory, but higher than the legislation´s limits for I, II and III water classes before the dilution computation. For the conventional parameters analysed during the whole period, phosphorus concentrations at the system output were 5 ± 2 mgP/L and total nitrogen 22 ± 10 mgN/L are showed up. It was observed that is necessary the dilution computation for phosphorus for accordance to legislation and for total nitrogen it was verified that the mean value is higher than de limit of 20mgN/L, according to legislation CONAMA 357/2005.

Introdução: Os problemas ambientais estão ocorrendo cada vez com mais freqüência, e um destes problemas está relacionado com a água, pois águas de boa qualidade na natureza estão ficando mais escassas. Objetivo: O objetivo do presente estudo é avaliar as condições ambientais em que se encontram as águas captadas por 4 estações de tratamento de água, sendo cada uma delas localizadas em 4 cidades, as quais são: Bragança Paulista, Piracaia, Nazaré Paulista e Mairiporã; e cujas águas são pertencentes aos mananciais que fazem parte do Sistema Cantareira. Metodologia: A metodologia está baseada a partir de dados secundários obtidos de relatórios e análises realizadas pela SABESP (Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo), no período de 2002 a 2008. Uma das formas de avaliação dos efeitos da poluição causados por mudanças ambientais ou atividades antrópicas, sobre a vida aquática dos mananciais, pode ser com o uso de bioindicadores. Variáveis bióticas e abióticas são as ferramentas deste estudo que estão inter-relacionadas, dependendo da influência que uma causa sobre a outra. Como variável biótica que indica poluição, destaca-se as cianobactérias, por serem estas resistentes aos poluentes. Este trabalho busca informações de variáveis abióticas em decorrência da própria mudança ambiental, para melhor avaliação sobre as variáveis bióticas fornecidas por microrganismos planctônicos como o crescimento de cianobactérias em águas continentais, por exemplo, aumento de poluentes como o excesso de nitrogênio e fósforo total do corpo dágua, alterações de natureza climática como a variação de temperatura da água, e a concentração de oxigênio dissolvido da água. Para efeito de comparação com as cianobactérias, foram utilizadas as algas verdes, desta forma procurou-se avaliar num determinado período de tempo as condições ambientais das águas captadas pelas estações de tratamento situadas ao longo do Sistema Cantareira, mostrando que o crescimento da densidade de cianobactérias aponta para um aumento gradual de poluição. Resultados: Os resultados indicam que no período do estudo, houve um aumento no número de cianobactérias em todos os reservatórios considerados: Bragança Paulista (75 por cento), Piracaia (105 por cento), Nazaré Paulista (22 por cento) e Mairiporã (179 por cento) / Introduction: The environmental problems are happening every time with more frequency, and one of these problems is related with the water, because waters of good quality in the nature are being scarcer. Objective: The objective of the present study is to evaluate the environmental conditions in that meet the waters captured by 4 water treatment plants, being located each one of them in 4 cities, which are: Bragança Paulista, Piracaia, Nazaré Paulista and Mairiporã; and whose waters are belonging to the sources that are part of the Cantareira System. Method: The methodology is based starting from obtained secondary data of reports and analyses accomplished by SABESP (Company of Basic Sanitation of the State of São Paulo), in the period from 2002 to 2008. One in the ways of evaluation of the effects of the pollution caused by environmental changes or anthropogenic activities, about the aquatic life of the watershed, it can be with the bioindicators use. Variable biotics and abiotics are the tools of this study that are interrelated, depending on the influence that a cause on the other. As variable biotic that indicates pollution, stands out the cianobactérias, for they be these resistant ones to the pollutants. This work search for information of abiotic variables due to the own environmental change, for better evaluation on the biotic variables supplied by planktonic microorganisms as the cyanobacteria growth in continental waters, for example, increase of pollutants as the excess of nitrogen and total phosphorus of the body of water, alterations of climatic nature as the variation of temperature of the water, and the concentration of dissolved oxygen of the water. For comparison effect with the cyanobacterias, the green algae were used, this way it tried to evaluate in a certain period of time the environmental conditions of the waters captured by the treatment plants located along the Cantareira System, showing that the growth of the cyanobacteria density indicate for a gradual increase of pollution. Results: The results indicate that in the period of the study, there was an increase in the cyanobacteria number in all the considered reservoirs: Bragança Paulista (75per cent), Piracaia (105per cent), Nazaré Paulista (22per cent) and Mairiporã (179per cent)

Algumas espécies de cianobactérias podem produzir diferentes tipos de peptídeos bioativos (cianopeptídeos), como aeruginosinas, cianopeptolinas, microgininas, microviridinas, anabaenopeptinas e microcistinas. As microcistinas, que compõem a classe mais conhecida na literatura científica, são hepatotoxinas e inibem fosfatases do tipo 1 e 2A. Já as microgininas, moléculas inibidoras da enzima conversora de angiotensina (ECA) e de outras proteases, são importantes candidatas ao desenvolvimento de fármacos anti-hipertensivos. No entanto, as funções fisiológicas desses compostos ainda não foram completamente elucidadas. O objetivo desse estudo é identificar e isolar cianopeptídeos, especialmente da classe das microgininas, produzidos por cepas de cianobactérias brasileiras. O fracionamento dos extratos das cianobactérias foi biomonitorado por meio de ensaios de inibição da ECA. Para tanto, foram produzidos extratos de culturas de 59 cepas de cianobactérias mantidas em laboratório e, quando pertinente, seguiu-se o pré-fracionamento por extração em fase sólida em coluna de fase reversa. As frações obtidas foram testadas para a inibição da ECA e analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Nos casos em que houve inibição, o fracionamento foi continuado por cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa para o isolamento dos cianopeptídeos. As espécies analisadas pertencem aos gêneros: Microcystis, Oscillatoria, Radiocystis, Sphaerocavum, Sphaerospermopsis, Cylindrospermopsis, Leptolyngbya, Pleurocapsa, Chrooccocidiopsis, Nostoc, Brasilonema, Desmonostoc, Oculatella e Limnothrix. Além de outras espécies das famílias Pseudanabaenaceae, Nostocaceae e Michochaetaceae que não tiveram suas identificações concluídas. Nas análises por HPLC-DAD não foram encontrados picos com espectros de UV característicos de microgininas nas 59 cepas avaliadas. Esses resultados foram corroborados por análises por LC-MS, nas quais também não foi possível a detecção desses compostos. Como método de triagem, as análises por LC-MS triplo quadrupolo foram conduzidas via precursor ion scan para o monitoramento das perdas m/z 128 e 142, que são fragmentos oriundos do aminoáciodo Ahda, exclusivamente presente em microgininas. Algumas linhagens se revelaram produtoras de variantes do cianopeptídeo microcistina, possuindo absorção UV máxima em 238 nm. Amostras de Israel, doadas pelo Prof. Shmuel Carmeli, da Universidade de Tel Aviv, também foram analisadas por espectrometria de massas no modo precursor ion para a investigação da produção de microgininas. Foram encontrados íons de m/z 128 e 142 em uma das amostras de Israel. Ensaios enzimáticos iniciais da ECA foram realizados com frações das cepas controle LTPNA 08 e 09, sabidamente produtoras de microgininas. Realizou-se a otimização do método inicial de detecção dos cianopeptídeos para que fosse procedido o isolamento dos compostos de interesse da cultura LTPNA 08. As frações obtidas foram analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) e isoladas por um coletor de frações. 4,8 mg de microgininas foram obtidos com o isolamento das moléculas a partir de 3 g de biomassa seca da linhagem. Ensaios enzimáticos de inibição da ECA com as frações isoladas de microgininas e microcistina-LR comercial também foram realiazados. Os resultados mostram que tanto as microgininas quanto a microcistina-LR comercial apresentam potencial de inibição da enzima ECA. As microgininas e a microcistina-LR podem ser consideradas como novas moléculas a serem estudadas para o desenvolvimento de fármacos inibidores da ECA. Continuar a investigação da produção desses compostos é relevante tanto por seu potencial ecotoxicológico quanto por seu potencial farmacológico. / Some cyanobacterial species can produce different types of bioactive peptides (cyanopeptides), such as aeruginosins, cyanopeptolins, microginins, microviridins, anabaenopeptins and microcystins. Microcystins are well known in the scientific literature as hepatotoxins that inhibit phosphatases type 1 and 2A. Microginins are reported as inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE) and other proteases, being important candidates for the development of anti-hypertensive compounds. Nevertheless, the physiological functions of these compounds have not been fully elucidated. The aim of this study is to isolate and identify cyanopeptides, namely microginins, produced by Brazilian cyanobacterial strains. The fractionation of cyanobacterial extracts was screened by ACE inhibition assays. Extracts of 59 cyanobacterial strains were produced from cultures cultivated under laboratory conditions and, in cases where microginins were found, prefractionation were carried out by solid phase extraction on a reverse phase column. The fractions obtained were tested for inhibition of ACE and analyzed by liquid chromatographymass spectrometry (LC-MS) by using precursor ion scan to monitor the loss of m/z 128 and 142, typical fragments detected from the amino acid Ahda, which is exclusively found in microginins. In cases where fractions demonstrated inhibitory activity, the fractionation was continued by semi-preparative high performance liquid chromatography for the isolation of cyanopeptides. The analyzed species belong to the genere: Microcystis, Oscillatoria, Radiocystis, Sphaerocavum, Sphaerospermopsis, Cylindrospermopsis, Leptolyngbya, Pleurocapsa, Chrooccocidiopsis, Nostoc, Brasilonema, Desmonostoc, Oculatella and Limnothrix. And other species of Pseudanabaenaceae, Nostocaceae and Michochaetaceae families did not have their peptides completely characterized. Analyses of HPLC-DAD did not revealed characteristic features by UV spectra of microginins in the 59 strains. These results were corroborated by analyses of LC-MS triple quadrupole, microginins were not detected as well. Some strains were positive for microcystin variants, showing maximum UV absorption at 238 nm and typical MS/MS spectra. Initial enzyme assays for the inhibition of ACE were performed with fractions of the control strains LTPNA 08 and 09, known as microginins\' producers. Samples fromIsrael, kindly donated by Prof. Shmuel Carmeli, of Tel Aviv University, were analyzed by mass spectrometry in the precursor ion mode for the investigation of microginins. Ions m/z 128 and 142 were founded on one sample of Israel. A HPLC method was optimized for the detection and isolation of cyanopeptides produced by culture LTPNA 08. Fractions isolated by semi-preparative HPLC were analyzed by LC-MS and collected when UV and MS spectra were characteristically similar to microginins . 4.8 mg of microginins were obtained by semi-preparative HPLC from 3 g of dried strains. The inhibition assays of ECA were performed with fractions of microginins and microcystin-LR analytical standard. The results showed that microginins as well as microcystin-LR have the potential of inhibiting ACE. Microginins and microcystin-LR can be considered as target molecules for the study of ACE inhibitors. Further research on the production of these classes of peptides is relevant because of its ecotoxicological and pharmacological potential.

A crescente demanda por água doce de boa qualidade, associada ao aumento na frequência de florações tóxicas de cianobactérias em reservatórios utilizados para consumo humano, levou à publicação da Portaria nº. 518/04 pelo Ministério da Saúde. Entre outros parâmetros de potabilidade, as empresas fornecedoras de água tratada devem realizar o monitoramento de cianotoxinas. Para tanto, métodos analíticos rápidos e precisos para a determinação destes compostos são imprescindíveis. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo empregar a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para o estudo das principais cianotoxinas em território nacional: microcistinas, anatoxina-a(s), cilindrospermopsina e saxitoxinas. Os resultados obtidos estão distribuídos em capítulos específicos dedicados a cada grupo de toxinas. Dessa forma, o primeiro capítulo apresenta um estudo de fragmentação na fase gasosa de ânions de microcistinas em um equipamento do tipo orbitrap. É demonstrado que o modo negativo de ionização por electrospray fornece informações estruturais importantes e complementares ao modo positivo de ionização. Uma abertura seletiva do peptídeo cíclico é proposta e mecanismos discutidos, o que facilita a interpretação de resultados durante a caracterização de variantes desconhecidas. O modelo de fragmentação desenvolvido foi utilizado para identificar a variante [Leu1]MC-LR em um extrato de Microcystis spp. O segundo capítulo descreve metodologias qualitativas de LC/MS para o monitoramento e identificação do organofosforado natural anatoxina-a(s), cuja análise é prejudicada pela ausência de padrões comerciais. A cromatografia de interação hidrofílica foi empregada e mecanismos de fragmentação na fase gasosa propostos, discutindo-se os íons característicos desta estrutura química. Tal modelo permitiu a identificação desta toxina nas cepas de Anabaena oumiana ITEP-25 e ITEP-26 pela primeira vez. O terceiro capítulo disserta sobre os mecanismos de fragmentação na fase gasosa da toxina cilindrospermopsina quando ionizada por electrospray na forma de aduto com metais alcalinos. Diferenças nas vias de fragmentação são demonstradas de acordo com o raio atômico do metal formador do aduto, com implicações práticas na sua determinação cromatográfica. Já o quarto capítulo discute os mecanismos de fragmentação de variantes sulfatadas de saxitoxinas (GTX1e4, GTX2e3, dcGTX2e3, GTX5) após ionização por electrospray no modo positivo e negativo. É demonstrado pela primeira vez que uma conformação estrutural específica do grupamento sulfato explica a intensa eliminação de SO3 observada para as variantes GTX1, GTX2 e dcGTX2 no modo positivo de ionização. Por outro lado, o modo negativo de ionização apresenta vantagens uma vez que a dissociação na fonte é insignificante se comparada à dissociação observada no modo positivo. Como resultado, métodos quantitativos no modo negativo podem apresentar maior sensibilidade, permitindo a detecção destas toxinas em amostras ambientais em quantidades mais baixas. De maneira geral, conclui-se que a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas é ferramenta poderosa para a análise quali e quantitativa das principais cianotoxinas, podendo ser amplamente empregada para o monitoramento de água para consumo humano. / The increasing occurrence of toxic cyanobacterial blooms in reservoirs used to supply drinking water for human consumption has prompted the publication of resolution 518/04 by the Brazilian Ministry of Health. Among other quality requirements, the monitoring of cyanotoxins in treated water is mandatory for companies responsible for potable water distribution. Therefore, precise and rapid analytical methods are essential. In this context, the aim of this work is to employ liquid chromatography coupled to mass spectrometry to study the most important cyanotoxins in our country: microcystins, anatoxin-a(s), cylindrospermopsis and saxitoxins. The obtained results are distributed in four chapters, each one dedicated to a single group of toxins. In this way, chapter one presents the gas-phase fragmentation behavior of deprotonated microcystins in an Orbitrap instrument. It is demonstrated that electrospray negative ionization can provide significant structural information about microcystins. These results are complementary to the positive ionization mode. A selective ring opening process is proposed and possible mechanisms are discussed, which may facilitate data interpretation when unknown variants are considered. The general fragmentation model was further applied to the characterization of [Leu1]MC-LR in a Microcystis spp. cell extract. The second chapter describes qualitative analytical methods for the identification of anatoxin-a(s), a natural organophosphate whose determination is hampered by the lack of commercial standards. Hydrophilic interaction liquid chromatography was employed and fragmentation mechanisms proposed, identifying the characteristic product ions of this toxin. The developed methods were further used to identify anatoxin-a(s) for the first time in Anabaena oumiana strains ITEP-25 and ITEP-26. The third chapter presents data related to the gas-phase fragmentation behavior of cylindrospermospin when this toxin is ionized as metal adducts. Different fragmentation pathways are accessed depending on the atomic radius of the metal cation involved. Practical implications for the chromatographic analysis of this toxin are presented. The last chapter describes the fragmentation behavior of sulphate-containing saxitoxin variants (GTX1&4, GTX2&3, dcGTX2&3, GTX5) after electrospray ionization in both the positive and negative modes. A mechanism for the intense SO3 elimination from [M+H]+ ions from GTX1, GTX2 and dcGTX2 is proposed for the first time and relies on a specific structure conformation. On the other hand, the negative ionization mode shows much less in-source dissociation when compared to the positive mode. As a consequence, methods based on negative ionization might be more sensitive for sulfate-containing variants, allowing the detection of lower amounts of these toxins in environmental samples. At the end, it can be concluded that liquid chromatography is a well-suited and powerful technique for the qualitative and quantitative analysis of cyanotoxins, being an invaluable contribution to water safety evaluation.

Este trabalho objetivou adaptar um método de controle de larvas do mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) com a utilização de radiação ultravioleta e verificar seu efeito sobre cianobactérias e cianotoxinas presentes na água. Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), conhecido vulgarmente como mexilhão dourado é proveniente do sudeste asiático. Foi, provavelmente, introduzido nos nossos mananciais, não intencionalmente, através da água de lastro, com os primeiros registros na América do Sul, em 1991, no Rio da Prata, nas proximidades de Buenos Aires, Argentina. No Brasil foi visto pela primeira vez na área do Delta do Jacuí, em frente ao porto de Porto Alegre, RS, no ano de 1998. Além de ameaçar à biodiversidade de ecossistemas, vem provocando a obstrução das tubulações e trocadores de calor junto às estações de tratamento de água e indústrias que utilizam água bruta para resfriamento. As estações de tratamento, além de enfrentarem problemas com o entupimento pelo mexilhão, defrontam-se também com as florações de cianobactérias. As florações, conhecidas também como blooms, são eventos de multiplicação e acumulação de microalgas ou cianobactérias nos corpos hídricos, que podem durar de algumas horas ao longo do dia a meses. As cianobactérias podem liberar cianotoxinas que estão presentes principalmente no interior das células, e são liberadas na lise celular, que ocorre principalmente por senescência natural. Os experimentos foram realizados em uma unidade piloto, onde concentrações conhecidas de larvas do mexilhão dourado foram submetidas a doses de radiação ultravioleta, na faixa de 200 a 800 mWs/cm2. As amostras de água bruta utilizadas nos testes foram avaliadas por meio de métodos analíticos adequados (APHA, 2005). Foram determinados os parâmetros de temperatura (°C), pH, turbidez (NTU), dureza (mgCaCO3/L) e sólidos suspensos (mg/L), os quais poderiam influenciar nas condições dos testes. As mesmas condições testadas para o mexilhão foram utilizadas nos experimentos com cianobactérias. As larvas de mexilhão dourado e a água bruta utilizada no experimento foram obtidos no delta do Jacui, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. A cianobactéria Microcystis aeruginosa, produtora de microcistina, foi cultivada em laboratório. A mortalidade instantânea das larvas aproximou-se dos 100% nas condições do teste com a dosagem de 781mWs/cm2 , com DL50 de 324 mWs/cm2. Na água residual dos experimentos de exposição à radiação UV, foram realizados ensaios ecotoxicológicos crônicos com Pimephales promelas, Ceriodaphnia dubia e Selenastrum capricornutum, a fim de detectar a presença de subprodutos que poderiam gerar toxicidade aos organismos de diferentes níveis tróficos. Os resultados desta avaliação ecotoxicológica não demonstraram toxicidade residual. Os dados obtidos demonstraram-se satisfatórios no controle daslarvas de mexilhão, entretanto não promoveram a lise das células de M. aeruginosa e a conseqüente liberação de microcistinas nas condições testadas. / L. fortunei (Dunker, 1857), commonly known as golden mussel comes from Southeast Asia. It might have been unintentionally introduced in our water sources through ballast water, with the first records in 1991, in Rio de la Plata, near Buenos Aires, Argentina, South America. In Brazil it was first seen in 1998, in Jacuí Delta, opposite Porto Alegre’s harbor. Besides threatening the biodiversity of ecosystems, this mussel has caused the obstruction of pipes and heat exchangers along the water treatment plants and industries that use raw water for cooling. Treatment plants facing problems with the clogging of mussels also have to contend with the cyanobacterial blooms. The blooms are events of multiplication and accumulation of algae or cyanobacteria in water bodies that can last from a few hours to days or months. The cyanobacteria may release cyanotoxins present mainly in cells and are released upon cell lysis, which occurs primarily by natural senescence. Thus, the aim of study is to adapt a control method of golden mussel larvae (L. fortunei) using ultraviolet radiation and verify its effect on cyanobacteria and cyanotoxins in the water. The experiments were performed in a pilot unit, where known concentrations of mussel larvae were subjected to doses of ultraviolet radiation ranging from 200 to 800 mWs/cm2, and the quality of water used, evaluated. The same conditions tested for the mussels were used in experiments with cyanobacteria. Mussel larvae and raw water used in the experiments were obtained from the Jacuí Delta, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil. The cyanobacteria Microcystis aeruginosa, witch produces microcystin, was grown in culture in our laboratory. The instantaneous mortality of larvae was approximately 100% with 781mWs/cm2 in test conditions, with LD50 of 324 mWs/cm2. Ecotoxicological tests were performed with Pimephales promelas, Ceriodaphnia dubia, and Selenastrum capricornutum, to detect the presence of byproducts that could cause toxicity to organisms of different trophic levels in the residual water. The results of ecotoxicological evaluation showed no residual toxicity. The data showed to be satisfactory in larvae control, but did not cause lysis in cells of M. aeruginosa and the consequent release of microcystins in the water.

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii vem se destacando na literatura atual devido à sua presença e dominância em lagos e reservatórios em diversas regiões do planeta e a principal preocupação deste cenário é por ela ser potencialmente tóxica. Estudos revelaram que o crescimento e a síntese de toxinas em espécies de microrganismos fitoplanctônicos estão atrelados à limitação ou excesso de micronutrientes, porém, ainda são desconhecidos os efeitos desta variação na produção de saxitoxina (STX) por C. raciborskii. Para contribuir com o esclarecimento desta questão, investigou-se o efeito de diferentes concentrações dos micronutrientes Fe, Zn, Cu, Mn, Co e B no crescimento e na produção de STX de uma linhagem de C. raciborskii. Em salas climatizadas, culturas desta linhagem foram expostas durante 20 dias a 5 concentrações de cada micronutriente, com alteração do meio de cultura ASM-1. As respostas fisiológicas de C. racibosrkii a estas modificações foram verificadas através da velocidade máxima de crescimento (μmáx), rendimento do biovolume, tempo de duplicação (Td), concentração de clorofila a, assimilação de nitrato e ortofosfato e síntese de STX total (intra e extracelular). As maiores concentrações de STX por biovolume (STX/biovolume) foram obtidas nos tratamentos com baixa concentração de Fe (0,4 μM) e elevada concentração de Cu (0,8 μM). Nos micronutrientes Zn, Co e B, houve uma tendência de redução da síntese de STX nas maiores concentrações destes metais. Enquanto as concentrações extremas de Fe e Mn inibiram o crescimento (Fe: 0,4 e 400 μM e Mn: 0,7 e 600 μM), as concentrações centrais favoreceram (Fe: 4 a 60 μM e Mn: 7 a 200 μM). Elevada concentração de Cu (0,8 μM) causou aumento de 2,6 vezes (160%) do volume celular e redução na síntese de clorofila a, sem alterações significativas em μmáx e rendimento. O aumento da concentração dos micronutrientes Fe, Zn, Mn e B no meio de cultura causaram maior assimilação de ortofosfato por biovolume (P/biovolume). Estes principais resultados demonstraram que os micronutrientes afetam a síntese de STX e o crescimento de C. raciborskii, podendo ser associados aos diversos mecanismos de captura e detoxificação de metais que as cianobactérias possuem. Embora as extrapolações dos resultados laboratoriais para o ambiente devam ser realizadas com prudência, estudos relacionados à ecofisiologia de cianobactérias como este, são fundamentais para análise criteriosa de cada variável podendo ser utilizado como ferramenta de diagnóstico e prevenção de florações tóxicas. / Cylindrospermopsis raciborskii has been highlighted in several researches due to the dominance in many lakes and reservoirs around the world, the main concern about it due to the ability to produce toxins. Studies have revealed that growth and toxins production in phytoplankton species are linked to micronutrients limitation or excess. Nevertheless, micronutrient variation effects on saxitoxin (STX) production by C. raciborskii are still unknown. To contribute to clarify this issue, we investigated the effect of different micronutrients concentration, such as Fe, Zn, Cu, Mn, Co and B, on the growth and saxitoxin production of C. raciborskii strain. In climatized growth room, the cultures of C. raciborskii strain were exposed to 5 different concentration of each micronutrient, present in ASM-1 medium, during 20 days. The C. racibosrkii physiological responses was detected through maximum growth rate (μmáx), biovolume yield, doubling time (Td), chlorophyll-a, nitrate and orthophosphate assimilation and the total STX production (intra and extracellular). The higher concentrations of STX per biovolume (STX/biovolume) were observed in treatments with low Fe concentration (0.4 μM) and high Cu concentrations (0.8 μM). Higher concentrations of Zn, Co and B lead to low STX production. While the Fe and Mn extreme concentrations inhibited the growth (Fe: 0.4 and 400 μM and Mn: 0.7 to 600 μM), the central concentrations favored (Fe: 4 to 60 μM, and Mn: 7-200 μM). A high Cu concentration (0,8 μM) leads to 2,6 fold increase (160%) in cellular volume and decrease the chlorophyll-a content, however máx and biovolume yield did not change. Increasing the Fe, Zn, Mn and B concentration in the culture caused higher assimilation of orthophosphate per biovolume (P/biovolume). These results indicated that micronutrients affected C. raciborskii growth and STX production, and may be associated with the diverse cyanobacterial mechanisms of metals capture and detoxification. Cyanobacteria ecophysiology studies, as this research, are fundamental to careful analysis of each variable, which could be used as diagnostic and a tool to prevention of toxic blooms.