Cyanobacteria can form nuisance proliferations and produce large concentrations of toxins that pose a health hazard. This thesis investigates cyanotoxin production by New Zealand benthic cyanobacteria. Cyanobacteria were sampled from lakes, reservoirs, streams, and rivers. Thirty-five strains were isolated into culture and screened for genes involved in the biosynthesis of common cyanotoxins. Positive results were confirmed and cyanotoxin concentrations quantified using analytical chemistry techniques. Genes involved in anatoxin a/homoanatoxin a biosynthesis were detected in nine out of ten Phormidium cf. uncinatum strains isolated from a single mat. Anatoxin a was confirmed in these strains by LC–MS/MS at concentrations from 0.3 to 6.4 mg kg⁻¹. One strain also produced homoanatoxin-a. Anatoxin-a variation between strains may explain the wide range in anatoxin a concentrations previously observed in New Zealand. The sxtA gene involved in saxitoxin biosynthesis was identified in Scytonema cf. crispum strains. Saxitoxin was confirmed in strains and environmental samples by Jellett PSP Rapid Test and HPLC–FD. Gonyautoxins, neosaxitoxin, and decarbamoyl derivatives were also detected. This study is the first identification of these compounds in Scytonema and in New Zealand cyanobacterial strains. These strains were isolated from recreational and pre-treatment drinking water reservoirs, highlighting the risk benthic cyanobacteria pose to human and animal health. Experiments were undertaken using cultures of Phormidium and Scytonema to determine how growth influences cyanotoxin production. The effects of iron and copper stress on P. autumnale were also investigated. High iron concentrations disrupted attachment mechanisms. Iron and copper had a significant effect on growth, without significantly affecting anatoxin a production. However, the maximum anatoxin a quota was consistently observed during early exponential growth. Scytonema cf. crispum produced higher saxitoxin quota throughout exponential growth than during the stationary phase. Both the Phormidium and Scytonema growth experiments indicate that high toxin quota can be expected early in benthic mat development, making early detection of these proliferations important.

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a. / Within the context of the worldwide increasing frequency of cyanobacterial (CB) blooms, some containing cyanotoxins (CT), the development of a detection/quantification method for the fast analysis a maximum of CT is necessary. This method would allow daily tracking of the toxicity of CB-contaminated water such that, as warranted, appropriate measures can be taken quickly to protect public health. A new technology using laser diode thermal desorption (LDTD) coupled to atmospheric pressure chemical ionization (APCI)-tandem mass spectrometry (MS/MS) has shown great potential to reduce analysis time to seconds. Analytes are desorbed by the LDTD, ionized in gas-phase by APCI and detected by MS/MS. Therefore, there is no chromatographic separation and sample treatment prior to analysis is minimal, depending on the complexity of the sample matrix. Among the four CT tested (microcystin-LR, cylindrospermopsin, saxitoxin and anatoxin-a (ANA-a)), only ANA-a exhibited sufficient desorption which is necessary to develop an analytical method with the LDTD-APCI interface. The strong polarity or high molecular weight of the other CT probably inhibited their efficient desorption. Optimization of instrumental parameters, while accounting for the isobaric interference caused by the acid amino phenylalanine (PHE) in the detection of ANA-a by MS/MS, generated a detection limit of the order of 1 ug/L ANA-a. This value was obtained in a simulated natural matrix, demonstrating that it would be possible to use LDTD to monitor ANA-a in natural waters within the range of current applicable environmental guidelines (1 to 12 ug/L). Because PHE desorption is limited with the LDTD-APCI interface, this method avoids its interference on ANA-a analysis, even at PHE concentrations as high as 500 ug/L.

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a. / Within the context of the worldwide increasing frequency of cyanobacterial (CB) blooms, some containing cyanotoxins (CT), the development of a detection/quantification method for the fast analysis a maximum of CT is necessary. This method would allow daily tracking of the toxicity of CB-contaminated water such that, as warranted, appropriate measures can be taken quickly to protect public health. A new technology using laser diode thermal desorption (LDTD) coupled to atmospheric pressure chemical ionization (APCI)-tandem mass spectrometry (MS/MS) has shown great potential to reduce analysis time to seconds. Analytes are desorbed by the LDTD, ionized in gas-phase by APCI and detected by MS/MS. Therefore, there is no chromatographic separation and sample treatment prior to analysis is minimal, depending on the complexity of the sample matrix. Among the four CT tested (microcystin-LR, cylindrospermopsin, saxitoxin and anatoxin-a (ANA-a)), only ANA-a exhibited sufficient desorption which is necessary to develop an analytical method with the LDTD-APCI interface. The strong polarity or high molecular weight of the other CT probably inhibited their efficient desorption. Optimization of instrumental parameters, while accounting for the isobaric interference caused by the acid amino phenylalanine (PHE) in the detection of ANA-a by MS/MS, generated a detection limit of the order of 1 ug/L ANA-a. This value was obtained in a simulated natural matrix, demonstrating that it would be possible to use LDTD to monitor ANA-a in natural waters within the range of current applicable environmental guidelines (1 to 12 ug/L). Because PHE desorption is limited with the LDTD-APCI interface, this method avoids its interference on ANA-a analysis, even at PHE concentrations as high as 500 ug/L.

La diversité et la distribution des cyanobactéries dans les écosystèmes aquatiques conduisent à des effets nuisibles dans l’eau par la production d’une variété de toxines cyanobactériennes qui présentent des risques pour la faune et la santé humaine. Différentes techniques analytiques émergentes ont été développées pour détecter et quantifier les toxines cyanobactériennes dans l'environnement. Dans ce mémoire nous avons examiné la présence de cyanotoxines multi-classes, dont 12 microcystines, les anatoxines, la cylindrospermopsine (CYN), les anabaenopeptines (AP-A, AP-B) et la cyanopeptoline-A dans les eaux de surface et les poissons sauvages. L'échantillonnage a été conduit pendant l’été 2018, dans l'écosystème fluvial de la réserve écologique de la Rivière aux Brochets (QC, Canada) près de la Baie Missisquoi (Lac Champlain). La méthode analytique employée combine la chromatographie liquide ultra haute performance et une ionisation par électronébuliseur (UHPLC-ESI) avec l’usage d’un spectromètre de masse triple quadripôle. Sur les 18 cyanotoxines ciblées, 14 ont été détectées dans des échantillons d'eau de surface impactés par la floraison ; les toxines ont culminé au début de la mi-septembre avec les concentrations les plus élevées de MC-LR (3,8 μg L-1) et MC-RR (2,9 μg L-1). Parmi les 71 poissons prélevés sur le terrain (10 espèces au total), 38% avaient des détections positives d'au moins une cyanotoxine. Dans les échantillons positifs, les plages de concentration dans le muscle du poisson étaient les suivantes : la somme des microcystines ΣMC (0,16-9,2 μg kg-1), la CYN (46-75 μg kg-1), et les anabaénopeptines AP-A (1,1-5,4 μg kg-1) et AP-B (0,01 à 5,0 μg kg-1). Dans l'ensemble, 17% des échantillons de poisson étaient positifs pour AP-A ou AP-B. A notre connaissance, ceci constitue le premier signalement de bioaccumulation d'anabaénopeptines dans la faune. La somme maximale des concentractions des microcystines ΣMC dans les poissons était 1,15 fois plus élevées que la recommandation de l'apport quotidien (8 μg kg-1 de tissu-1) de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) pour les adultes et équivalaient presque à la valeur dérivée pour les jeunes enfants 9.3 μg kg-1. La concentration de CYN était également environ 3 fois plus élevée que la limite dérivée des valeurs recommandées pour la santé humaine. / The diversity and widespread distribution of cyanobacteria in aquatic ecosystems lead to harmful effects in water through the production of a variety of cyanobacterial toxins, which pose a great danger to fauna and human health. Different emerging analytical techniques have been developed to detect and quantify cyanobacterial toxins in the environment. In this thesis we examined the presence of multi-class cyanotoxins, including 12 microcystins, anatoxins, cylindrospermopsin (CYN), anabaenopeptins (AP-A, AP-B) and cyanopeptolin-A in surface water and wild fish. Sampling was conducted during the 2018 summer season in the fluvial ecosystem of the Pike River ecological reserve (QC, Canada) near Missisquoi Bay, Lake Champlain. This study was carried out using an analytical method combining ultra-high-performance liquid chromatography and ionization by electrospray (UHPLC-ESI) with the use of a triple quadrupole mass spectrometer. Of the 18 cyanotoxins targeted, 14 were detected in surface water samples impacted by the bloom; toxins peaked in early mid-September with the highest concentrations of MC-LR (3.8 μg L-1) and MC-RR (2.9 μg L-1). Among the 71 fish sampled in the field from 10 species, 38% had positive detections of at least one cyanotoxin. In positive samples, the concentration ranges in fish muscle were as follows: the sum of microcystins ΣMC (0.16-9.2 μg kg-1), CYN (46-75 μg kg-1), AP -A (1.1-5.4 μg kg-1) and AP-B (0.01 to 5.0 μg kg-1). Overall, 17% of the fish samples were positive for AP-A or AP-B; to our knowledge, this is the first report of accumulation of anabaenopeptins in wildlife. The maximum sum ΣMC of microcystin concentrations in fish was 1.15 times higher than the recommendation of the World Health Organization (WHO) Daily Intake (8 μg kg-1 tissue-1) for adults and was almost equivalent to the derived value for young children 9.3 μg kg-1. The concentration of CYN was also approximately 3 times higher than the limit derived from the recommended human health values.

Cylindrospermopsin (CYN) is a toxic alkaloid produced by several freshwater cyanobacterial species, the most prevalent in Australian waters being Cylindrospermopsis raciborskii. The occurrence of CYN-producing cyanobacteria in drinking water sources worldwide poses a potential human health risk, with one well-documented case of human poisoning attributed to the toxin. While extensive characterisation of CYN-induced toxicity has been conducted in rodents both in vivo and in primary cell cultures, little is known about mechanisms of toxicity in human cell types. This thesis describes studies undertaken to further define the molecular mechanisms of CYN toxicity in human cells. Concentration-response relationships were determined in various cultured human cell types using standard toxicity assays. As expected, CYN caused dose-dependent decreases in the growth of three cell lines, HepG2, Caco-2 and HeLa, and one primary cell type, human dermal fibroblasts, according to tetrazolium reduction assays. CYN treatment did not disrupt cellular membranes according to the lactate dehydrogenase release assay in HepG2 or Caco-2 cells after 24, 48 or 72 h exposure, but did cause membrane disruption in fibroblasts after 72 h exposure to relatively high concentrations of the toxin. Apoptosis occurred more readily in HeLa cells than HepG2 cells or fibroblasts, with 72 h exposure to 1 &mug/mL required before statistically significant rates of apoptosis occurred in the latter cell types. CYN did not appear to directly affect the structure of actin filaments or microtubules under the conditions used in the present study. The major portion of the work presented in this thesis comprises a large-scale interrogation of changes in gene expression induced by the toxin in cultured cells. To assess the effects of CYN on global gene expression, relative messenger RNA (mRNA) levels in human dermal fibroblasts and HepG2 cells after 6 h and 24 h exposure to 1 &mug/mL CYN were determined using oligonucleotide microarrays representing approximately 19 000 genes. Overall, the number of transcripts significantly altered in abundance was greater in fibroblasts than in HepG2 cells. In both cell types, mRNA levels for genes related to amino acid biosynthesis, carbohydrate metabolism, and protein folding and transport were reduced after CYN treatment, while transcripts representing genes for apoptosis, RNA biosynthesis and RNA processing increased in abundance. More detailed data analyses revealed the modulation of a number of stress response pathways—genes regulated by NF-&kappaB were induced, DNA damage response pathways were up-regulated, and a large number of genes involved in endoplasmic reticulum stress were strongly down-regulated. Genes for the synthesis and processing of mRNA, tRNA and rRNA were strongly up-regulated, indicating that CYN treatment may increase the turnover of all forms of cellular RNA. A small group of genes were differentially expressed in HepG2 cells and fibroblasts, revealing cell-specific responses to the toxin. Selected changes in transcript level were validated using real-time quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). The modulation of stress response pathways by CYN, indicated by microarray analysis, was further investigated using other methods. The role of tumour suppressor protein p53 in CYN-mediated gene expression was confirmed by measuring the expression of known p53-regulated genes following CYN treatment of HepG2 cells and human dermal fibroblasts using qRT-PCR. Western blotting of protein extracts from CYNtreated cells showed that p53 protein accumulation occurred in HepG2 cells, providing additional evidence of the activation of the p53 pathway by CYN in this cell line. The immediate-early genes JUN and FOS were found to be induced by CYN in a concentration-dependent manner, and MYC was induced to a lesser extent. The mitogen-activated protein kinase c-Jun NH2-terminal kinase, implicated in the ribotoxic stress response initiated by damage to ribosomal RNA, appeared to become phosphorylated in HeLa cells after CYN exposure, suggesting that ribotoxic stress may occur in response to CYN in at least some cell types. The expression of a reporter gene under the control of a response element specific for NF-&kappaB was induced at the mRNA level but inhibited at the protein level. This shows that while transcription factors such as p53 and NF-&kappaB are apparently activated in response to the toxin, transactivation of target genes may not necessarily manifest a corresponding increase at the protein level. The current work contributes significantly to the current understanding of cylindrospermopsin toxicity in human-derived cell types, and provides further insight into putative modes of action.

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles. / Cyanobacteria have a very important place in aquatic ecosystems and a significant number of species are considered harmful given their production of toxic metabolites. These cyanotoxins have various chemical proprieties and have often been associated with poisoning episodes. The frequency of cyanobacterial blooms is increasing and the study of cyanobacteria and their toxins is of increasing interest, especially considering the potential increase associated with climate changes. Given the chemical complexity of the cyanotoxins, the development of simple, sensitive and fast detection methods is an analytical challenge. Considering these issues, the development of new analytical approaches for the detection of cyanotoxins in water and fish samples contaminated with harmful cyanobacterial blooms have been proposed. A first approach consists of the use of an on-line solid phase extraction coupled to liquid chromatography and tandem mass spectrometry (SPE-LC-MS/MS) for the analysis of six microcystins (MCs), anatoxin-a (ANA-a) and cylindrospermopsin (CYN). This method allows a simple and rapid analysis and enables the chromatographic separation of ANA-a and its isobaric interference, phenylalanine. The detection limits ranged from 0.01 to 0.02 µg L-1 and concentrations in lake waters were found between 0.024 and 36 µg L-1. A second method consists of using manual solid phase extraction (SPE) coupled to high resolution mass spectrometry (HRMS) for the determination of b-N-methylamino-L-alanine (BMAA), ANA-a, CYN and saxitoxin (STX) in contaminated lake water. The analysis of two conformational isomers of BMAA was done to improve the selectivity. Dansyl chloride-based derivatization allows simplified chromatography. The detection limits were obtained between 0.007 and 0.01 µg L-1. The analysis of bloom water samples detected concentrations of cyanotoxins between 0.01 and 0.3 µg L-1 allowing the confirmation of the presence of BMAA in algal blooms in Québec. A second part of the project consists in the use of an alternative sample introduction technology for MS analysis. It enables ultra-fast analysis (< 15 seconds/sample) without the use of a chromatographic step, and is called laser diode thermal desorption (LDTD) coupled with atmospheric pressure chemical ionization (APCI). The first LDTD project consists of the analysis of total MCs via Lemieux oxidation in order to obtain a common moiety of all MCs existing congeners. This fraction, the MMPB, is analyzed after a liquid-liquid extraction step, with the LDTD-APCI-MS/MS. A value of 0.2 µg L-1 was obtained for detection limit and concentrations between 1 and 425 µg L-1 have been found in contaminated water samples. In addition, a comparison with a parallel analysis using MCs congeners’ standards suggested the possible presence of undetected MCs or isomers. A second project involves the direct analysis of ANA-a using LDTD-APCI-HRMS in order to solve the isobaric interference, phenylalanine, which is possible due to the high resolution detection. The LDTD offers no chromatographic separation and by using HRMS, we can distinguish ANA-a signals from those of phenylalanine. A value of 0.2 µg L-1 was obtained as detection limit and the method has been applied on water bloom samples with a positive concentration of 0.21 µg L-1. Finally, using the LDTD-APCI-HRMS combination, analysis of total MCs has been adapted to fish tissues to determine the unbound and bound MCs and compare the results with standard analysis. The use of digestion with sodium hydroxide prior to Lemieux oxidation followed by SPE purification yielded a detection limit of 2.7 µg kg-1. Total MCs concentrations were found between 2.9 and 13.2 µg kg-1 in real field-collected contaminated fish samples and comparison was made with standard analysis which yield a single positive sample with a concentration of 2 µg kg-1. This indicates the possible presence of undetected MCs using conventional analytical methods.