Streptomyces scabiei est l'agent causal de la gale commune de la pomme de terre. Les symptômes causés par cet agent pathogène sont surtout superficiels mais ils engendrent des pertes économiques très importantes pour l'industrie. Les stratégies pour lutter contre cette maladie sont surtout culturales puisqu'il n'existe pas de pesticide ciblé à S. scabiei. Le pouvoir pathogène de cette bactérie repose surtout sur la synthèse d'une phytotoxine, appelée thaxtomine A. Le tryptophane est l'un des deux précurseurs biosynthétiques de la thaxtomine A. Par contre, il a été démontré que l'ajout de tryptophane au milieu de culture de S. scabiei induit une forte diminution de synthèse de la phytotoxine. Ce type de répression de synthèse par les précurseurs semble être un phénomène unique, autant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Les bactéries du genre streptomycètes produisent aussi une foule d'autres composés, certains synthétisés aussi à partir de tryptophane. C'est le cas de l'auxine, une hormone de croissance végétale régulant divers phénomènes de croissance chez les plantes. Chez la majorité des bactéries du sol, la synthèse d'auxine est augmentée en présence de tryptophane, mais cela n'a pas été vérifié pour S. scabiei. L'objectif de notre travail a été d'évaluer l'influence du tryptophane sur l'expression des gènes de synthèse de thaxtomime A, sur la production ainsi que l'expression des gènes de synthèse de l'auxine et ensuite, sur le pouvoir pathogène de S. scabiei. Les résultats obtenus indiquent que le tryptophane réprime l'expression des gènes de synthèse de la thaxtomine A. Parallèlement, une forte augmentation de production d'auxine a été observée avec ajout exogène de tryptophane au milieu de culture, sans qu'il y ait modulation des gènes de synthèse de l'auxine. Le pouvoir pathogène de S. scabiei a été évalué en présence de tryptophane, avec un système in planta utilisant des plantules de radis, un hôte alternatif à S. scabiei. Les résultats obtenus ont permis d'affirmer que S. scabiei, en certaines conditions, pouvait agir comme promoteur de la croissance des végétaux. En effet, en présence de certaines concentrations de tryptophane, les plantes hôtes inoculées par S. scabiei avaient une meilleure croissance que des plantes non inoculées dans les mêmes conditions de tryptophane. Cette étude remet en question la classification de S. scabiei, considéré jusqu' ici comme un agent phytopathogène typique. Évidemment, cela ouvre la voie à des méthodes de luttes alternatives contre la gale commune. L'application de ces conditions aux champs est peu envisageable, à court terme, mais le développement de composés ayant un effet similaire à celui du tryptophane (au niveau de l'inhibition de synthèse de la thaxtomine A et de la promotion de synthèse de l'auxine) est une voie de recherche intéressante. De plus, une compréhension plus poussée du mécanisme d'inhibition de synthèse de la thaxtomine A par le tryptophane serait souhaitable.

La résistance antimicrobienne est un problème de santé publique de plus en plus inquiétant. En effet, si ce problème n'est pas contrôlé dès maintenant, dans les prochaines années, nous pourrions arriver dans une ère post-antibiotique où de simples infections pourraient recommencer à tuer. Afin d'éviter de tels enjeux, il est primordial que de nouveaux antibiotiques soient développés pour remplacer les médicaments contre lesquels les bactéries se sont adaptées. De toutes nouvelles classes de médicaments seraient nécessaires et l'une d'entre elles est la classe des peptides antimicrobiens. Ces segments protéiques sont retrouvés dans une impressionnante variété d'organismes et sont utilisés comme première ligne de défense contre les infections bactériennes. Le fonctionnement de ces molécules n'est pas entièrement compris, mais il est présumé qu'elles créent des pores dans les membranes bactériennes, causant ainsi la mort des cellules attaquées. Ces molécules ont un énorme potentiel, mais de nombreux problèmes empêchent leur utilisation clinique. Dans le laboratoire du Professeur Voyer, un peptide modèle, analogue des peptides antimicrobiens, a été synthétisé. Ce peptide composé de 10 leucines et de quatre phénylalanines modifiées par des éthers-couronnes a été modifié de façon systématique pour tenter de comprendre les déterminants de l'activité et de la sélectivité des peptides antimicrobiens. Dans ce mémoire, la synthèse et la caractérisation des analogues dans lesquels trois leucines ont été substituées par des acides aminés cationiques seront discutées. Ces peptides ont été caractérisés par des études biophysiques comme le dichroïsme circulaire, l'infrarouge à transformée de Fourier et le relargage de la calcéine par fluorescence. De plus, des tests d'activité biologique comme l'activité antimicrobienne et l'activité hémolytique ont aussi été réalisés et sont présentés dans le présent mémoire.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont formés de sept domaines transmembranaires. Cette famille de récepteur fait l'objet d'études qui visent à comprendre leurs fonctions, leurs interactions avec leurs ligands, les changements de conformations produits suite à cette liaison ainsi que leur mécanisme d'activation. Notre hypothèse est que le récepteur humain de l'angiotensine II de type 1 (hAT1 ) possède des déterminants moléculaires responsables de sa liaison à l'angiotensine II (AngII). Nos objectifs sont d'identifier des déterminants moléculaires responsables de sa liaison à AngII, ainsi que d'identifier des changements de conformations générés suite à cette liaison. Dans un premier temps, les déterminants de la liaison de la position C-terminale de l'AngII ont été identifiés directement grâce à des études de photomarquage par affinité sur le récepteur hAT 1. Ces études nous ont permis d'observer que l'acide aminé photoactivable utilisé, le para -benzoyl- L -phénylalanine (Bpa), présentait une sélectivité prononcée pour la méthionine. Nous avons exploité cette sélectivité du Bpa pour mettre au point une nouvelle approche : l'essai de proximité aux méthionines (MPA). Afin de déterminer l'environnement tridimensionnel de la position C-terminale de l'AngII dans le récepteur hATI, nous avons dans un premier temps étudié les domaines transmembranaires (TMD) III, VI et VII en mutant individuellement chacune des positions par une méthionine. Cette étude a permis de déterminer l'orientation relative des résidus identifiés de chaque TMD formant la pochette de liaison. Nous avons fait une étude MPA comparative avec le mutant constitutivement actif N111G-hAT 1 , afin de pouvoir déterminer des changements de hAT1 qui surviennent lors de l'activation, sur les TMD III, VI et VII et avons trouvé qu'une seule différence. La conclusion de l'étude impliquait un mouvement du TMD VI lors de l'activation. Dans une autre étude, les 4 derniers TMD (I, II, IV, V) ont été étudiés à la fois à l'état basal et actif. Cette étude permit d'identifier que les TMD II et V participent à la formation de la pochette de liaison de l'AngII dans la forme active uniquement, impliquant des mouvements dans ces 2 TMD aussi. Suite à l'identification des résidus des TMD participant à la structure de la pochette de liaison, dans la forme active ou inactive, nous avons construit des modèles du récepteur hATI ligandé dans la forme inactive et de la forme constitutivement active et les avons comparés. L'ultime but de ce projet est de présenter un modèle d'activation général des GPCR mais plus concrètement une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison, de l'activation et des changements conformationnels d'un GPCR.

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a. / Within the context of the worldwide increasing frequency of cyanobacterial (CB) blooms, some containing cyanotoxins (CT), the development of a detection/quantification method for the fast analysis a maximum of CT is necessary. This method would allow daily tracking of the toxicity of CB-contaminated water such that, as warranted, appropriate measures can be taken quickly to protect public health. A new technology using laser diode thermal desorption (LDTD) coupled to atmospheric pressure chemical ionization (APCI)-tandem mass spectrometry (MS/MS) has shown great potential to reduce analysis time to seconds. Analytes are desorbed by the LDTD, ionized in gas-phase by APCI and detected by MS/MS. Therefore, there is no chromatographic separation and sample treatment prior to analysis is minimal, depending on the complexity of the sample matrix. Among the four CT tested (microcystin-LR, cylindrospermopsin, saxitoxin and anatoxin-a (ANA-a)), only ANA-a exhibited sufficient desorption which is necessary to develop an analytical method with the LDTD-APCI interface. The strong polarity or high molecular weight of the other CT probably inhibited their efficient desorption. Optimization of instrumental parameters, while accounting for the isobaric interference caused by the acid amino phenylalanine (PHE) in the detection of ANA-a by MS/MS, generated a detection limit of the order of 1 ug/L ANA-a. This value was obtained in a simulated natural matrix, demonstrating that it would be possible to use LDTD to monitor ANA-a in natural waters within the range of current applicable environmental guidelines (1 to 12 ug/L). Because PHE desorption is limited with the LDTD-APCI interface, this method avoids its interference on ANA-a analysis, even at PHE concentrations as high as 500 ug/L.

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a. / Within the context of the worldwide increasing frequency of cyanobacterial (CB) blooms, some containing cyanotoxins (CT), the development of a detection/quantification method for the fast analysis a maximum of CT is necessary. This method would allow daily tracking of the toxicity of CB-contaminated water such that, as warranted, appropriate measures can be taken quickly to protect public health. A new technology using laser diode thermal desorption (LDTD) coupled to atmospheric pressure chemical ionization (APCI)-tandem mass spectrometry (MS/MS) has shown great potential to reduce analysis time to seconds. Analytes are desorbed by the LDTD, ionized in gas-phase by APCI and detected by MS/MS. Therefore, there is no chromatographic separation and sample treatment prior to analysis is minimal, depending on the complexity of the sample matrix. Among the four CT tested (microcystin-LR, cylindrospermopsin, saxitoxin and anatoxin-a (ANA-a)), only ANA-a exhibited sufficient desorption which is necessary to develop an analytical method with the LDTD-APCI interface. The strong polarity or high molecular weight of the other CT probably inhibited their efficient desorption. Optimization of instrumental parameters, while accounting for the isobaric interference caused by the acid amino phenylalanine (PHE) in the detection of ANA-a by MS/MS, generated a detection limit of the order of 1 ug/L ANA-a. This value was obtained in a simulated natural matrix, demonstrating that it would be possible to use LDTD to monitor ANA-a in natural waters within the range of current applicable environmental guidelines (1 to 12 ug/L). Because PHE desorption is limited with the LDTD-APCI interface, this method avoids its interference on ANA-a analysis, even at PHE concentrations as high as 500 ug/L.

Cette thèse s’inscrit dans une volonté d’améliorer la compréhension des mécanismes fondamentaux de radiolyse de biomolécules par des ions accélérés, à l’échelle moléculaire. Ainsi, les ions étudiés ont été de différentes nature (H+, He2+, C6+) et de différentes énergies, correspondant à une gamme de densité de dépôt d’énergie allant de 0,3 à 1000 eV/nm.Dans le vivant, l’eau ayant une place prépondérante, la compréhension de la radiolyse de l’eau est essentielle. L’espèce la plus réactive produite en milieu aéré, le radical hydroxyle (HO•) a été quantifiée en utilisant une sonde spécifique, l’acide 3-coumarine-carboxylique.Les dégâts indirects aux biomolécules, via les espèces issues de la radiolyse de l’eau, ont été étudiés en solution aqueuse diluée sur deux systèmes : un acide aminé, la phénylalanine et une protéine, la myoglobine. Les effets directs de radiolyse ont été étudiés sur la myoglobine en gels concentrés hydratés. Les phénomènes de radiolyse ont été caractérisés pour décrire les mécanismes en jeu et les produits issus de la radiolyse de la phénylalanine ont été systématiquement identifiées et quantifiées. / The goal of this thesis is to achieve a better understanding of fundamental mechanisms of the radiolysis of biomolecules by accelerated ions, at the molecular scale. To do so, different type of ions have been used (H+, He2+, C6+) at various energies, corresponding to densities of energy deposition from 0,3 to 1000 eV/nm.The main component in biological systems is water. Therefore, the comprehension of the water radiolysis under ions irradiation is essential. One of the most reactive species produced in aerated conditions, the hydroxyl radical (HO•), has been quantified using a specific probe, the 3- carboxylic acid coumarin.Indirect effects of radiolysis on biomolecules, involving water radiolysis species, have been studied in dilute aqueous solutions on two different systems: phenylalanine, an amino acid, and a protein, myoglobin. Direct radiolysis effect were studied on concentrated hydrogels of myoglobin ad other proteins. Elucidation of radiolysis mechanisms and quantification of phenylalanine radiolysis products were systematically performed.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.