Penicillium digitatum i Penicillium expansum son els patògens més devastadors de fruits cítrics i de llavor, respectivament, i són els responsables d’importants pèrdues econòmiques durant el maneig en postcollita. Una millor comprensió de les interaccions hoste-patogen, incloent els mecanismes de defensa de l'hoste i els factors de virulència del patogen, poden jugar un paper important en el disseny d’estratègies de control noves i més segures. Per assolir aquests objectius generals, es va utilitzar una aproximació multidisciplinar, incloent estudis patològics, bioquímics i moleculars. El primer objectiu d'aquesta tesi va ser estudiar les capacitats d'infecció d'ambdós patògens en taronges i en pomes a diferents estats de maduresa dels fruits, concentracions d'inòcul del patogen i temperatures d'emmagatzematge, per definir les interaccions compatibles i incompatibles. Com que tots dos patògens estudiats requereixen una ferida per iniciar el procés d'infecció, es va estudiar l'efecte de la resposta a la ferida en taronges i en pomes, com un mecanisme de defensa contra els patògens compatibles i els no-hostes. La lignina va ser identificada com un component important implicat en la resposta de defensa a la ferida de taronges i de pomes respecte a patògens compatibles i no-hostes, utilitzant aproximacions histoquímiques i bioquímiques. Es van dur a terme anàlisis transcriptòmiques en resposta als patògens compatibles i als no-hostes per identificar gens implicats en la ruta dels fenilpropanoids. Es va analitzar l'expressió de diversos gens implicats en aquesta ruta utilitzant diferents aproximacions. A més a més, es va avaluar la capacitat de P. digitatum i P. expansum per millorar la seva virulència acidificant de manera local el pH de les taronges i de les pomes. La barreja dels àcids màlic i cítric podria contribuir en l'acidificació de la podridura de les taronges per P. digitatum mentre que la disminució del pH en pomes podrides per P. expansum es va relacionar amb l'acumulació dels àcids glucònic i fumàric. Els resultats globals obtinguts en aquesta tesi ens poden ajudar a comprendre millor els mecanismes de defensa de les fruites i els factors de virulència dels patògens per controlar les malalties de manera més eficaç. / Penicillium digitatum y Penicillium expansum son los patógenos más devastadores de frutos cítricos y de pepita, respectivamente, y son los responsables de importantes pérdidas económicas durante el manejo poscosecha. Una mejor compresión de las interacciones huésped-patógeno, incluyendo los mecanismos de defensa del huésped y los factores de virulencia del patógeno, puede jugar un papel importante en el diseño de estrategias de control nuevas y más seguras. Para alcanzar estos objetivos generales, se utilizó una aproximación multidisciplinar, incluyendo estudios patológicos, bioquímicos y moleculares. El primer objetivo de esta tesis fue estudiar las capacidades de infección de ambos patógenos en naranjas y en manzanas a diferentes estados de madurez de los frutos, concentraciones de inóculo del patógeno y temperaturas de almacenaje para definir las interacciones compatibles e incompatibles. Debido a que ambos patógenos estudiados requieren una herida para iniciar el proceso de infección, se estudió el efecto de la respuesta a la herida en naranjas y manzanas, como un mecanismo de defensa contra los patógenos compatibles y los no-huéspedes. La lignina fue identificada como un componente importante implicado en la respuesta de defensa a la herida de naranjas y manzanas respecto a patógenos compatibles y no-huéspedes, utilizando aproximaciones histoquímicas y bioquímicas. Se llevaron a cabo análisis transcriptómicos en respuesta a los patógenos compatibles y los no-huéspedes para identificar los genes implicados en la ruta de los fenilpropanoides. Se analizó la expresión de varios genes implicados en esta ruta utilizando diferentes aproximaciones. Además, se evaluó la capacidad de P. digitatum y P. expansum para mejorar su virulencia acidificando de manera local el pH de las naranjas y las manzanas. La mezcla de los ácidos málico y cítrico podría contribuir en la acidificación de la podredumbre de las naranjas por P. digitatum mientras que la disminución del pH en manzanas podridas por P. expansum se relacionó con la acumulación de los ácidos glucónico y fumárico. Los resultados globales obtenidos en esta tesis nos pueden ayudar a comprender mejor los mecanismos de defensa de las frutas y los factores de virulencia de los patógenos para controlar las enfermedades de manera más eficaz. / Penicillium digitatum and Penicillium expansum are the most devastating pathogens of citrus and pome fruits, respectively, and are responsible for important economical losses during postharvest handling. A better understanding of host-pathogen interactions, including host defence mechanisms and pathogen virulence factors, can play an important role to design new and safer control strategies. To achieve these general objectives, a multidisciplinary approach including pathological, biochemical and molecular studies was used. The first objective of this thesis was to study the infection capacities of both pathogens in oranges and apples at different maturity stages of fruit, pathogen inoculum concentrations and storage temperatures to define compatible and incompatible interactions. Due to both studied pathogens require a wound to initiate the infection process, the effect of wound response in oranges and apples was studied as a defence mechanism against compatible and non-host pathogens. Lignin was identified as an important compound involved in the orange and apple wound response to compatible and non-host pathogens using histochemical and biochemical approaches. Transcriptomic analysis in response to the compatible and non-host pathogens were conducted to identify apple genes involved in phenylpropanoid pathway. The expression of several genes involved in this pathway was analysed in oranges and in apples using different approaches. In addition, the ability of P. digitatum and P. expansum to enhance their virulence by locally acidifying the pH of oranges and apples was evaluated. The mixture of malic and citric acids could at least contribute to the acidification of P. digitatum-decayed oranges while the pH decrease in P. expansum-decayed apples was related to the accumulation of gluconic and fumaric acids. Overall results obtained in this thesis can help us to better understand fruit defence mechanisms and pathogen virulence factors to control diseases more effectively.

Las micotoxinas son contaminantes químicos de origen biológico que suponen el mayor riesgo en la cadena alimentaria, debido a su amplia presencia y a los múltiples efectos perjudiciales que producen en los seres humanos y en los animales. En esta Tesis se ha puesto de manifiesto la elevada incertidumbre asociada al muestreo para la determinación del contenido de micotoxinas en pistachos, dentro del sistema de gestión de seguridad alimentaria. También se ha evaluado como posible reto emergente en la gestión, los posibles efectos derivados de un hipotético cambio climático caracterizado por incremento de la temperatura, radiación ultravioleta y sequedad en la micobiota ocratoxigénica presente en uvas y cereales. Las principales conclusiones obtenidas son: i) posible adaptación de las especies micotoxigénicas; ii) predominancia de aspergilos negros en las condiciones más extremas; iii) ineficacia de los antifúngicos en el control de ocratoxina A y posible necesidad de transición de unas materias activas a otras en función de las condiciones climáticas. / Mycotoxins are biologically derived chemical contaminants that pose the greatest risk in the food chain due to their widespread occurrence and the many detrimental effects that occur in humans and in animals. This thesis has highlighted the high uncertainty associated with the sampling for the determination of mycotoxins in pistachios, within the system of food safety management. The possible effects of a hypothetical climate characterized by increased temperature, drought and UV radiation on ocrhatoxigenic mycobiota of grapes and cereals has also been evaluated as a possible emerging management challenge. The main conclusions are: i) possible adaptation of mycotoxigenic species; ii) predominance of black aspergili under extreme conditions; iii) loss of antifungal effective in controlling ochratoxin A and possible need to transition from an active ingredient to another depending on the weather materials.

Pantoea agglomerans CPA-2 es un agente de biocontrol (ACB) eficaz en el control de enfermedades de postcosecha en fruta de pepita y cítricos. No obstante, para implementar y registrar su uso como estrategia práctica de control en Europa es importante evaluar la capacidad del ACB para colonizar, persistir y propagarse en condiciones habituales de aplicación con un método de detección que permita diferenciar al antagonista del resto de la microbiota. La presente tesis doctoral tuvo como objetivo fundamental el desarrollo de técnicas moleculares para la detección y cuantificación específica de CPA-2 en su proceso de formulación y en su entorno de aplicación (pre- y postcosecha). Para cumplir este objetivo, en primer lugar se desarrolló y validó la técnica de qPCR, pero se observó la limitación de esta técnica al no discriminar entre el ADN de las células viables y las no viables de la superficie de manzanas conservadas a medio y largo plazo. Esta limitación se superó con un pre-tratamiento de las muestras con propidio de monoazida (PMA) en combinación con la qPCR (PMA-qPCR). Posteriormente, la técnica desarrollada del PMA-qPCR se aplicó para determinar la supervivencia del ACB después de su formulación por liofilización, lecho fluido y atomización pero también para evaluar su dinámica poblacional sobre la superficie de naranjas tratadas en pre- y postcosecha, siendo el primer estudio donde se aplica a un ACB. Finalmente, se estudió la persistencia de CPA-2 en tratamientos de pre- y postcosecha, confirmando su presencia mediante PCR convencional. Los resultados de esta tesis demuestran la versatilidad de las técnicas moleculares basadas en la PCR (qPCR, PMA-qPCR y PCR convencional) para detectar y cuantificar la población de CPA-2 durante su formulación y en las condiciones ambientales de aplicación. Así como la limitada dispersión y baja persistencia de CPA-2 en su entorno de aplicación. / Pantoea agglomerans CPA-2 és un agent de biocontrol (ACB) eficaç en el control de malalties de postcollita en fruita de llavor i cítrics. No obstant, per implementar  i registrar el seu ús com estratègia pràctica de control a Europa és important avaluar la capacitat de l’ACB per colonitzar, persistir i propagar-se en condicions habituals d’aplicació amb un mètode de detecció que permeti diferenciar a l’antagonista de la resta de la microbiota. La present tesis doctoral va tenir com objectiu fonamental el desenvolupament de tècniques moleculars per a la detecció i quantificació específica de CPA-2 en el seu procés de formulació i en el seu entorn d’aplicació (pre- i postcollita). Per complir aquest objectiu, en primer lloc es va desenvolupar i validar la tècnica de qPCR, però es va observar la limitació d’aquesta tècnica al no discriminar entre el ADN de les cèl·lules viables i les no viables de la superfície de pomes conservades a mig i llarg termini. Aquesta limitació es va superar amb un pretractament de les mostres amb propidi de monoàcida (PMA) en combinació amb la qPCR (PMA-qPCR). Posteriorment, la tècnica desenvolupada del PMA-qPCR es va aplicar per determinar la supervivència de l’ACB després de la seva formulació per liofilització, llit fluït i atomització però també per avaluar la seva dinàmica poblacional sobre la superfície de taronges tractades en pre- i postcollita, sent el primer estudi on s’aplica a un ACB. Finalment, es va estudiar la persistència de CPA-2 en tractaments de pre i postcollita, confirmant la seva presència mitjançant PCR convencional. Els resultats d’aquesta tesis demostren la versatilitat de las tècniques moleculars basades en la PCR (qPCR, PMA-qPCR i PCR convencional) per detectar i quantificar la població de CPA-2 durant la seva formulació i en les condicions ambientals d’aplicació. Així com la limitada dispersió i baixa persistència de CPA-2 en el seu entorn d’aplicació. / Pantoea agglomerans CPA‑2 is a biocontrol agent (ACB) effective in the control of postharvest diseases in pome fruit and citrus. However, in order to implement and register the use of this ACB as a practical control strategy in Europe, it is first necessary to evaluate the ability of the antagonist to colonize, persist and spread in its normal operating conditions with a screening method to identify and quantify the ACB of the rest of the microbiota. The main goal of the present thesis was the development of molecular techniques for the identification and quantification of CPA‑2 strain in its formulation and application in the environment (pre- and postharvest). To achieve this objective, the development and validation of qPCR technique was due at first, however this technique was not able to discriminate between the DNA of viable and non‑viable cells of apple surface stored at middle and long time. This limitation was overcome by treating the samples with the DNA intercalator, propidium of monoazide (PMA), combined with qPCR (PMA‑qPCR). Furthermore, PMA‑qPCR technique was applied to determine the survival of CPA‑2 after its formulation by freeze drying, spray drying and fluidized bed drying; and to assess the population dynamics of the antagonist on the surface of pre‑treated and postharvest oranges, it was the first study where this technique was applied in ACB. Finally, CPA‑2 persistence in pre‑ and postharvest treatment was studied and its presence was confirmed by conventional PCR. The results presented in this thesis demonstrate the versatility of molecular techniques based on PCR (qPCR, PMA‑qPCR and conventional PCR) to detect and quantify P. agglomerans CPA‑2 in normal operating conditions.

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La contaminación de los alimentos por sustancias químicas es un problema de salud pública de gran preocupación a escala mundial. El motivo puede ser consecuencia de la contaminación ambiental que puede alcanzar a las cadenas alimentarias a través del aire, del agua y del suelo. Contribuye también el uso intencionado de diversos productos químicos, tales como pesticidas, fármacos o sustancias administradas a los animales, y de otros productos agroquímicos (abonos, etc). Algunos aditivos utilizados en alimentos así como la fabricación y el procesamiento de los mismos también pueden aportar contaminantes.Por tanto son muchos los contaminantes orgánicos que pueden estar presentes en alimentos, como micotoxinas, plaguicidas, y otros compuestos asociados a la contaminación ambiental o bien sustancias que por el procesado, conservación y/o envasado pueden encontrarse en los alimentos. Para vigilar la seguridad alimentaria, diversas agencias medioambientales y de calidad se encargan de que la legislación se cumpla de forma rigurosa, mediante la aplicación de métodos analíticos adecuados para la detección de contaminantes en alimentos de forma rápida y eficaz, utilizando metodologías multirresiduo y realizando muestreos y controles sobre los alimentos en fase de comercialización.A lo largo del último siglo, los avances logrados en las condiciones sanitarias de las producciones vegetales y animales junto con el establecimiento de los sistemas veterinarios de higiene e inspección de los alimentos, han conducido a una situación de garantías sanitarias excelentes. A pesar de ello, el interés de la población por la "seguridad alimentaria" se ha convertido en una exigencia por parte de los ciudadanos en tanto que son consumidores responsables. El análisis de contaminantes orgánicos en alimentos engloba muchas disciplinas incluidas la química, bioquímica y la microbiología. Están presentes a unas concentraciones extremadamente bajas, en mezclas complejas de compuestos de los alimentos naturales. Sin embargo, cualquier técnica que se utilice en el análisis de alimentos debe alcanzar o ser capaz de separar los compuestos de la matriz y la identificación de los contaminantes a niveles traza.En esta tesis, el objetivo principal fue la determinación de residuos de diferentes contaminantes orgánicos (plaguicidas y medicamentos veterinarios) por diferentes técnicas cromatográficas a fin de obtener resultados que permitan poner de manifiesto el grado de seguridad alimentaria.Para ello, se abordan diversos objetivos parciales: 1.-Extracción de residuos de plaguicidas y medicamentos veterinarios por procedimientos clásicos de extracción en fase sólida, y otros más innovadores, como extracción sobre barras magnéticas y extracción presurizada con disolventes. 2.- Análisis de plaguicidas por cromatografía líquida-espectrometría de masas previa utilización de los métodos de extracción en fase sólida y extracción sobre barras magnéticas. 3.-Comparación de las técnicas de preconcentración en línea, para el análisis de plaguicidas a fin de alcanzar unos límites de detección adecuados para su determinación en frutas y verduras por electroforesis capilar. 4.-Estudiar el empleo de la espectrometría de masas como técnica de determinación acoplada a la electroforesis capilar en sus variantes electroforesis capilar-simple cuadrupolo y electroforesis capilar-trampa de iones para llevar a cabo la detección de residuos de plaguicidas y medicamentos veterinarios. 5.-Aplicación de los procedimientos de análisis seleccionados a diversos alimentos de origen vegetal como, uva, fresa, tomate, lechuga, melocotones, y nectarinas, y alimentos de origen animal como pescado y carne de pollo y cerdo.Se concluyó que la determinación simultánea y cuantitativa en muestras de alimentos procedentes de la Comunidad Valenciana, mediante la utilización de extracción en fase sólida, extracción sobre barras magnéticas o extracción presurizada con disolventes y electroforesis capilar con detector de filas de diodos o espectrometría de masas, pone de manifiesto la utilidad de la electroforesis capilar en la determinación de residuos de plaguicidas en matrices complejas hortofrutícolas como uva, lechuga, tomate, fresa, melocotón y nectarinas y residuos de medicamentos veterinarios en alimentos de origen animal como pescado y carne de pollo y cerdo.La presencia de residuos de contaminantes orgánicos en alimentos, aunque en un pequeño porcentaje de muestras y generalmente a bajas concentraciones, hace necesario el desarrollo y la optimización de métodos para que su correcta determinación permita una adecuada seguridad alimentaria. / Food contamination by chemical substances is a Public Health problem, all over the world. The cause could be as a consequence of environmental contamination that food chains could rise through air, water and soil as it occurs in the case of metals, PCBs, dioxins, etc. Contribute also the deliberate (intentionate) use of several chemical products, as pesticides, drugs or different substances administrated to animals and other agrochemical products. Few additives used in food as manufacturing and processing that can also contribute to add contaminants.In order to control food safety, several environmental and quality agencies take care of the compliance of legislation, through the application of adequate analytical methods to determinate in quick and efficient of contaminants in food by using multirresidue methodologies and carrying out sampling and food controls in food in commercializing phase.To analyze organic contaminants in food is a hard task which implies different and many disciplines as chemistry, biochemistry and microbiology. It is not a easy task, and many contaminants could be enumerated. They are presented at very low concentrations, complex matrices and among compounds of natural food. However, to analyze samples with complex matrices and with analytes at very low concentrations makes necessary to apply separation techniques in analytical procedures with the double objective of improve selectivity and sensibility. In this context, different separation analytical techniques, being of special relevance chromatographic techniques has been developed, because of the importance in actual analytical chemistry.The objective of this thesis is the determination of residues of two organic contaminants, pesticides and veterinary drugs, by using different chromatographic techniques to evaluate the degree of food safety.For this, partial objectives have to be approached: 1.-Pesticide and veterinary drugs residues extraction by using classical extraction procedures, as solid phase extraction and other more innovatives, as stir bar sorptive extraction and pressurized solvent extraction. 2.-Pesticide analysis by liquid cromatography-mass spectrometry previous the use of the extraction methods like solid phase extraction and stir bar sorptive extraction. 3.-Comparison of on-line preconcentration techniques, for the pesticide analysis in order to reach adequated limits of detection for its determination in fruits and vegetables by capillary electrophoresis. 4.-Study the use of mass spectrometry as a determination technique coupled to capillary electrophoresis using different mass analyzers, capillary electrophoresis-single quadrupole and capillary electrophoresis-ion trap to carry out these techniques in pesticide and veterinary drugs residue detection. 5.-Apply the selected analytical procedures to different vegetable products as grapes, strawberry, tomato, lettuce, peaches and nectarines, as well as to animal food such as fish, chicken and pork.It was concluded that the quantitative and simultaneous determination in food samples from Valencian Community, through solid phase extraction, sitr-bar sorptive extraction or pressurized liquid extraction and by capillary electrophoresis with diode array or mass spectrometry detection, make known the utility of capillary electrophoresis for pesticide residues determination in complex fruit and vegetable matrices as grape, lettuce, tomato, strawberry, peach and nectarines and veterinary drug residues in animal origin food as fish and chicken and pork meat.The presence of organic contaminants residues in food, although in few samples percentage and often at a low concentrations, makes necessary to develop and optimize methods in order to ensure that its correct determination allows an appropriate food safety.

Las micotoxinas son sustancias producidas por determinados hongos presentes en alimentos destinados para alimentación humana o animal, y por su carácter tóxico pueden dar lugar a las enfermedades denominadas micotoxicosis.De ellas son las aflatoxinas (AFs) y la ocratoxina A (OTA) las que mayor preocupación han generado en el Comité Científico de Alimentación Humana de la Unión Europea, debido a los riesgos que el consumo continuado de estas micotoxinas a través de los alimentos comporta para la salud humana, por su poder mutagénico y cancerígeno, que se ha visto demostrado en animales expuestos a alimentos contaminados por ellas. La presencia natural de AFs y OTA está asociada a diferentes alimentos, por el crecimiento de especies fúngicas. Así las AFs se pueden encontrar en maíz, cacahuetes, arroz, vino y semillas de soja, debido al crecimiento en ellos de las especies fúngicas Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. nomius. Mientras que la OTA se ha encontrado en cereales y derivados, legumbres, café, especias, cacao, frutos secos, malta y bebidas como la cerveza, por el crecimiento de los hongos Penicillium verrucosum y A. ochraceus. Las medidas legislativas sobre micotoxinas son recientes y en la actualidad cuentan con regulación específica a nivel comunitario las AFs y la OTA, entre otras. Y sólo para algunos alimentos se han establecido contenidos máximos admisibles, ingestas diarias y semanales tolerables y protocolos para su control, en el análisis y toma de muestras. Por este motivo los objetivos de esta tesis han sido:- Estudiar la extracción de AFs y OTA.- Estudiar la determinación de AFs y OTA por cromatografía líquida con diferentes técnicas de detección.- Aplicar los métodos seleccionados al análisis de materias primas y alimentos elaborados.- Calcular la ingesta diaria de AFs y OTA y su comparación con las ingestas diarias admisibles establecidas por el comité mixto de expertos de la FAO/OMS sobre aditivos alimentarios.Para ello se han empleado la técnica de extracción clásica con disolventes orgánicos, la extracción acelerada, dispersión de matriz en fase sólida, extracción con fluidos supercríticos y extracción con columnas de inmunoafinidad. Y se ha realizado estudio de la determinación de AFs y OTA por cromatografía líquida con las técnicas de detección fluorescencia, espectroscopia de masas y masas-masas. Estos métodos se han aplicado para el análisis de cereales y derivados, frutas, frutos secos y piensos procedentes de España, Portugal y Marruecos.Con los datos obtenidos se ha realizado el cálculo de la ingesta diaria de AFs y OTA utilizando los datos de consumo de cada país. El riesgo que implica el consumo de estas micotoxinas se ha evaluado comparando la ingesta diaria real con las ingestas diarias admisibles establecidas por el comité mixto de expertos de la FAO/OMS sobre aditivos alimentarios. Con el trabajo realizado, se puede concluir que: La extracción líquida presurizada de OTA ha proporcionado los resultados más exactos, precisos y reproducibles.La confirmación de la OTA por espectrometría de masas de triple cuadrupolo proporciona resultados más selectivos aunque la sensibilidad es ligeramente superior con la detección de fluorescencia.La incidencia de OTA en arroz ha sido del 13 % para las muestras procedentes de Portugal, 14 % para las de España y 39 % para las de Marruecos. En las muestras de pan analizadas esta incidencia ha sido del 39 % para las procedentes de Portugal y un 48 % para las de Marruecos. En los frutos secos procedentes de Marruecos, se ha obtenido una incidencia del 31 %.La incidencia de AFs en cereales, frutos secos y piensos comercializados en Marruecos es del 51, 26 y 67 %, respectivamente. De ellas, la AFB1 es la más frecuente y de mayor concentración.Las ingestas diarias estimadas de OTA por el consumo de los alimentos analizados son: 1 ng/kg pc/día para España, 4.27 ng/kg pc/día para Portugal y 125.5 ng/kg pc/día para Marruecos. La ingesta diaria estimada de AFs para la población de Marruecos es de 15.22 ng/kg pc/día. / Mycotoxins are receiving increasing attention for its toxic effects and high incidence in a wide range of food commodities. Sufficient experimental evidence for carcinogenicity in animal studies has led to the classification of ochratoxin A as a possible human carcinogen (group 2B) and aflatoxin B1 as carcinogen (group 1) by the International Agency for Research on Cancer (IARC 1993). The Joint Committee FAO/WHO of Experts on Food Additives (JECFA) has established a provisional tolerable weekly intake (PTWI) of OTA at 100 ng kg/ of body weight corresponding to approximately 14 ng /kg body weight/day (JECFA 2001) and for aflatoxins as low are possible (ALARA).In Mediterranean and North African (Morocco) Area the climatic conditions characterized by high humidity and temperature and inadequate storage contribute to the potential for a significant mycotoxins exposure of population. Due to the significant health risks, it is important to establish a data collection on the occurrence of aflatoxins and ochratoxin A in foods. Much attention has been paid recently in the world to monitor the presence of aflatoxins and ochratoxin A in agricultural products intended for consumption and/or exportation.So that the objectives of this thesis were: study different OTA extraction methods in several matrices; analyze AF and OTA by liquid chromatography using different detection techniques; study different confirmatory processes of AF and OTA; evaluate the presence of AF and OTA in cereals, cereal products, dry fruits and poultry feed, purchased from supermarkets and markets from Spain, Portugal and Morocco; estimate daily intake of AF and OTA for Spanish, Portuguese and Moroccan population through analyzed samples; and compare AF and OTA estimated daily intake with tolerable daily intake proposed by official organisms, in order to evaluate the risk of exposing to both mycotoxins.

Ochratoxin A (OTA) is a fungal secondary metabolite produced by Aspergillus and Penicillium species. It has been detected in a wide range of commodities, including cereals, coffee, grapes, raisins, must and wine. Within grape derivative products, the raisins, red wine and sweet wines have reported to contain the highest OTA levels. Aspergillus section Nigri (A. niger and A. carbonarius) are considered the OTA source in these commodities and they are commonly isolated among other fungi from grapes and raisins.Starting from this basis the objectives of this thesis were focused into three main aspects: (1) Evaluation of the food products: vine dried fruits and special wines, concerning the mycobiota and OTA occurrence and incidence; (2) Ecophysiological studies of the ochratoxigenic fungi and accompanying mycobiota as affected by environmental conditions; (3) Control and preventive methods such as the evaluation of residual activity of pre-harvest fungicides during grape dehydration and the use of modified atmospheres.Wine origin and winemaking procedure showed to be determinant for the final OTA content. All special wines analysed from northern European regions were negative for OTA while more than 50% of wines from warmer regions were positive for OTA contamination. The wines with higher OTA levels were fortified musts followed by those made from dried grapes. Acoholic and malo-lactic fermentations, biological 'crianza' (Flor yeast) and the action of Botrytis cinerea in noble rot of grapes may diminish the OTA levels in wine.In grapes, the presence of Aspergillus section Nigri became predominant at harvest and mainly during sun-drying. Prevalence of Aspergillus section Nigri can be explained by their adaptation to environmental conditions of sun-drying, and by their ability to dominate other fungal species involved when coming into contact with them. Among the Aspergillus section Nigri, A. niger aggregate was dominant, although A. carbonarius increased its inci

S’ha realitzat l’estudi de l’efecte del processat de suc de raïm amb polsos elèctrics d’alta intensitat de camp (PEAIC) amb la intenció d’aconseguir la seva conservació. Els seus efectes s’han mesurat en diferents propietats característiques del suc de raïm com el contingut en sòlids solubles, pH, acidesa, conductivitat elèctrica, activitat microbiològica i enzimàtica, alguns compostos bioactius com el contingut en polifenols o vitamina C i capacitat antioxidant. Els valors obtinguts s’han comparat amb els obtinguts del tractament conservant de referència actual, el processat tèrmic. També s’ha determinat l’evolució de components específics durant el procés de vinificació des de l’obtenció del suc de raïm fins a l’envelliment del vi. L’estudi s’ha dut a terme en 4 fases en les que s’ha determinat que els PEAIC redueixen el contingut microbià del suc de raïm, tant l’inoculat com el natural, i l’activitat enzimàtica oxidativa. Així mateix, s’ha constatat que es possible optimitzar el procés tenint en compte les característiques de l’equipament i el medi. La comparació dels resultats de les variables estudiades amb aquesta tecnologia i amb tractament tèrmic a permès evidenciar que els efectes dels PEAIC són menys dràstics, fet que permet la seva utilització en l’elaboració de suc de raïm i vi sense que afecti negativament al procés o a l’envelliment del producte. La principal conclusió de l’estudi amb les dades obtingudes de tres varietats habitualment utilitzades a Catalunya és que el processat amb PEAIC és una eina de conservació del suc de raïm viable des del punt de vista tecnològic. L’adquisició de dades d’altres varietats i temporades fora de gran utilitat per ampliar aquesta conclusió. / Se ha realizado el estudio del efecto del procesado de zumo de uva con pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC) para su conservación. Los efectos se han medido en distintas propiedades características del zumo de uva como el grado brix, pH, acidez, conductividad eléctrica, actividad microbiológica y enzimática, algunos compuestos activos biológicamente como el contenido en polifenoles o vitamina C y la capacidad antioxidante. Los valores obtenidos se han comparado con los del tratamiento conservante de referencia, es decir, el tratamiento térmico. También se ha determinado la evolución de compuestos específicos durante el procesado desde el zumo de uva hasta el envejecimiento del vino. El estudio se ha realizado en 4 fases en las que se ha observado que los PEAIC reducen claramente la micro flora del zumo de uva, tanto la inoculada como la natural, así como la actividad enzimática oxidante. Se ha confirmado, además, que es posible optimizar esta reducción teniendo en cuenta las características del equipo de procesado y el medio. La comparación de resultados de las variables estudiadas tras el procesado PEAIC con el tratamiento térmico ha permitido constatar que los efectos de los PEAIC son menos drásticos lo que permitiría su uso como tratamiento en la elaboración del zumo y vino sin que afecte negativamente al proceso de vinificación o a su envejecimiento. La principal conclusión del estudio con los datos de tres variedades habitualmente utilizadas en Cataluña es que el procesado mediante PEAIC para la conservación de zumo de uva es técnicamente viable. La obtención de nuevos datos de otras variedades y distintas vendimias seria útil para poder generalizar esta conclusión. / The effect of pulsed electric fields as a preservation method on grape juice was studied. Its effects were measured on typical grape juice properties such as brix degrees, pH, acidity, electrical conductivity, microbial and enzymatic activities, and some bioactive compounds like vitamin C and polyphenol contents or antioxidant activity. The obtained values were compared with the current preservative reference technology, which is the heat processing. It was also analysed the effect of PEF on the evolution of specific compounds throughout the wine making process from juice to ageing. The study was carried out in 4 phases. It was observed a clear reduction of the microbial populations of both, inoculated and natural flora, as well as the oxidant enzymatic activities of grape juice. Besides, these effects were optimised taking into account the PEF processing device and the food product. The comparison of both treatments revealed that the PEF treatment yielded milder values of the variables than the thermal treatment. Therefore it could be used in juice and wine making without a negative impact on the quality of the product. The main conclusion inferred from the study is that on three commonly used Catalan varieties PEF processing is a feasible technology to preserve grape juice. New data coming from different varieties and years should broaden this conclusion.

L‟olivicultura de la comarca del Priorat es basa en la varietat „Arbequina‟ i està inclosa dins la DOP “Siurana” (Tarragona) on ocupa unes 2.900 ha que produeixen 4.700 t d‟olives i 900 t d‟oli, que ha de competir amb unes 100.000 t d‟oli d‟aquesta varietat produïdes a tot el mon, més de la meitat fora de Catalunya i amb tecnologies de producció modernes que permeten reduir costos i millorar la rendibilitat. Per aquest motiu els productors de la zona van fundar l‟Associació d‟Oleïcultors del Priorat (AOP) amb la finalitat de crear una estructura comercial que permetés accedir a mercats d‟alt preu, semblants als que utilitzen els vins de qualitat de la comarca. La AOP signà el 2002 un conveni amb l‟IRTA i el DAAM per a desenvolupar un programa científico-tècnic que permetés la caracterització i tipificació dels olis de la comarca, establint criteris objectius de selecció d‟aquells olis de qualitat superior i diferenciable de la resta d‟olis de „Arbequina‟ de Catalunya, per a facilitar la seva comercialització. Aquesta tesis doctoral inclou tots els aspectes científics sobre els que està fonamentada l‟aplicació comercial d‟aquest programa. Els objectius fixats són: (1) caracteritzar els olis produïts a la comarca, a nivell fisicoquímic i sensorial; (2) constatar si aquests olis són objectivament diferents dels d‟altres zones, produïts amb la mateixa varietat „Arbequina‟; (3) identificar en què consisteix la seva tipicitat, relacionant-la amb factors propis del clima i sòls de la comarca; i (4) caracteritzar l‟olivicultura i elaiotècnia de la comarca. Els treballs s‟han desenvolupat durant sis campanyes successives (2002-03 a 2008-09) i es basen en l‟anàlisi sistemàtica de pràcticament el 100% dels olis produïts a la comarca durant aquests anys (6.308.124 litres), la descripció de l‟olivicultura de la zona (mitjançant enquesta) i dels processos d‟extracció (descripció de les instal·lacions i anotació de les condicions de procés en campanya) i l‟estudi de la relació existent entre l‟oli i els factors de producció, edàfics i climàtics. Als olis s‟han analitzat les característiques sensorials, paràmetres fisicoquímics de qualitat, àcids grassos, esterols, polifenols totals, índex d‟amargor, estabilitat i, en alguns casos, ceres i compostos volàtils. La metodologia utilitzada és similar a la dels nombrosos treballs de tipificació i caracterització d‟olis d‟oliva verge, normalment associats a DOP espanyoles i d‟Itàlia, la qual fiabilitat està relacionada amb la representativitat de les mostres d‟oli analitzades i que apliquen tècniques estadístiques univariants i multivariants diverses. Els resultats demostren que fins un 54% dels olis de la zona Priorat, elaborats majoritàriament amb „Arbequina‟, es poden diferenciar objectivament dels d‟altres zones productores del mon que utilitzen la mateixa varietat, inclús de les veïnes Garrigues i Siurana-Camp. Aquestes diferències ho són tant a nivell sensorial (principalment els atributs picant, aromes secundàries, fruitat, astringència i dols), como a nivell d‟àcids grassos (principalment palmitoleic, oleic, palmític i esteàric). Existeix una variabilitat intrazonal (inferior al 20% en tots els paràmetres, excepte els esterols) que sembla aleatòria en el cas d‟atributs sensorials i, en el cas de la composició química, està relacionada amb factors geogràfics, de tècniques de cultiu i de clima de cada municipi. Les diferències respecte d‟altres zones veïnes on es cultiva la mateixa varietat estan relacionades amb l‟orografia i geologia particular de la comarca (més del 50% de plantacions estan a més de 400 m d‟altitud i sobre sòls del Paleozoic de baixa fertilitat i amb zones de transició cap a sòls sedimentaris del quaternari cap al Camp de Tarragona i del terciari cap a Les Garrigues) i amb el clima particular i bastant homogeni a tota la zona (règim termo-pluviomètric de tipus “mediterrani prelitoral sud”, amb transició cap a “mediterrani continental sec” a Les Garrigues i “mediterrani litoral sud” al Camp de Tarragona). S‟ha definit un model matemàtic per a predir si una partida d‟olives té possibilitats de produir olis de qualitat suficient per a la seva diferenciació, així com funcions discriminants de Fischer per a determinar si el perfil sensorial o la composició en àcids grassos d‟un oli són típics de la comarca del Priorat i, per tant, diferenciables de les zones veïnes. Actualment, els resultats d‟aquests treballs serveixen de base per a establir les estratègies comercials de venda dels olis del Priorat. Els moliners i envasadores trien aquells olis considerats com típics de la zona per a ser envasats (s‟ha passat del 20% al inici del programa fins al 65% actual), dedicant la resta de la producció a l‟autoconsum i al mercat a doll / El olivar de la comarca del Priorat se basa en el cultivo de la variedad „Arbequina‟ y está incluido en la DOP “Siurana” (Tarragona), ocupando unas 2.900 ha que producen 4.700 t de aceitunas y 900 t de aceite, que debe competir con unas 100.000 t de aceite de esta variedad producidas en todo el mundo, más de la mitad fuera de Cataluña y con tecnologías de producción modernas que permiten reducir los costes y mejorar la rentabilidad. Por este motivo, los productores de la zona fundaron la Asociación de Oleicultores del Priorat (AOP) con el fin de crear una estructura comercial que permitiera acceder a mercados de alto precio, parecidos a los que utilizan los vinos de calidad de la comarca. La AOP firmó, en 2002, un convenio con el IRTA y el DAAM para desarrollar un programa científico-técnico que permitiera la caracterización y tipificación de los aceites de la comarca, estableciendo criterios objetivos de selección de aquellos aceites de calidad superior y diferenciable del resto de aceites de „Arbequina‟ de Cataluña, para facilitar su comercialización. La presente tesis doctoral incluye todos los aspectos científicos sobre los que se fundamenta la aplicación comercial de este programa. Los objetivos que se plantean son: (1) caracterizar los aceites producidos en la comarca, a nivel físico-químico y sensorial; (2) constatar si estos aceites son objetivamente diferentes de los de otras zonas producidos con la misma variedad „Arbequina‟; (3) identificar en qué consiste su tipicidad, relacionándola con factores propios del clima y suelos de la comarca; y (4) caracterizar la olivicultura y elaiotecnia de la comarca. Los trabajos se han desarrollado durante seis campañas (2002-03 a 2008-09) y se basan en el análisis sistemático de prácticamente el 100% de los aceites producidos en la comarca durante esos años (6.308.124 litros), la descripción de la olivicultura de la zona (mediante encuesta) y de los procesos extractivos (descripción de las instalaciones y anotación de las condiciones de proceso en campaña) y el estudio de la relación existente entre el aceite y los factores tanto de producción como edáficos y climáticos. En los aceites se han analizado las características sensoriales, parámetros físico-químicos de calidad, ácidos grasos, esteroles, polifenoles totales, índice de amargor, estabilidad y, en algunos casos, ceras y compuestos volátiles. La metodología utilizada se basa en los numerosos trabajos de tipificación y caracterización de aceites de oliva virgen, normalmente asociados a DOP españolas e italianas, cuya fiabilidad está relacionada con la representatividad de las muestras de aceite analizadas y que aplican técnicas estadísticas univariantes y multivariantes diversas. Los resultados demuestran que hasta un 54% de los aceites de la zona Priorat, elaborados mayoritariamente con „Arbequina‟, pueden diferenciarse objetivamente de los de otras zonas productoras del mundo que utilizan la misma variedad, incluso de las vecinas Garrigues y Siurana-Camp. Dichas diferencias lo son tanto a nivel sensorial (principalmente los atributos picante, aromas secundarios, frutado, astringencia y dulzor), como a nivel de ácidos grasos (principalmente palmitoleico, oleico, palmítico y esteárico). Existe una variabilidad intrazonal (inferior al 20% en todos los parámetros, excepto los esteroles) que parece aleatoria en el caso de atributos sensoriales y que, en el caso de la composición química, está relacionada con factores geográficos, de técnicas de cultivo y de clima de cada municipio. Las diferencias respecto de otras zonas vecinas, donde se cultiva la misma variedad, están relacionadas con la orografía y geología particular de la comarca (más del 50% de plantaciones están a más de 400 m de altitud y sobre suelos del Paleozoico de baja fertilidad y con zonas de transición hacia suelos sedimentarios del cuaternario hacia el Camp de Tarragona y del terciario hacia Les Garrigues) y con el clima particular y bastante homogéneo en toda la zona (régimen termopluviométrico de tipo “mediterráneo prelitoral sur”, con transición hacia el “mediterráneo continental seco” de Les Garrigues y el “mediterráneo litoral sur” del Camp de Tarragona). Se ha definido un modelo matemático para predecir si una partida de aceitunas tiene posibilidades de producir aceites de calidad suficiente para su diferenciación, así como funciones discriminantes de Fischer para determinar si el perfil sensorial o la composición en ácidos grasos de un aceite son típicos de la comarca del Priorat y, por tanto, diferenciables de las zonas vecinas. Actualmente, estos resultados sirven de base para establecer las estrategias comerciales de venta de los aceites del Priorat. Los almazareros y envasadores escogen aquellos aceites considerados como típicos de la zona para su envasado (se ha pasado desde un 20% al inicio del programa hasta el 65% actual), dedicando el resto de la producción al autoconsumo y al mercado de graneles. / Olive production in the Priorat area raws on „Arbequina‟ cultivar and is included into PDO “Siurana” (Tarragona), with 2.900 ha and yielding 4.700 t fruits in average, equivalent to 900 t of virgin oil. This oil competes with 100.000 t of oil from the same cultivar produced worldwide (more than a half out of Catalonia and using new technologies to reduce costs and enhance profitability). This was the reason to promote the Priorat‟s Producer Association (PPA) in order to build a commercial structure to gain high value markets, similar to those used by high quality wines of this area. PPA proposed in 2002 an agreement with IRTA and the Agricultural Services from the Catalan Government with the aim to develop a scientific and technical program to characterize and differentiate virgin oils from Priorat and setting objective criteria to select high quality oils different from others „Arbequina‟. This ought to improve current commercialization. This thesis includes all scientific aspects supporting the commercial application of the program. Research goals were: (1) to characterize oils from Priorat using physic, chemical and sensorial parameters; (2) to assess if these oils can be differentiated from others produced with the same cultivar „Arbequina‟ in other regions; (3) to test their “typicality”, related to Priorats‟ climate and soil characteristics; and (4) to characterize olive production and mill technology in Priorat. The study was carried out during a six years period (2002-03 to 2008-09 harvests) with systematic analysis of almost 100% virgin oil produced in the area (6.308.124 liters). Olive crop production was studied using a questioner, while mill technology was assessed by registering processing conditions along harvest every year. The relationship between oil quality and climate, soils and cultural practices was studied. Chemical parameters analyzed were: sensory profile, physic and chemical quality parameters, fatty acids, sterols, total polyphenols, bitterness index, stability and, sometimes, waxes and volatiles. Methodology was similar to that applied in many scientific studies on virgin oil characterization in wide areas, usually linked to PDO in Spain and Italy. Results reliability depends on oil sampling representativeness. Both univariate and multivariate statistics were used. Results show that up to 54% of Priorat virgin oils made with „Arbequina‟ can be classified to be typical and different from other producing regions, even the neighboring areas of Garrigues and Siurana-Camp. Such differences are both sensorial (mainly pungency, secondary aromas, fruity, astringency and sweet) and chemical (fatty acids palmitoleic, oleic, pamitic, and stearic). Variability between Priorat areas, is lower than 20% (except for sterols) and seems to be random for sensory profile while is related to geography, cultural practices and climate, for chemical composition. Differences to other regions with the same cultivar are related to the Priorat‟s geography and geology (more than 50% orchards are placed higher than 400 m and over soils from Paleozoic with low fertility with transitions to quaternary sedimentary soils towards Camp of Tarragona and transitions to tertiary sedimentary soils towards Garrigues) and climate (Priorat‟s climate belongs to “south pre-littoral Mediterranean” with transitions to “dry continental Mediterranean” towards Garrigues and transitions to “south littoral Mediterranean” towards Camp of Tarragona). A mathematic model was fitted which makes possible to decide if an olive lot is able to produce virgin oil of enough quality to be classified as typical of Priorat. Fischers‟ discriminate functions were fitted that make possible to decide if a virgin oil sample has a fatty acid composition or a sensory profile characteristics from Priorat and different to other regions. Currently, these results are used to establish commercial strategies to sell Priorat virgin oils. The oil producers from this area select those more characteristics oils to be retailed (this increased from 20% at the beginning of the program to currently 65%) while the standard oils are used to self consumption or for bulk market.

Les nanoemulsions es consideren una excel·lent manera d’incorporar compostos lipòfils actius en aliments degut a les seves propietats específiques. L’objectiu d’aquesta tesi fou estudiar els factors que afecten les propietats fisicoquímiques i de funcionalitat de les nanoemulsions com a portadores d’antimicrobians (olis essencials) o compostos bioactius (β-carotè). D’una banda, el mètode de fabricació i els paràmetres de processat, així com la concentració dels seus components i el tipus d’oli essencial van afectar significativament la mida de partícula de les nanoemulsions. Així, es van obtenir nanoemulsions amb una mida de partícula inferior als 10 nm, les quals van presentar una major activitat antimicrobiana que les emulsions convencionals. D’altra banda, les nanoemulsions van presentar una major y més ràpida digestibilitat in vitro de l’oli que les emulsions convencionals, i per tant, una major bioaccessibilitat del β-carotè. La present investigació representa un important avenç per a l’ús de les nanoemulsions en aliments. / Las nanoemulsiones se consideran una excelente manera de incorporar ingredientes lipófilos activos en los alimentos debido a sus propiedades específicas. El objetivo de esta tesis fue estudiar los factores que afectan las propiedades físico-químicas y de funcionalidad de nanoemulsiones conteniendo antimicrobianos (aceites esenciales) o compuestos bioactivos (β- caroteno). Por un lado, el método de fabricación y los parámetros de procesado así como la concentración de los distintos componentes y el tipo de aceite esencial afectaron significativamente el tamaño de partícula de las nanoemulsiones. Así, se obtuvieron nanoemulsiones con un tamaño de partícula inferior a los 10 nm, presentando una mayor actividad antimicrobiana en comparación con las emulsiones convencionales. Por otro lado, las nanoemulsiones mostraron una mayor y más rápida digestibilidad in vitro del aceite que las emulsiones convencionales, y por tanto, una mayor bioacessibilidad del β-caroteno. La presente investigación supone un importante avance para el uso de nanoemulsiones en los alimentos. / Nanoemulsions are currently regarded as an excellent tool to incorporate active lipophilic ingredients in foods systems due to their properties. The aim of this thesis was to unravel the factors affecting the physicochemical characteristics and the functionality of nanoemulsions containing antimicrobials (essential oils) or bioactive compounds (β-carotene). On one hand, the fabrication method and the processing parameters as well as the concentration of the different components and the essential oil type significantly influenced the droplet size of nanoemulsions. In this sense, nanoemulsions with a droplet size below 10 nm were obtained, which presented an enhanced antimicrobial activity compared to conventional emulsions with larger droplet size. On the other hand, nanoemulsions exhibited a faster and greater oil digestibility than conventional emulsions under simulated digestion conditions and, in turn, a higher β-carotene bioaccessibility. The research carried out reveals important information for the use of nanoemulsions in foods.