L'objectiu principal d'aquesta Tesi va ser estudiar la qualitat estàndard, aromàtica, sensorial i la seguretat abiòtica de la poma 'Pink Lady®' durant tres campanyes (2003-2004, 2004-2005 i 2005-2006), tant durant la maduració en camp com després de la frigoconservació en diferents atmosferes de conservació, períodes d'emmagatzemament i de permanència a 20 ºC. Les atmosferes controlades amb nivells de oxigen i diòxid de carboni entre 1-3% van permetre una molt bona retenció de la fermesa de la polpa, del contingut de sòlid solubles, de l'acidesa i del color de fons de l'epidermis durant la frigoconservació. Els fruits conservats sota la tecnologia de fred normal varen presentar una caiguda significativa de l'acidesa i la fermesa, sobretot en emmagatzematges llargs (25-28 setmanes) i després de 7 dies a 20 ºC. Els ésters volàtils més importants tant durant la maduració en camp com durant la frigoconservació van ser l'acetat de butil, l'hexanoat de butil, l'acetat de 2-metilbutil, l'acetat d'hexil, el propanoat d'hexil, el butanoat d'hexil, l'hexanoat d'hexil i el 2-metilbutanoat d'hexil. La màxima producció de compostos volàtils aromàtics es va aconseguir després de 13-15 setmanes de frigoconservació independentment de les condicions d'atmosfera. No obstant, el fred normal va ser la tecnologia més recomanable per a obtenir major concentració total de compostos volàtils. La biosíntesi dels compostos volàtils aromàtics al llarg de la maduració en camp i durant la frigoconservació va estar condicionada fonamentalment per la disponibilitat dels precursors dels compostos volàtils, més que per l'activitat de l'alcohol o-aciltransferasa (AAT), l'enzim responsable de forma directa amb la producció d'ésters volàtils. En relació amb l'acceptació sensorial, l'atmosfera controla amb baix oxigen (2%) i molt baix oxigen (1%) van ser les tecnologies de conservació que han proporcionat pomes amb més acceptació sensorial després de la frigoconservació. Els fruits més apreciats pels consumidors no sempre van ser els que mostraven una producció de compostos volàtils aromàtics més elevada. Per tant, es suggereix que la concentració d'alguns compostos volàtils aromàtics va ser més important que l'emissió total a l'hora de determinar l'acceptació general del fruit. Així, els compostos volàtils aromàtics que van permetre diferenciar les pomes 'Pink Lady®' més acceptades van ser el propanoat d'hexil, el hexanoat d'hexil, el 2-metilbutanoat de butil i el 2- metilbutanoat d'hexil. Cal destacar l'elevada influència de l'hexanoat d'etil i el 2-metilpropanoat de propil sobre l'acceptació sensorial per part del consumidor durant la 3ª campanya. Tots ells contribueixen de forma predominant en l'aroma de la 'Pink Lady®' aportant un aroma característic a 'poma' i 'afruitat' amb notes a 'poma verda'. La fermesa, l'acidesa i el contingut en sòlids solubles també van influir positivament en l'acceptación per part dels consumidors. Respecte a la seguretat abiòtica dels fruits, els resultats indiquen que el contingut de difenilamina, folpet i imazalil es van retenir majorment a la pell. La concentració de difenilamina a la pell dels fruits conservats en fred normal va ser menor que a les mostres conservades en les atmosferes controlades. El contingut de folpet a la pell va disminuir de forma marcada després de 13-15 setmanes de conservació més 1 dia a 20 ºC en totes les atmosferes de conservació estudiades, amb una reducció del 80%. L'imazalil va ser més persistent que el folpet durant la conservació frigorífica. Després de 13 setmanes en atmosfera controlada amb baix contingut d'oxigen més 4 setmanes en fred normal es va reduir la concentració de difenilamina als fruits conservats amb les atmosferes controlades en baix oxigen (LO) i també de folpet en els els fruits procedents d'atmosfera controlada amb molt baix oxigen (ULO). Després de 27 setmanes sota atmosfera ULO més 4 setmanes en fred normal es va reduir la concentració d'imazalil a la pell als fruits. En tots els casos, Els nivells de residus en fruit fresc sencer procedents de tractaments postcollita van respectar els límits màxims fixats per la legislació. / El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la calidad estándar, aromática, sensorial y seguridad abiòtica de la manzana 'Pink Lady®' durante tres campañas (2003-2004, 2004-2005 y 2005-2006), tanto durante la maduración en campo como después de la frigoconservació en diferentes atmósferas de conservación, periodos de almacenamiento y días de permanencia a 20ºC. Las atmósferas controladas con niveles de oxígeno y dióxido de carbono entre 1-3% permitieron una muy buena retención de la firmeza de la pulpa, del contenido en sólidos solubles, de la acidez y del color de fondo de la epidermis durante toda la frigoconservación. Los frutos conservados bajo la tecnologia de frío normal presentaron una caída significativa de la acidez y la firmeza sobretodo en largos periodos de almacenamiento y 7 días a 20 ºC. Los ésteres volátiles más importantes tanto durante la maduración en campo como durante la frigoconservación fueron el acetato de butilo, el hexanoato de butilo, el acetato de 2-metilbutilo, el acetato de hexilo, el propanoato de hexilo, el butanoato de hexilo, el hexanoato de hexilo y el 2-metilbutanoato de hexilo. La máxima producción de compuestos volátiles aromáticos fue después de 13-15 semanas de frigoconservación independientemente de las condiciones de atmósfera. No obstante, el frío normal fue la tecnología más recomendable para obtener mayor concentración total de compuestos volátiles. La biosíntesis de compuestos volátiles aromáticos a lo largo de la maduración en campo y durante la frigoconservación estuvo condicionada fundamentalmente por la disponibilidad de los precursores de los compuestos volátiles, más que por la actividad del alcohol o-aciltransferasa (AAT), el enzima responsable de forma directa con la producción de ésteres volátiles. En relación con la aceptación sensorial, la atmósfera controlada con bajo oxígeno (2%) y muy bajo oxígeno (1%) fueron las tecnologías de conservación que han proporcionado manzanas con más aceptación sensorial después de la frigoconservación. Los frutos más apreciados por los consumidores no siempre mostraron una producción de compuestos volátiles aromáticos más elevada. Por tanto, se sugiere que la concentración de algunos compuestos volátiles aromáticos fue más importante que la emisión total a la hora de determinar la aceptación general del fruto. De esta manera, los compuestos volátiles aromáticos que permitieron diferenciar las manzanas 'Pink Lady®' más aceptadas fueron el propanoato de hexilo, el hexanoato de hexilo, el 2-metilbutanoato de butilo y el 2-metilbutanoato de hexilo. Cabe destacar la elevada influencia del hexanoato de etilo y el 2-metilpropanoato de propilo sobre la aceptación sensorial por parte del consumidor la 3ª campaña. Todos ellos contribuyeron de forma predominante en el aroma de la 'Pink Lady®' aportando un aroma característico a 'manzana' y 'afrutado' con notas a manzana 'verde'. La firmeza, la acidez y el contenido en sólidos solubles también influyeron positivamente en la aceptación por parte de los consumidores. Respecto a la seguridad abiótica de los frutos, los resultados indican que el contenido de difenilamina, folpet y imazalil se retuvo mayormente en la piel. La concentración de difenilamina en la piel de los frutos conservats en frío normal fue menor que las muestras conservadas en átmosfera controlada. El contenido de folpet en la piel disminuyó de forma marcada después de 13-15 semanas de conservación en todas las atmósferas de conservación estudiadas, con una reducción del 80%. El imazalil fue más persistente que el folpet durante la conservación frigorífica. Después de 13 semanas en atmósfera controlada con bajo contenido más 4 semanas en frío normal redujo la concentración de difenilamina en los frutos conservados en atmósfera controlada con bajo oxígeno (LO) y también de folpet en los frutos procedentes de atmósfera controlada con muy bajo contenido de oxígeno (ULO). Después de 27 semanas bajo atmósfera ULO más 4 semanas en frío normal se redujo la concentración de imazalil en la piel de los frutos. En todos los casos, los niveles de residuos en fruto fresco entero procedentes de tratamientos postcosecha respectaron los límites máximos fijados por la legislación. / The main objective of this thesis was to study the changes in the standard quality parameters, volatile compounds emitted, consumer acceptance and abiotic safety of 'Pink Lady®' apples picked at three consecutive seasons (2003-2004, 2004-2005 and 2005-2006) during on-tree maturation and after storage under different conditions, including atmosphere composition, storage period and ripening time at 20 ºC Controlled atmospheres with oxygen and carbon dioxide levels in the range 1-3% allowed very good retention of firmness, soluble solids content, titratable acidity and background colour during cold storage. Cold storage under air led to a drop in acidity levels after long-term storage (25-28 weeks) plus 7 days at 20 ºC. The most important volatile esters in quantitative terms emitted both during on-tree maturation and after cold storage were butyl acetate, butyl hexanoate, 2-methylbutyl acetate, hexyl acetate, hexyl propanoate, hexyl butanoate, hexyl hexanoate and hexyl 2-methylbutanoate. In addition, the maximum total concentration of aroma volatile compounds was found after 13-15 weeks of cold storage irrespective of atmosphere composition; nevertheless, storage under cold air was the most advisable technology to obtain the maximum production of total aroma compounds. The biosynthesis of aroma volatile compounds both during on-tree maturation and after cold storage was conditioned by the availability of the necessary precursors rather than by the activity of alcohol o-acyltransferase (AAT), the direct enzyme responsible for the production of volatile esters. In connection with consumer's acceptance, CA storage appeared as highly advisable in order to get the best sensory quality of 'Pink Lady®' apples after cold storage. The best accepted fruit did not always show the highest production of aroma volatile compounds, suggesting that the concentration of some specific volatile compounds is more important than total aroma volatile emission in determining overall fruit acceptability. Some specific aroma volatile compounds, namely hexyl propanoate, hexyl hexanoate, butyl 2-methylbutanoate, hexyl 2-methyllbutanoate, ethyl hexanoate and propyl 2-methylpropanoate (only during the last experimental season), accounted for the differentiation between well-accepted and only marginally accepted samples. These compounds contributed to the aroma profile of 'Pink Lady®' apples by conferring a characteristic aroma of 'apple' and 'fresh-green fruity'. Firmness, titratable acidity and soluble solids content were found to have a positive influence on acceptability. Regarding abiotic safety of 'Pink Lady®' apples following treatments with different agrochemicals, results indicate that diphenylamine, folpet and imazalil were retained mainly in the skin. Diphenylamine concentration in the skin of air-stored fruit was smaller than that of CAstored samples. Folpet concentration in the skin diminished after 13-15 weeks of cold storage plus 1 day at 20 ºC in all the atmosphere conditions studied, with a reduction of 80%. Imazalil was more persistent during storage than folpet. After 13 weeks in controlled atmosphere with low oxygen plus 4 weeks in normal air, diphenylamine and folpet contents in skin were reduced in low oxygen (LO) and ultra low oxygen (ULO) stored samples. Imazalil content in the skin of fruit was reduced after 27 weeks in ULO plus 4 weeks in normal air. In all cases, residue levels in the whole fresh fruit were lower than the maximum residue limits established by the Spanish legislation.

La producció i consum de fruites i verdures mínimament processades s'ha incrementat en el últims anys degut a la demanada, per part dels consumidors, d'aliments naturals, d'aparença i valor nutricional semblants als productes frescos, i que estiguin llestos per ser consumits. Dins d'aquest context, la utilització de polsos elèctrics d'alta intensitat de camp (PEAIC) permet contrarrestar els efectes negatius produïts pel processat tèrmic. Per una altra banda, les atmosferes modificades sorgeixen amb la finalitat d'allargar significativament la vida útil dels productes frescos tallats. Per tant, l'objectiu principal d'aquesta investigació fou establir les condicions de processat no tèrmic (polsos elèctrics d'alta intensitat de camp o tallat/envasat en atmosfera modificada) per obtenir sucs i fruits tallats (tomàquet i maduixa) amb alt potencial antioxidant.En el cas de sucs tractats mitjançant PEAIC, en primer lloc, es van determinar les condicions òptimes de tractament per PEAIC en funció de la freqüència, amplada de pols i polaritat per obtenir suc amb alt potencial antioxidant. Seguidament, es va portar a terme un estudi cinètic dels canvis en les propietats antioxidants dels sucs tractats per PEAIC a diferents intensitats de camp elèctric. Paral·lelament, es va realitzar un estudi comparatiu de l'evolució del contingut en compostos bioactius dels sucs pasteuritzats per PEAIC o per calor durant la vida útil. Tractaments portats a terme amb polsos bipolars de 1 µs a 250 Hz (tomàquet) i 232 Hz (maduixa) van donar lloc a màximes retencions de vitamina C (90%-98% retenció) i capacitat antioxidant (89%-100% retenció) en ambdós sucs, així com de licopé (132% retenció) en el suc de tomàquet i antocianines (102% retenció) en el suc de maduixa. Es van obtenir models matemàtics secundaris que van relacionar la variació del potencial antioxidant en sucs de tomàquet i maduixa amb la intensitat de camp i temps de tractament (R2 = 0,874-0,976). La pasteurització per PEAIC de suc de tomàquet (35 kV/cm 1500 s; amb polsos bipolars de 4 s a 100 Hz) no només va augmentar el contingut en licopé, β-caroté y fitoflué dels sucs en relació al suc fresc, sinó que també va comportar menors pèrdues de vitamina C que el tractament per calor. Els sucs de tomàquet pasteuritzats per PEAIC van mantenir majors quantitats de carotens (licopé, neurosporé i γ-caroté), quercitina, vitamina A y C durant l'emmagatzematge que els tractats tèrmicament. Per un altra banda, la pasteurització mitjançant PEAIC (35 kV/cm 1700 s; amb polsos bipolars de 4 s a 100 Hz) va afectar en menor proporció que el tractament tèrmic als compostos bioactius (vitamina C, àcid elàgic i antocianines) presents al suc de maduixa. De la mateixa manera, els sucs de maduixa pasteuritzats per PEAIC van mostrar majors nivells d'antocianines, àcid elàgic i àcid p-cumàric que els processats tèrmicament durant l'emmagatzematge.Pel que respecta als fruits tallats, en primer lloc, es va determinar la influencia de la varietat en les propietats antioxidants de tomàquets frescos tallats durant l'emmagatzematge. Seguidament, es va portar a terme l'estudi de l'efecte de diferents temperatures de conservació, així com d'atmosferes d'envasat en el potencial antioxidant de tomàquet i maduixa frescos tallats. La varietat va determinar significativament el contingut en compostos bioactius dels tomàquets. L'emmagatzematge a 5 ºC de tomàquet i maduixa frescos tallats va contribuir al manteniment del potencial antioxidant d'aquests productes. En maduixa fresca tallada, els canvis en el contingut en vitamina C i antocianines, així com la variació de la capacitat antioxidant durant el temps de conservació a diferents temperatures es va predir adequadament mitjançant el model de Weibull (R2 = 0,80-0,99). Les constants cinètiques obtingudes mitjançant aquest model es van relacionar adequadament amb la temperatura de conservació mitjançant la equació de Arrhenius (Ea = 33,3-119,7 kJ/mol). L'aplicació d'atmosferes pobres d'oxigen va ser més adient per prevenir la pèrdua dels principals compostos bioactius presents als tomàquets i maduixes frecs tallats que les atmosferes amb alta concentració d'oxigen. Per tant, es pot concloure que els polsos elèctrics d'alta intensitat de camp i el tallat/envasat en atmosfera modificada poden ser bones alternatives als tractaments tradicionals; ja que amb aquestes tècniques es poden obtenir sucs i fruits tallats amb alt potencial antioxidant durant més temps. / La producción y consumo de frutas y verduras mínimamente procesadas se ha incrementado en los últimos años debido a la demanda, por parte del consumidor, de alimentos naturales, de apariencia y valor nutricional semejante a los productos frescos, y listos para su consumo. Dentro de este contexto, el empleo de pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC) permite contrarrestar los efectos negativos producidos por el procesado térmico. Por otra parte, las atmósferas modificadas surgen con la finalidad de alargar significativamente la vida útil de los productos frescos cortados. Por tanto, el objetivo principal de esta investigación fue establecer las condiciones de procesado no térmico (pulsos eléctricos de alta intensidad de campo o cortado/envasado en atmósfera modificada) para obtener zumos y frutos cortados (tomate y fresa) con alto potencial antioxidante.En el caso de zumos tratados mediante PEAIC, en primer lugar, se determinaron las condiciones óptimas de tratamiento por PEAIC en función de la frecuencia, anchura de pulso y polaridad para obtener zumos con alto potencial antioxidante. Seguidamente, se llevó a cabo un estudio cinético de los cambios en las propiedades antioxidantes de los zumos tratados por PEAIC a distintas intensidades de campo eléctrico. Paralelamente, se realizó un estudio comparativo de la evolución del contenido en compuestos bioactivos de los zumos pasteurización por PEAIC o por calor a lo largo de la vida útil. Tratamientos llevados a cabo con pulsos bipolares de 1 µs a 250 Hz (tomate) y 232 Hz (fresa) dieron lugar a máximas retenciones de vitamina C (90%-98% retención) y capacidad antioxidante (89%-100% retención) en ambos zumos, así como licopeno (132% retención) en zumo de tomate y antocianinas (102% retención) en zumo de fresa. Se obtuvieron modelos matemáticos secundarios que relacionaron la variación del potencial antioxidante en zumos de tomate y fresa con la intensidad de campo y tiempo de tratamiento (R2 = 0,874-0,976). La pasteurización por PEAIC de zumo de tomate (35 kV/cm 1500 s; con pulsos bipolares de 4 s a 100 Hz) no solo aumentó el contenido en licopeno, β-caroteno y fitoflueno de los zumos comparado con el zumo fresco, sino que también conllevó menores perdidas de vitamina C que el tratamiento por calor. Los zumos de tomate pasteurizados por PEAIC mantuvieron mayores cantidades de carotenos (licopeno, neurosporeno y γ-carotenos), quercitina, vitamina A y C durante el almacenamiento que los tratados térmicamente. Por otra parte, la pasteurización mediante PEAIC (35 kV/cm 1700 s; con pulsos bipolares de 4 s a 100 Hz) afectó en menor proporción a los compuestos bioactivos (vitamina C, ácido elágico y antocianinas) presentes en el zumo de fresa que el tratamiento térmico. Del mismo modo, los zumos de fresa pasteurizados por PEAIC mostraron mayores niveles de antocianinas, ácido elágico y ácido p-cumárico que los procesados térmicamente durante el almacenamiento. Por lo que respecta a frutos cortados, en primer lugar, se determinó la influencia de la variedad en las propiedades antioxidantes de tomates frescos cortados durante el almacenamiento. Seguidamente, se llevo a cabo el estudio del efecto de distintas temperaturas de conservación, así como de atmósferas de envasado en el potencial antioxidante de tomate y fresa frescos cortados. La variedad determinó significativamente el contenido en compuestos bioactivos de los tomates. El almacenamiento a 5 ºC de tomate y fresa frescos cortados contribuyó al mantenimiento del potencial antioxidante de estos productos. En fresa fresca cortada, los cambios en el contenido en vitamina C y antocianinas, así como la variación de la capacidad antioxidante a lo largo del tiempo de almacenamiento a distintas temperaturas se predijo bien mediante el modelo de Weibull (R2 = 0,80-0,99). Las constantes cinéticas obtenidas mediante este modelo se relacionaron adecuadamente con la temperatura de conservación a través de la ecuación de Arrhenius (Ea = 33,3-119,7 kJ/mol). La aplicación de atmósferas pobres en oxígeno fue más adecuada para prevenir la pérdida de los principales compuestos bioactivos presentes en tomate y fresa frescos cortados que las atmósferas con alta concentración de oxígeno. Por tanto, se puede concluir que los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo y el cortado/envasado en atmósfera modificada pueden ser buenas alternativas a los tratamientos tradicionales; ya que con estas técnicas se pueden obtener zumos y frutos cortados con alto potencial antioxidante durante un mayor tiempo. / The increase in popularity of minimally processed fruits and vegetables meets consumer's demands for healthy, nutritious and ready-to-eat food products, with a fresh-like appearance. In this way, the application of high intensity pulsed electric fields (HIPEF) is being investigated to avoid the negative effects of heat pasteurization. On the other hand, modified atmosphere packaging appears to extend the shelf-life of fresh-cut products. Therefore, the main objective of this work was to establish the non-thermal conditions (high intensity pulsed electric fields or cutting/packaging under modified atmosphere) in order to obtain juices and fresh-cut fruits (tomato and strawberry) with high antioxidant potential.In the case of juices treated by HIPEF, firstly, the HIPEF optimal conditions in terms of pulse frequency, pulse width and polarity mode were determined in order to obtain juices with high antioxidant potential. Then, a kinetic study was carried out to relate the changes in the juices antioxidant properties to electric field strength. Parallely, a comparative study on the content of bioactive compounds in juices pasteurized by HIPEF or heat treatment through the shelf-life was conducted. Maximal vitamin C (90-98% retention) and antioxidant capacity (89%-100% retention) in both juices, as well as, lycopene (132% retention) in tomato juice and anthocyanins (102% retention) in strawberry juice were attained with HIPEF treatments carried out with bipolar pulses of 1-µs at 250 Hz (tomato) and 232 Hz (strawberry). Secondary mathematical models were obtained to relate the variation of the antioxidant potential in tomato and strawberry juices with the electric field strength and treatment time applied (R2 = 0.874-0.976). HIPEF pasteurization (35 kV/cm 1500 s; with bipolar pulses of 4 s at 100 Hz) led to tomato juices not only with higher content of lycopene, β-carotene and phytofluene than fresh juices, but also with lower losses in vitamin C concentration than those thermally treated. HIPEF-treated tomato juices maintained greater carotene concentrations (lycopene, neurosporene and γ-carotene), quercetin, vitamin A and C throughout cold storage than heat-treated juices. On the other hand, HIPEF processing (35 kV/cm 1700 s; with bipolar pulses of 4 s at 100 Hz) had lower influence on the content of health-related compounds (vitamin C, ellagic acid and anthocyanins) of strawberry juice than thermal pasteurization. In this way, strawberry juices pasteurized by HIPEF exhibited greater levels of anthocyanins, ellagic acid and p-coumaric acid compared to those treated by heat. Regarding fresh-cut products, firstly, the influence of tomato cultivar in the evolution of its health-related compounds through the storage time was evaluated. Then, the effect of different storage temperatures and initial packaging atmospheres on the antioxidant potential of fresh-cut tomato and strawberry was determined. Health-related compounds varied greatly among tomato cultivar. A storage temperature of 5 ºC was adequate for maintaining health-related compounds of tomato and strawberry juice through the storage. The model based on Weibull distribution function was adequate (R2 = 0.800-0.99) for describing changes over time in the content of vitamin C, anthocynins as well as antioxidant capacity of fresh-cut strawberries stored at different temperatures. Dependence of the rate constant of the Weibull model were adequately related to storage temperature throughout the Arrhenius relationship (Ea = 33.3-119.7 kJ/mol). Low oxygen atmospheres are more effective than superatmospheric oxygen atmospheres or air in maintaining the main health-related compounds of fresh-cut tomato and strawberry.Therefore, it can be concluded that high intensity pulsed electric fields and cutting/packaging can be an alternative to traditional treatments to obtain juices and fresh-cut fruits with high antioxidant potential for longer periods.

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La limitació en l’ús de fungicides per al control de malalties en postcollita de fruita és una problemàtica d’elevada magnitud en el sector fructícola actual. Degut a això l’ús d’estratègies alternatives com el control biològic microbià són fonamentals per a la producció de fruita de qualitat. Malgrat tot, el desenvolupament de programes de biocontrol eficaços requereix d’un coneixement profund de la capacitat de control i els mecanismes d’acció utilitzats per l’agent microbià que es pretén emprar, així com de la possibilitat per a què aquest pugui ésser produït i formulat a nivell comercial. En aquest context, la bactèria Bacillus subtilis soca CPA–8 aïllada de la superfície de nectarines al Laboratori de Patologia de Postcollita del Centre IRTA (Lleida) ha demostrat tenir una bona capacitat de biocontrol de malalties de postcollita de fruita de pinyol. El seu futur ús a nivell comercial depèn de l’estudi del seu potencial de biocontrol de malalties de postcollita de fruita; així com del desenvolupament de processos per a l’optimització de la producció i formulació. La present tesi tenia com a objectiu principal avaluar aspectes clau per al desenvolupament de B. subtilis CPA–8 com agent efectiu per al control biològic de malalties de postcollita de fruita. Per a complir amb aquest objectiu, en primer lloc, es va dur a terme una anàlisi detallada de les característiques biològiques de la soca CPA–8 com ara el seu creixement en medi de cultiu, producció d’endòspores i substàncies antifúngiques; així com el seu potencial per al control de malalties importants en postcollita de taronja, poma i fruita de pinyol (Capítol 1). Amb aquests resultats, el següent pas fou estudiar el mode d’acció utilitzat per B. subtilis CPA–8 per a la supressió de patògens de postcollita, concretament contra Monilinia spp. causant de la podridura marró en fruita de pinyol (Capítol 2). Mitjançant la combinació d’eines d‘anàlisi químic, moleculars i biològiques es van determinar els principals factors implicats en la capacitat antagònica de la soca CPA–8 contra Monilinia spp. El pas següent fou optimitzar la producció de B. subtilis CPA–8, en aquest sentit es va desenvolupar un medi de cultiu de baix cost que proporcionés un creixement alt i mantingués l’eficàcia de biocontrol (Capítol 3). Primer es van buscar fonts de nitrogen i de carboni econòmiques entre productes comercials i subproductes agroalimentaris. Posteriorment es va dur a terme l’escalat de la producció de la bactèria en un bioreactor de 5 L i es va comprovar l’efectivitat per al control de Monilinia spp. en préssecs. El pas final fou la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant l’assecat per atomització (Capítols 4 i 5). Aquest mètode fou seleccionat per dos motius, d’una banda perquè aquesta és una tècnica d’assecat viable per a formulació de bactèries a baix cost i per l’altra banda en base als resultats obtinguts en el capítol 1 sobre la capacitat de la bactèria per produir endòspores resistents al calor i efectives contra patògens de postcollita de fruita. Primer es va dur a terme un estudi comparatiu de l’efecte de l’atomització sobre la supervivència de B. subtilis CPA–8 i de l’agent de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítol 4). Posteriorment es va realitzar una avaluació de les substàncies protectores/material de suport més adequades per a l’atomització de la soca CPA–8, i amb els millors productes atomitzats es van avaluar diferents medis de rehidratació i l’activitat antifúngica; així com la vida útil y l’efectivitat durant l’emmagatzemament (Capítol 5) Els resultats obtinguts en el capítol 1 demostraren que B. subtilis CPA–8 produeix cèl lules, endòspores resistents al calor i compostos que tenen una alta activitat antagònica in vitro contra els principals patògens de postcollita de fruita Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum i Penicillium expansum. Els tractaments de cèl lules, endòspores y sobrenedants lliures de cèl lules de la soca CPA–8 mostraren diferents nivells d’efectivitat per al control de podridures en taronja, poma i fruita de pinyol, presentant els millors resultats contra Monilinia spp. en préssecs i nectarines amb reduccions de la incidència de la malaltia fins al 100 %. L’assaig de dosis de diferents tractaments de la soca CPA–8 a 108, 107 i 106 UFC mL–1 foren efectius contra Monilinia spp. de forma semblant o millor al Serenade Max®. L’estudi del mode d’acció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 2) va demostrar que els sobrenedants lliures de cèl lules provinents de cultius líquids tenen una alta activitat antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a l’observada amb suspensions cel lulars. Les anàlisis mitjançant PCR i bioautografia en TLC d’extractes butanòlics d’aquests sobrenedants en comparació amb els de les soques de referència de B. subtilis UMAF6614 i UMAF6639, van revelar la producció de les principals famílies de lipopèptids antifúngics coneguts en Bacillus (fengicines, iturines i surfactines), fet que apuntava l’antibiosi com a principal mecanisme d’acció implicat en la capacitat de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Les fraccions corresponents a les fengicines foren les responsables de l’activitat inhibitòria de la soca CPA–8 enfront de Monilinia spp. Aquests resultats van ser corroborats definitivament mitjançant la construcció de mutants de B. subtilis CPA–8 defectius per a la producció de fengicina interrompent l’expressió del gen fenB. Les anàlisis per PCR i bioautografia en TLC revelaren que els mutants defectius de la soca CPA–8 perdien la capacitat d’inhibir a Monilinia spp. per la seva incapacitat per a produir fengicines. Els assaigs d’efectivitat en fruita utilitzant tractaments provinents dels mutants de la soca CPA–8 van demostrar que aquests havien perdut la capacitat de controlar la podridura causada per Monilinia spp. amb percentatges d’incidència similars als observats en el control sense tractar, mentre que els tractaments amb la soca parental o Serenade Max® presentaven reduccions de la malaltia de fins el 100 %. Tots aquests resultats demostraren que la producció de fengicines juga un paper molt important en l’efectivitat de B. subtilis CPA–8 per a controlar la podridura marró del préssec; i que aquest resulta ser el principal mode d’acció implicat en la seva capacitat de biocontrol. En l’optimització de la producció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 3) els resultats obtinguts van demostrar que és possible aconseguir alts nivells de biomassa (superiors a 3×109 UFC mL–1) emprant dos medis de baix cost composats per farina de soja desengreixada 44 % a 40 g L–1 com a font de nitrogen en combinació amb sacarosa a 20 g L–1 o melassa a 5 g L–1 com a fonts de carboni. A més a més, la producció de la soca CPA–8 en aquest medi de baix cost va poder ser escalada a nivell de laboratori en un bioreactor de 5 L de capacitat a 30 °C, amb agitació de 200 rpm i flux d’aire de 100 L h–1, mantenint les concentracions de la bactèria a 3×109 UFC mL–1. Els assaigs en fruita amb tractaments de la soca CPA–8 crescuda en el medi optimitzat de baix cost van demostrar que aquesta mantenia la seva eficàcia de biocontrol contra M. fructicola en préssecs amb reduccions de la malaltia de fins al 95 %, similar als tractaments de la bactèria crescuts en medis de laboratori. Les poblacions de CPA–8 van sobreviure en ferides de préssecs inoculats, independentment dels medis de cultiu utilitzats. Aquests resultats proporcionen una base fiable per a la producció de la soca CPA–8 a nivell industrial. En la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant assecat per atomització (Capítols 4 i 5) els resultats demostraren que aquesta bactèria és capaç de sobreviure a les altes temperatures del procés (32.3 % de viabilitat i 3.3×109 UFC g–1 de concentració final de producte), comparada amb P. agglomerans CPA–2 utilitzada com a model de bactèria sensible a la calor i no formadora d’endòspores que no fou resistent (menys del 2 % de viabilitat). La supervivència de la soca CPA–8 a l’atomització va estar directament relacionada amb la seva capacitat per a produir endòspores resistents a les altes temperatures. La resistència a la calor de la soca CPA–8 a més a més va dependre de la fase de creixement, essent el cultiu de 72 h, més resistent que el de 24 h, probablement pel seu major contingut d’endòspores. Els resultats obtinguts en l’estudi de la substància protectora/material de suport més adequada per a l’atomització de B. subtilis CPA–8 van demostrar que quatre diferents combinacions de llet desnatada en pols i MgSO4 proveïen una bona recuperació de pols (28–38 %) i continguts d’humitat del 7–13 %. La supervivència de la soca CPA–8 fou diferent en els atomitzats dels cultius de 24 i 72 h. Les formulacions de 72 h mostraven una major supervivència (28–32 %) y amb concentracions finals al voltant d’1.6–3.3×109 UFC g–1, mentre que la viabilitat dels atomitzats de 24 h fou inferior a l’1 %, fet pel qual les primeres van seleccionar–se per a la seva posterior avaluació. Diferents rehidratants como l’aigua o el tampó fosfat van proporcionar una bona recuperació de cèl lules viables en les formulacions de CPA–8 similars a les obtingudes amb llet desnatada en pols o sacarosa al 10 % amb el que es dedueix que l’aigua pot utilizar–se com a rehidratant amb l’avantatge a nivell pràctic que això suposa. L’estudi de la vida útil de les formulacions de la soca CPA–8 emmagatzemades a 4 °C (fred) i a 20 °C (temperatura ambient) va demostrar que la viabilitat es mantenia o disminuïa lleugerament (0.2–0.3 log) durant 6 mesos d’emmagatzematge. A més a més, després de 4 i 6 mesos de conservació aquestes formulacions controlaven la podridura marró causada per Monilinia spp. en nectarines i préssecs mostrant reduccions de la incidència de la malaltia entre el 90 i 100 %. Els resultats obtinguts van demostrar que l’atomització podria ser un mètode d’assecat adequat per a obtenir formulacions estables i efectives de B. subtilis CPA–8.En conclusió els estudis realitzats en aquesta tesi demostren el potencial de l’antagonista B. subtilis CPA–8 per al control de malalties de postcollita de fruita i estableixen les bases per a la seva posterior implementació de la producció i formulació a nivell comercial. / La limitación en el uso de fungicidas para el control de enfermedades en postcosecha de fruta es un grave problema en el sector frutícola actual. Debido a esto, el uso de estrategias alternativas como el control biológico microbiano son fundamentales para la producción de fruta de calidad. Sin embargo, el desarrollo de programas de biocontrol eficaces requiere de un fuerte conocimiento de la capacidad de control y los mecanismos de acción usados por el agente microbiano que se pretende emplear, así como de la posibilidad para que éste pueda ser producido y formulado a nivel comercial. En este contexto, la bacteria Bacillus subtilis cepa CPA–8 aislada de la superficie de nectarinas en el Laboratorio de Patología de Postcosecha del Centro IRTA (Lleida) ha demostrado tener una importante capacidad de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta de hueso. Su futuro uso a nivel comercial depende del estudio de su potencial de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta; así como del desarrollo de procesos para su óptima producción y formulación. La presente tesis tiene como objetivo fundamental evaluar aspectos clave para el desarrollo de B. subtilis CPA–8 como agente eficaz de control biológico de enfermedades de postcosecha de fruta. Para cumplir con este objetivo, en primer lugar, se realizó un análisis detallado de las características biológicas de la cepa CPA–8 como su crecimiento en medio de cultivo, producción de endosporas y sustancias antifúngicas; así como su potencial para el control de importantes podredumbres de postcosecha de naranja, manzana y fruta de hueso (Capítulo 1). Con estos resultados el siguiente paso fue estudiar el modo de acción usado por B. subtilis CPA–8 para la supresión de patógenos de postcosecha, concretamente contra Monilinia spp. causante de la podredumbre marrón en fruta de hueso (Capítulo 2). Mediante la combinación de herramientas de análisis químico, molecular y biológico se determinaron los principales factores implicados en la capacidad antagónica de la cepa CPA–8 contra Monilinia spp. El siguiente paso fue optimizar la producción de B. subtilis CPA–8, para lo cual se desarrolló un medio de cultivo de bajo coste que proporcionase un crecimiento alto y mantuviese la eficacia de biocontrol (Capítulo 3). Primero se buscaron fuentes de nitrógeno y carbono económicas entre productos comerciales y subproductos agroalimentarios. Posteriormente se realizó el escalado de producción de la bacteria en un bioreactor de 5 L y se comprobó la efectividad para el control de Monilinia spp. en melocotones. El paso final fue la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5). Este método fue seleccionado por dos motivos, por un lado porque ésta es una técnica de secado viable para formulación de bacterias a bajo coste y en base a los resultados obtenidos en el capítulo 1 sobre la capacidad de la bacteria para producir endosporas resistentes al calor y eficaces contra patógenos de postcosecha de fruta. Primero se realizó un estudio comparativo del efecto de la atomización sobre la supervivencia de B. subtilis CPA–8 y del agente de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítulo 4). Posteriormente se realizó una evaluación de las sustancias protectoras/material de soporte más adecuadas para la atomización de la cepa CPA–8, y de los mejores productos atomizados se evaluaron los distintos medios de rehidratación y la actividad antifúngica; así como su vida útil y efectividad durante conservación (Capítulo 5).Los resultados obtenidos en el capítulo 1 indicaron que B. subtilis CPA–8 produce células, endosporas resistentes al calor y compuestos que tienen una alta actividad antagónica in vitro contra los principales patógenos de postcosecha de fruta Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum y Penicillium expansum. Los tratamientos de células, endosporas y sobrenadantes libres de células de la cepa CPA–8 mostraron diferentes niveles de efectividad para el control de podredumbres en naranja, manzana y fruta de hueso, presentando los mejores resultados contra Monilinia spp. en fruta de hueso con reducciones de la incidencia de la enfermedad hasta del 100 %. El ensayo de dosis de diferentes tratamientos de la cepa CPA–8 a 108, 107 y 106 UFC mL–1 fueron efectivos contra Monilinia spp., de forma similar o mejor que Serenade Max®. El estudio del modo de acción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 2) demostró que los sobrenadantes libres de células provenientes de cultivos líquidos tenían una alta actividad antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a la observada con suspensiones celulares. Los análisis mediante PCR y bioautografía en TLC de extractos butanólicos de estos sobrenadantes en comparación con los de las cepas de referencia de B. subtilis UMAF6614 y UMAF6639, revelaron la producción de las principales familias de lipopéptidos antifúngicos conocidos en Bacillus (fengicinas, iturinas y surfactinas), lo que apuntó a la antibiosis como el principal mecanismo de acción implicado en la capacidad de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Las fracciones correspondientes a las fengicinas fueron las responsables de la actividad inhibitoria de la cepa CPA–8 frente a Monilinia spp. Estos resultados fueron definitivamente corroborados mediante la construcción de mutantes de B. subtilis CPA–8 defectivos para la producción de fengicina interrumpiendo la expresión del gen fenB. Los análisis por PCR y bioautografía en TLC revelaron que los mutantes defectivos de la cepa CPA–8 perdieron la capacidad de inhibir a Monilinia spp. por su incapacidad para producir fengicinas. Los ensayos de efectividad en fruta utilizando tratamientos provenientes de los mutantes de la cepa CPA–8 demostraron que éstos habían perdido su capacidad para controlar la podredumbre causada por Monilinia spp. con porcentajes de incidencia similares a los observados en el control sin tratar, mientras que los tratamientos con la cepa parental o Serenade Max® presentaron reducciones de enfermedad de hasta el 100 %. Todos estos resultados demostraron que la producción de fengicinas juega un papel muy importante en la efectividad de B. subtilis CPA–8 para controlar la podredumbre marrón del melocotón; y que éste resulta ser el principal mecanismo de acción implicado en su capacidad de biocontrol. En la optimización de la producción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 3) los resultados obtenidos demostraron que se pueden conseguir altos niveles de biomasa (superiores a 3×109 UFC mL–1) usando dos medios de bajo coste compuestos por harina de soja desengrasada 44 % a 40 g L–1 como fuente de nitrógeno en combinación con sacarosa a 20 g L–1 o melaza a 5 g L–1 como fuentes de carbono. Además la producción de la cepa CPA–8 en este medio de bajo coste pudo ser escalada a nivel de laboratorio en un bioreactor de 5 L de capacidad a 30 °C, con agitación de 200 rpm y flujo de aire de 100 L h–1, manteniendo las concentraciones de la bacteria a 3×109 UFC mL–1. Los ensayos en fruta con tratamientos de la cepa CPA–8 crecida en el medio optimizado de bajo coste demostraron que ésta mantenía su eficacia de biocontrol contra M. fructicola en melocotones con reducciones de enfermedad de hasta el 95 %, similar a los tratamientos de la bacteria crecidos en medios de laboratorio. Las poblaciones de CPA–8 sobrevivieron en heridas de melocotones inoculados, independientemente de los medios de cultivo utilizados. Estos resultados proporcionan una base fiable para la producción de la cepa CPA–8 a nivel industrial. En la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5) los resultados demostraron que esta bacteria es capaz de sobrevivir a las altas temperaturas del proceso (32.3 % de viabilidad y 3.3×109 UFC g–1 de concentración final de producto), comparado con P. agglomerans CPA–2 utilizada como modelo de bacteria sensible al calor y no formadora de endosporas que no fue resistente (menos del 2 % de viabilidad). La supervivencia de la cepa CPA–8 a la atomización estuvo directamente relacionada con su capacidad para producir endosporas resistentes a las altas temperaturas. La resistencia al calor de la cepa CPA–8 además dependió de la fase de crecimiento, siendo el cultivo de 72 h, más resistente que el de 24 h, probablemente por su mayor contenido de endosporas. Los resultados obtenidos en el estudio de la sustancia protectora/material de soporte más adecuada para la atomización de B. subtilis CPA–8 demostraron que cuatro diferentes combinaciones de leche desnatada en polvo y MgSO4 proveían una buena recuperación de polvo (28–38 %) y contenidos de humedad del 7–13 %. La supervivencia de la cepa CPA–8 varió considerablemente en los atomizados con los cultivos de 24 h y los de 72 h. Las formulaciones de 72 h mostraron una mayor supervivencia (28–32 %) y con concentraciones finales entorno a 1.6–3.3×109 UFC g–1, mientras que la viabilidad de los atomizados de 24 h fue inferior al 1 %, por lo cual se seleccionaron para su posterior evaluación. Diferentes rehidratantes como el agua o tampón fosfato proporcionaron una buena recuperación de células viables en las formulaciones de CPA–8 similares a las obtenidas en leche desnatada en polvo o sacarosa al 10 % por lo que el agua puede utilizarse como rehidratante con la ventaja a nivel práctico que supone. El estudio de la vida útil de las formulaciones de la cepa CPA–8 almacenadas a 4 °C (frío) y a 20 °C (temperatura ambiente) demostró que la viabilidad se mantuvo o disminuyó ligeramente entorno a 0.2–0.3 log durante 6 meses de almacenamiento. Además después de 4 y 6 meses de almacenamiento estas formulaciones controlaron la podredumbre marrón causada por Monilinia spp. en nectarinas y melocotones mostrando reducciones de la incidencia de la enfermedad entre el 90 y 100 %. Los resultados obtenidos demostraron que la atomización podría ser un método de secado adecuado para obtener formulaciones estables y eficaces de B. subtilis CPA–8. En conclusión los estudios realizados en esta tesis demuestran el potencial del agente de biocontrol B. subtilis CPA–8 para el control de enfermedades de postcosecha de fruta y sientan las bases para su posterior implementación de la producción y formulación a nivel comercial / Synthetic fungicides are the primary means to reduce losses caused by postharvest diseases. However, public concern for their negative impact on human health and environment associated with undesirable chemical residues on fruit and proliferation of fungicide–resistant isolates have impelled the search for alternative methods. Biological control using microorganisms has emerged as an effective alternative to control postharvest diseases and to produce quality fruit free of fungicide residues. However, the development of a successful biocontrol product requires a strong knowledge about the antagonistic ability and mechanisms of action used by the microbial agent to disease suppression and the possibility for its production and formulation to commercial application. In this context, Bacillus subtilis strain CPA–8 isolated from nectarines surface in the Postharvest Pathology Laboratory from IRTA centre (Lleida) has shown a significant capacity for biocontrol of postharvest diseases of stone fruit. Its future use on a commercial level depends on its antagonistic potential to control fruit postharvest diseases as well as an optimum production and formulation systems. This thesis has the main objective to evaluate key aspects involved in development of B. subtilis CPA–8 as an effective biocontrol agent of postharvest diseases on fruit. To achieve this objective, first, the CPA–8 growth and production of endospores and antifungal substances were characterized. Then, biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 was tested against the main postharvest decay on oranges, apples and stone fruit (Chapter 1). Based on these results, the mechanism of action used by CPA–8 to suppress postharvest pathogens, particularly against Monilinia spp. causing brown rot in stone fruit was studied (Chapter 2). Based on chemical, molecular and biological analysis the key factors involved in the biocontrol activity of CPA–8 against Monilinia spp. were identified. Next step was optimizing B. subtilis CPA–8 production by developing a low cost medium that provide maximum bacterium growth and maintain its biocontrol efficacy (Chapter 3). First, different media combining economical nitrogen and carbon sources from commercial products and by–products were evaluated. Second, CPA–8 production was scaled up in a 5–liter bioreactor and the efficacy to control of Monilinia spp. in peaches was evaluated. The final step was B. subtilis CPA–8 formulation by spray drying (Chapters 4 and 5). This method was selected because it is a cost effective technique for bacteria preservation and results of Chapter 1 indicated that CPA–8 was heat resistant by endospores production capacity. These endospores had also demonstrated good antifungal activity against fruit postharvest pathogens. First, the role of endospore production by B. subtilis CPA–8 on its survival to spray–drying process was investigated by comparing CPA–8 with the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA–2 as model of heat–sensitive and non–spore forming bacterium (Chapter 4). Finally, carriers/protectants were evaluated to prepare CPA–8 formulations by spray drying; and with the best CPA–8 formulations rehydration media, shelf life stability and biocontrol efficacy during storage were evaluated (Chapter 5). The results obtained in Chapter 1 indicated that CPA–8 produces cells, heat–resistant endospores and compounds with high antifungal activity in vitro against the major fruit postharvest pathogens Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum and Penicillium expansum. Treatment of cells, endospores and cell–free supernatants of CPA–8 showed different efficacy levels to control fugal decay on oranges, apples and stone fruit, obtaining the best results against Monilinia spp. on stone fruit with disease reductions up to 100%. Dose tests demonstrated that different CPA–8 treatments at 108, 107 and 106 CFU mL–1 were effective against Monilinia spp., similar or better than Serenade Max®, a commercial biocontrol product based in a B. subtilis strain. Experimental evidence suggested that B. subtilis CPA–8 has biocontrol potential to control postharvest diseases on several fruit types, particularly against peach brown rot. The mode of action study (Chapter 2) showed that cell free supernatants and butanolic extracts from liquid cultures of B. subtilis CPA–8 had a strong antifungal activity in vitro against Monilinia spp. similar to that observed with cell suspensions. Fengycin, iturin and surfactin lipopeptides were identified by TLC in butanolic extracts from cell free supernatants of CPA–a by comparison with the B. subtilis reference strains UMAF6614 and UMAF6639, indicating that antibiosis could be the major factor involved in the CPA–8 biological control ability. TLC–bioautography analysis showed that CPA–8 antifungal activity was associated only with fengycin lipopeptide. These results were definitively supported by mutagenesis analysis targeted to suppress fengycin biosynthesis by disruption of the fenB gene. PCR and TLC–bioautography analysis allowed to identify CPA–8 transformants with reduced or suppressed antifungal activity and to select the defective phenotype associated with the lack of fengycin bands. Fruit trials confirmed that fengycin–defective mutants lost their ability to control peach brown rot disease in comparison with CPA–8 wild type strain or Serenade Max®. Taken together our data indicate that fengycin–like lipopeptides play a major role in the biological control potential of B. subtilis CPA–8 against peach brown rot. The results obtained in Chapter 3 indicate that high production levels of B. subtilis CPA–8 (>3×109 CFU mL–1) could be achieved in a low cost medium based on defatted soy flour 44 % (40 g L–1) with sucrose (20 g L–1) or molasses (5 g L–1). CPA–8 production in the optimized low cost medium was scaled–up in a 5–L bioreactor at 30 °C under shaking at 200 rpm and with air flow of 100 L h–1 and production was maintained around 3×109 CFU mL–1. Fruit trials with cells and cell free supernatants obtained from CPA–8 grown in optimized medium maintained biocontrol efficacy against M. fructicola in peaches showing disease reduction up to 95 %, similar to the treatment from bacterium grown in expensive laboratory media. CPA–8 populations survived in wounds on inoculated peaches, regardless of the culture media used. The results could be used to provide a reliable basis for the fermentation scaling–up process to an industrial level. The results obtained in Chapters 4 and 5 indicate that B. subtilis CPA–8 is heat resistant to high temperatures involved in spray–drying process by endospore production comparing with the heat sensitive and non–spore forming P. agglomerans CPA–2. The 72–h–old CPA–8 cultures spray–dried showed the best survival with 32.3 % viable cells recovery and a final concentration product of 3.3×109 CFU g–1, while CPA–2 viability was lower than 2 %. Heat resistance of CPA–8 was also depending on growth time, being 72–h–old culture more resistant than 24–h–old culture, probably due to the higher content of endospores. These results suggest that endospore production improves CPA–8 resistance to spray–drying formulation system. The study of carriers/protectants addition in spray–drying CPA–8 formulations showed that four different combinations of skim milk and MgSO4 provided reasonable recovery powder (28–38 %) and moisture content (7–13 %). CPA–8 survival varied considerably among spray–dried 24– and 72–h–old formulations. The 72 h–old CPA–8 culture spray dried showed the highest survival (28–32 %) and a final concentration product of 1.6–3.3×109 CFU g–1, while viability of 24 h–old culture formulations were lower than 1 %. Rehydration media as water or phosphate buffer provided good recovery of dried cells from CPA–8 formulations as well as skim milk or sucrose both at 10%. This result is a practical advantage. CPA–8 formulations after 4 and 6 month of storage at 4 ºC (cold) or at 20 ºC (room temperature) maintained survival and efficacy to control brown rot caused by Monilinia spp. on nectarines and peaches achieving disease incidence reductions among 90 and 100 %. Spray drying could be considered a suitable method to obtain stable and effective formulations of B. subtilis CPA–8. In conclusion, the studies in this thesis demonstrated the biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 to control postharvest diseases of fruit and established the bases for subsequent implementation of production and formulation at commercial level.

Desde 1988, año en que se descubrieron las fumonisinas, toxinas de origen füngicoproducidas básicamente por especies del género Fusarium, numerosos estudiostoxicológicos han puesto de manifiesto su implicación en la problemática para la saludanimal que se deriva del consumo de piensos y otros productos agrícolas contaminados porFusarium sección Liseola por parte del ganado. Asimismo, se ha llegado a asociar de algunamanera el consumo directo de maíz contaminado, con el desencadenamiento de cánceresofágico en humanos, sin embargo la relación causa-efecto no ha sido demostrada.Si bien la contaminación masiva de materias primas por fumonisinas por lo general se asociaa países subdesarrollados del continente africano, asiático y Sudamérica, estudios deincidencia llevados a cabo en otros muchos países han demostrado que en mayor o menorcantidad, las fumonisinas se hallan presentes en la mayoría de muestras de maíz paraalimentación animal ensayadas. Este hecho ha dado lugar a la proliferación de estudios detodo tipo, dentro de los cuales se enmarca esta tesis, encaminados a dilucidar en quémomento y bajo qué condiciones se producen estas micotoxinas.Los objetivos de la presente tesis han sido en primer lugar, determinar el impacto que, la aw,la temperatura y los conservantes químicos, como factores abióticos, ejercen sobre lagerminación, crecimiento y producción de FB] por F. monili/orme y F. proliferatum enmaíz. En segundo lugar se ha determinado el efecto de las interacciones rungicas, es decir,cómo influyen cepas füngicas propias del maíz sobre el desarrollo y producción de FB] porlas cepas de Fusarium, y su relación con el resto de factores abióticos. Posteriormente, a lavista de estos resultados, se ha pasado a evaluar el potencial que la manipulación de losfactores abióticos puede tener como sistema de control del grano almacenado. Por último, sehan ensayado la cuantificación de la producción de enzimas hidrolíticos por Fusariumsección Liseola, como método alternativo de detección de su presencia en grano, así como ladeterminación del valor calórico del grano contaminado por estas mismas cepas, comométodo alternativo de cuantificación de la pérdida de calidad del grano.Se ha demostrado que a pesar de que las cepas de Fusarium son capaces de crecer endiferentes substratos, la producción masiva de fumonisinas únicamente se da en el maíz. Seha visto que sobre este cereal la germinación de estas cepas es posible entre 5 y 37°C y a awà 0,88, el intervalo se estrecha ligeramente para el crecimiento (7-37°C, arw ä 0,90), y porúltimo, y lo que es más importante, la producción de FBt solo es posible entre 10 y 37°C y aaw > 0,93, con las consecuencias que este dato reporta desde el punto de vista del control enmaíz y productos derivados. Se ha demostrado que los conservantes a base de propionatosexistentes en el mercado son útiles para el control del crecimiento de Fusaríum spp. in situ,pero para el control de la producción de FBi sólo es eficaz a concentraciones > 0,07%.La presencia de otras cepas füngicas en cultivos mixtos, en general, inhibió el desarrollo deFusarium, siendo A. flaws y A. niger las especies que causaron mayor impacto. Su efecto,sin embargo, dependió de los factores abióticos involucrados. En general, las especies deFusarium compitieron con éxito a aw altas, y mejor a temperaturas cercanas a los 15°C. Sinembargo, se observó que a a^ altas, la producción de FBi podía verse potenciada pordeterminadas especies, principalmente A. niger.Finalmente, además de la determinación de fumonisinas en materias primas, se ha visto quela monitorización de la actividad enzimàtica en el grano, y de la pérdida de valor calórico delmismo pueden ser buenos índices de la infección del grano por Fusarium. +En conclusión, de la presente tesis se deriva que, en condiciones normales, el control de lacontaminación por fumonisinas del grano en post-cosecha puede llevarse a cabo con éxitopor el simple control de la ÜTW; en esta etapa la flora acompañante puede incluso actuar comofactor adicional de control. Sin embargo, cabe resaltar que a partir de estos mismosresultados se puede deducir que la presencia de fumonisinas en maíz puede ser ya muy altaen el campo, y que años lluviosos puedan provocar niveles altos de las mismas antes delsecado.

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El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patògens enpostcollita de fruita i vegetals, una manca d'adequats substituts pels fungicides iuna preocupació creixent de la societat respecte als perills sanitaris imediambientals que comporten els pesticides i els seus residus, han generat ungran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius, efectius però mésrespectuosos amb el medi ambient. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes ha sorgit com una de les alternatives més prometedores. La socaCPA-1 del llevat Candida sake, el qual s'ha aïllat de la superfície de,mançanes alnostre laboratori, ha demostrat tenir una bona capacitat antagònica enfront elsprincipals fongs patògens en postcollita de fruita de llavor. L'aplicaciód'antagonistes en precollita per controlar les malalties de la fruita de llavor enpostcollita podria ser un mètode avantatjós ja que podria prevenir infeccionslatents, permetria una menor manipulació de la fruita i disminuiria potencialmentels danys i ferides que es donen durant qualsevol dels tractaments de postcollita.Així mateix, es reduiria el període entre la collita i l'emmagatzemament en fred is'evitaria la contaminació addicional per patògens que suposa el tractament químicde la fruita en el "drencher". No obstant, fins ara l'aplicació d'agents de biocontrolen el camp s'ha vist limitada per la sensibilitat que aquests tenen a l'estrèsmediambiental, ja que els microorganismes tenen uns intervals de creixement moltlimitats tant pel que fa a la temperatura com a la humitat.Els objectius del present estudi han estat la determinació de la dinàmicapoblacional de la microflora natural de les mançanes "Golden Delicious" durantdiferents estadis de desenvolupament (Capítol 2), durant la conservació en fred idurant el període de simulació de la comercialització o "shelf life" de la fruita, iavaluar l'efecte que té el tractament amb C. sake en la microflora pròpia de lesmançanes (Capitol 3). D'altra banda, volia avaluar-se el potencial pràctic de lautilització de l'antagonista al camp per aconseguir un bon control de l'agentcausant de la principal malaltia en postcollita de mançanes, Pénicillium expansum(Capitol 4). Tantmateix, els estudis detallats sobre l'ecofisiologia de C. sake hanpermès identificar mètodes per millorar la tolerància de les cèl·lules a l'estrèsmediambiental, la seva viabilitat i adaptació (Capítols 5 i 6); i, mitjançant lamanipulació del contingut de les reserves endògenes acumulades, millorar elcreixement en el camp i aconseguir un bon nivell de biocontrol de la podriduracausada per Pénicillium mitjançant el tractament a camp (Capítol 6).La població microbiana total va variar segons l'estat de desenvolupament del fruit,així com també amb les condicions climàtiques. La microflora predominant en lesmançanes durant el seu desenvolupament van ser les floridures Cladosporium,Alternaria spp. i els llevats blancs. D'altra banda, les floridures patògenes mésimportants en postcollita, P. expansum i Botrytis cinérea, rarament es van aïllardurant el desenvolupament del fruit. En canvi, la presència del gènere Pénicilliumen les mançanes va esdevenir important durant la seva conservació en fred i durantel període de "shelf life" després de la conservació. La població bacteriana va sermàxima a l'estadi de borró i va disminuir durant el període de desenvolupamentdel fruit, essent rarament aïllades durant la collita i la conservació en fred.L'aplicació de C. sake en mançanes, dos dies abans de la collita, va reduirsignificativament la població de Cladosporium i Pénicillium spp. al final de laconservació en fred i durant el període de simulació de la comercialització. Noobstant, l'aplicació del llevat antagonista en precollita, en mançanes foradades iinoculades artificialment va resultar menys efectiva contra la podridura perP. expansum que el tractament en postcollita amb C. saké. La població del'antagonista aplicada en precollita sobre mançanes "Golden Delicious" i ambdanys artificials, disminueix abans i més ràpidament que quan es tracta enpostcollita. Es fa necessària doncs, més recerca per entendre la raó per la qual esdóna aquesta supervivència més baixa de C. sake quan s'aplica en precollita idesprés s'emmagatzema en fred.Es van dur a terme estudis detallats d'ecologia i fisiologia de C. sake per aidentificar l'efecte de l'activitat d'aigua (ow), temperatura, pH i la seva interaccióen el seu creixement per així identificar els seus límits de creixementmediambientals. Es va trobar que les condicions mediambientals en les que l'agentde biocontrol pot desenvolupar-se estan limitades per una aw mínima entre 0.90 i0.92. C. sake va resultar tolerant a un ampli rang de pH (entre 3 i 7),independentment de l'aw i la temperatura.Els polihidroxialcohols i els sucres que es van acumular en major proporció en lescèl·lules de C. sake crescudes en medi basal no modificat (NYDB) van ser arabitol,trealosa i glucosa, amb petites quantitats de glicerol i eritritol. En experimentsin vitro, el creixement de C. sake en medi amb aw reduïda (0.96) va resultar en unamodificació d'aquestes reserves endògenes i una millora de la viabilitat a baixaowquan es compara amb cèl·lules no modificades. En assaigs de laboratori, lescèl·lules de C. sake modificades van mantenir la seva efectivitat i fins i tot la vanmillorar enfront la podridura causada per P. expansum en mançanes "GoldenDelicious". En assaigs de camp, però, no es van observar millores significatives enel control de la podridura per P. expansum en postcollita de mançanes foradadesartificialment i infectades quan comparem cèl·lules no modificades i cèl·lulestolerants a aw baixes. Immediatament després de l'aplicació de l'antagonista enprecollita, es va observar que les cèl·lules no modificades es van adherir millor a lasuperfície de la poma que no pas les modificades. No obstant, després d'unes horessota condicions de camp, la població de cèl·lules aw-tolerants va augmentarsignificativament, mentre que la població de cèl·lules no modificades va romandreconstant. És possible que els requeriments energètics per a la producció d'elevadesconcentracions de reserves endògenes puguin resultar en una modificació de laconcentració o característiques de la matriu extracel.lular del llevat.Probablementuna millora de l'adherència de les cèl·lules modificades podria donar lloc amillores en l'efectivitat.Així doncs, aquest enfoc es presenta com una via interessant per a poderaconseguir alguns avantatges en la formulació dels antagonistes, intentant fer-losmés tolerants a baixes aw permetent-los-hi així, un establiment més efectiu al camp,conservant l'eficàcia com a agents de biocontrol. En aquest aspecte, l'estudi vademostrar que existeix un gran potencial per a la utilització de mitjansecofisiològics que millorin l'adaptació ecològica dels agents de biocontrol aplicatsal camp. / El desarrollo de resistencia a los fungicidas por parte de muchos patógenos depostcosecha de frutas y vegetales, la falta de substitutos adecuados a losfungicidas, y el creciente interés social sobre los peligros ambientales y de saludque tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo demétodos de control alternativos que sean ambientalmente más favorables. Elcontrol biológico empleando microorganismos ha surgido como una de lasalternativas más prometedoras. La levadura Candida sake (cepa CPA-1), aislada ennuestro laboratorio a partir de manzanas, ha demostrado tener actividad antagónicafrente a los principales patógenos de postcosecha en fruta de pepita. Su aplicaciónen precosecha para el control de las enfermedades presentes en fruta de pepita enpostcosecha sería beneficiosa por varias razones. En primer lugar conseguiríamosuna prevención de infecciones latentes, además se requeriría una menormanipulación de la fruta y disminuiría la posibilidad de daños y heridas durante lostratamientos de postcosecha. Los períodos de tiempo entre la cosecha y laconservación en frío se reducirían y finalmente se evitaría la contaminaciónadicional debida a patógenos fúngicos procedentes de los tratamientos químicos dela fruta en el "drencher". Sin embargo, la aplicación de agentes de biocontrol encampo se ve limitada por la sensibilidad de los microorganismos al estrésambiental, especialmente a la humedad relativa y a la temperatura.Los objetivos del presente estudio han sido, la determinación de la dinámica depoblación microbiana propia de las manzanas "Golden Delicious" a lo largo de lasdiferentes fases de su crecimiento (Capítulo 2), durante la conservación en frío y elperíodo de vida útil o "shelf life", y la evaluación del efecto del tratamiento deC. sake sobre la microflora natural (Capítulo 3) . También se han llevado a caboestudios de la aplicabilidad del agente de biocontrol en precosecha; para ello serealizaron inoculaciones en campo del antagonista con el fin de lograr un controladecuado del agente causal de la principal enfermedad de postcosecha demanzanas, P. expansum (Capítulo 4). Los estudios detallados de la ecofisiología deC. sake han fijado los métodos para mejorar la tolerancia de las células al estrésambiental, su viabilidad y adaptación ecológica (Capítulos 5, 6) y, mediantemanipulación del contenido de azúcares y polialcoholes intracelulares, el aumentode su crecimiento en campo y el mantenimiento del biocontrol de la podredumbrede Pénicillium en el tratamiento en precosecha (Capítulo 7).Se ha encontrado que la población microbiana total varía con el estado dedesarrollo de la fruta y con las condiciones climáticas. La flora predominantedurante el desarrollo de las manzanas fueron los mohos filamentososCladosporium y Alternaria spp. y las levaduras blancas. Sin embargo, los patógenos más importantes en postcosecha, P. expanswn y Botrytis cinérea,raramente fueron aislados de manzanas durante los diferentes estadios dedesarrollo. Por el contrario, la presencia del género Pénicillium llegó a serimportante en las manzanas durante las etapas finales de la conservación en frío yen el período de "shelf life". La población bacteriana fue máxima en el estadio deyema y disminuyó durante el período de desarrollo de las manzanas, aislándoseraramente en el momento de la cosecha y durante la conservación en frío. Laaplicación en precosecha de C. saké a las manzanas dos días antes de surecolección disminuyó significativamente las poblaciones de Cladosporium yPénicillium spp. al final de las condiciones de conservación en frío y durante elperíodo de vida útil ambiental. Sin embargo, la aplicación en precosecha de lalevadura antagonista fue menos efectiva contra la podredumbre de Pénicillium enmanzanas artificialmente heridas e inoculadas que el tratamiento de postcosechacon C. sake. Las poblaciones de C. sake aplicada en precosecha sobre manzanas"Golden Delicious" y con daños artificiales, disminuyen antes y más rápidamenteque cuando el tratamiento es en postcosecha. Por esta razón se necesita unainvestigación adicional que permita entender por qué C. sake presenta una menorsupervivencia cuando la aplicación se realiza en precosecha y posteriorconservación en frío. Para ello, se llevaron a cabo estudios de la ecología yfisiología de C. sake con el fin de determinar el efecto de la actividad de agua (a .),temperatura, pH y su interacción en el crecimiento del microorganismo, y poder asífijar los límites ambientales del antagonista. Se encontró que las condicionesambientales en las cuales este agente de biocontrol crece efectivamente estabanlimitadas por una aw entre 0.90 - 0.92. C. sake fue tolerante a un amplio intervalode pH (3-7), independientemente de la temperatura y de la aw.Los principales polihidroxialcoholes y los azúcares intracelulares acumulados enC. sake crecida en un medio base no modificado (NYDB) fueron el arabitol, latrealosa y la glucosa junto con pequeñas cantidades de glicerol y eritritol. Enexperiencias in vitro la producción de C. sake en un medio con aw reducida (0.96)dio como resultado una modificación significativa de estas reservas endógenas yuna mejora en la viabilidad a baja aw, comparada con células no modificadas. Elbiocontrol de P. expansum en .manzanas "Golden Delicious" se mantuvo con esteinoculo modificado tolerante a baja a , y en algunos casos, incluso fue mejor enensayos de laboratorio. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en elbiocontrol en postcosecha de la podredumbre de P. expansum en manzanasartificialmente heridas e inoculadas en ensayos de campo con células de C. sake« .-tolerantes y no modificadas. Inmediatamente después de la aplicación enprecosecha del antagonista se observó una mejor adherencia a la superficie de lamanzana de las células de levadura no modificadas frente a las del inoculo modificado. No obstante, después de unas pocas horas en condiciones de campolas poblaciones del inoculo aw-tolerantes aumentaron significativamente, mientrasque las poblaciones del tratamiento no modificado permanecieron sin cambios.Estos resultados nos hacen pensar que la energía necesaria para la producción dealtas concentraciones de reservas endógenas pueda producir una modificación dela concentración o características de la matriz extracelular de la levadura.Probablemente una mejora en la adherencia de las células modificadas podríatraducirse en una mayor efectividad.Así pues, algunas de estas ventajas ecológicas deberían ser aprovechadas en laformulación del inoculo tolerante a aw bajas para de esta forma lograr unaestabilidad más efectiva en el campo, conservando su eficacia en el biocontrol.Este aspecto del estudio demostró que el empleo de medios ecofisiológicos paramejorar la adaptación ecológica de los agentes de biocontrol y para su aplicaciónen campo es altamente prometedora, y que ésto podría tener un profundo impactoen el desarrollo de agentes de control biológico efectivos en precosecha. / The development of resistance to fungicides by many postharvest pathogens offruits and vegetables, a lack of adequate fungicide replacements, and growingpublic concern over health and environmental hazards from pesticides, havetogether generated new interest in the development of alternative moreenvironmentally friendly control methods. Biological control usingmicroorganisms has emerged as one of the most promising alternatives. The yeastCandida sake (strain CPA-1), which was isolated from the apple surface in ourlaboratory, has been demonstrated to have antagonistic activity against the majorpostharvest pathogens of pome fruits. Preharvest antagonist application forpostharvest control of pome fruit diseases would be advantageous as latentinfections may be prevented, less fruit manipulation would be required, and itwould decrease the potential for damage and injuries during any postharvesttreatments. The time periods between harvest and cold storage would be reducedand additional contamination by pathogenic fungi from drenching solutions usedduring chemical treatments would be avoided. However, application of biocontrolagents in the field has been limited by sensitivity to environmental stressesincluding a narrow relative humidity and temperature range.The aims of the present study were to determine the microbial population dynamicson Golden Delicious apples during different developmental stages (Chapter 2),during cold storage and the ambient shelf-life period, and evaluate the effect ofC. sake treatment on the resident microflora (Chapter 3). Studies of the practicalpotential of using field inoculation of the antagonist to achieve good control theresponsible agent of the major postharvest disease of apples in Spain, Pénicilliumexpansum, was investigated (Chapter 4). Detailed studies of the ecophysiology ofC. sake identified methods for improving the environmental stress tolerance ofcells, their viability and ecological fitness (Chapters 5, 6); and by manipulation ofintracellular sugar alcohol and sugar content, to enhance growth in the field andconserve biocontrol of Pénicillium rot by field treatment (Chapter 7).Total microbial populations were found to vary with development stage, and withprevailing climatic conditions. The predominant mycoflora on apples duringdevelopment were the filamentous fungi Cladosporium mú Alternaria spp. andwhite yeasts. However, the most important postharvest pathogens/1, expansum andBotrytis cinérea were seldom isolated from ripening apples. On the contrary, thepresence of the Pénicillium genus became important on apples during later coldstorage and ambient shelf-life period. Bacterial populations were maximum at thebud stage and decreased during the development period of apples, isolated at harvest and during cold storage. Preharvest application of C. sake toapples two days before harvest significantly decreased populations ofCladosporium and Pénicillium spp. by the end of cold storage conditions andduring ambient shelf-life period. However, preharvest application of theantagonistic yeast was less effective against Pénicillium rot in artificiallyinoculated and wounded apples than postharvest treatment with C. sake. C, sakepopulations decreased faster after preharvest application than when appliedpostharvest during subsequent cold storage. Further research was thus needed tounderstand the reason for the lower survival of C. sake, when applied preharvestduring subsequent cold storage. Detailed studies were carried out on the ecologyand physiology of C. sake to identify the effect water activity (aw), temperature, pHand their interaction on growth and identify environmental limits of the antagonist.The environmental niche within which this biocontrol agent will effectively growwas found to be limited by about 0.90-0.92 aw. C. sake was tolerant of a wide rangeof pH levels (3-7) regardless of aw and temperature. The major intracellularpolyols/sugars accumulated in C. sake cells grown on unmodified basal medium(NYDB) were arabitol, trehalose and glucose with small amounts of glycerol anderythritol. Production of C. sake in reduced aw media (0.96) resulted in asignificant modification of these endogenous reserves and an improvement inviability at lowered aw when compared to unmodified cells in in vitro experiments.Biocontrol of P. expansum on Golden Delicious apples by these modified low owtolerantinocula was maintained, and in some cases improved in laboratory assays.However, no significant improvements were observed in postharvest biocontrol ofP. expansum rot in apples artificially wounded and infected in field trials with tocompare unmodified and aw-tolerant cells of C. sake. Immediately after preharvestapplication of the antagonist it was notable that unmodified yeast cells adheredbetter to the apple surfaces than the modified inocula. However, after a few hoursunder field conditions populations of the ow-tolerant inocula increasedsignificantly, while those of unmodified treatment populations remainedunchanged. It is also possible that the energy requirements for the production ofhigh concentrations of endogenous reserves could result in a modification of theconcentration or characteristics of the matrix. Some ecological advantages may begained in formulating low-aw tolerant inocula for more effective establishment inthe field, while conserving biocontrol efficacy. This aspect of the studydemonstrated that great potential exists for using ecophysiological means forimproving the ecological fitness of biocontrol agents applied in the field, and thiscould have a profound impact on the development of effective preharvestbiological control agents for use in the field.

El objetivo de este trabajo ha sido la experimentación condistintos equipos industriales de microfiltración tangencialy probarlos con diferentes tipos de vino para determinar elefecto de este sistema de filtración en los vinos filtrados.t ».Ha habido una evolución en el diseño y funcionamiento de losequipos de microfiltración tangencial. Desde el primer equipoutilizado en el año 1992, se han ido incorporando mejoras, en1 !·el segundo del año 1993 y en el tercero del año 1996. Cadaaño ha aportado nuevas prestaciones en los equiposfiltrantes.En cuanto al funcionamiento de los equipos de microfiltracióntangencial se ha pasado de incorporar todo el concentrado enel depósito pulmón del vino a filtrar caso Romicon®, amezclar el vino a filtrar con un porcentaje pequeño deconcentrado (entre el 1% al 1,5%) según el tipo de vino, enlos modelos de Seitz y de Vaslin Bucher.Otra mejora en los equipos de microfiltración tangencial hasido en el aspecto de la limpieza de las membranas. Laposibilidad de limpiar la membrana sin necesidad de parar lafiltración, ya sea con el sistema de parada de la bomba derecirculación por cinco segundos cada veinte minutos en elequipo Seitz o por el sistema de retrofiltración y enjuaguesintermedios en el equipo Vaslin Bucher.Se ha adoptado el criterio expresado en diferetes trabjos deque la microfiltración tangencial no tiene ningún efectonegativo sobre los parámetros físico-químicos que controlanla calidad de los vinos.La calidad de limpidez obtenida en una sola filtración esbuena entre brillante y clara, dependiendo del tipo de vino afiltrar y las características del aparato.En la actualidad las ventajas de la microfiltracióntangencial en el sector enológico son:a) el respeto por el medio ambiente, al no producir residuoscontaminantes.b) la total automatización de su funcionamiento.c) la mínima merma de vino.d) la eliminación de los coadyuvantes de filtración.e) la simplificación de los distintos procesos de filtraciónquedando reducido a un solo proceso: la microfiltracióntangencial.Como desventaja, el coste inicial del equipo demicrofiltración tangencial respecto a filtros de tierra, deplacas o cartuchos.

Es fiimonisines, produïdes principalment per Fusariumverticillioides i F. proliferatum, i la zearalenona (ZEA) i el deoxinivalenol(DON), produïdes per F. graminearum entre altres espècies de Fusarium,són micotoxines que es troben freqüentment al panís. Donat que laproducció de micotoxines es veu influenciada per diferents factors biòtics iabiòtics, el grau de contaminació amb aquestes toxines varia any rera any,depenent tant de las condicions climàtiques com de les pràctiques agràries.Les espècies del gènere Fusarium os consideren com a fongs de camp, ja quecolonitzen els conreus abans de la collita; la prevenció mitjançant el controlprecollita és el primer pas per a minimitzar la contaminació amb lesmicotoxines produïdes per aquestes espècies. L'ús de fungicides sintèticss'està controlant cada cop més i la pressió per a trobar alternatives méssegures augmenta. Diversos estudis s'han centrat en trobar fungicides quesiguin segurs tant per a la salut com per al medi ambient. Els extractesnaturals de plantes poden proveir una alternativa als fungicides sintètics.Diferents investigadors han realitzat estudis observant l'efecte dels olisessencials en el creixement fúngic i han constatat que alguns d'ells podrienservir com fungicides naturals.Els objectius d'aquesta tesi han estat a) avaluar la contaminació perfumonisines Bi (FBO en panís i productes derivats del panís. destinats alconsum humà i animal a Espanya. En segon lloc, b) s'ha determinat l'efectede les interaccions fúngiques, entre soques de F. verticillioides i F.proliferatum productores de fumonisines, amb soques de F. graminearum,productores de zearalenona i deoxinivalenol, en el creixement i la produccióde micotoxines y la relació amb els factors abiòtics. Posteriorment, c) s'harealitzat una avaluació in vitro d'una sèrie d'olis essencials per a determinarel seu efecte inhibitor! del creixement de F. verticillioides, F. proliferatum iF. graminearum. Finalment, d) s'han seleccionat cinc olis essencials amb elsquals s'han continuat els estudis, a fi d'avaluar el seu efecte com inhibidorsdel creixement de F. verticillioides, F. proliferatum i F. graminearum i de laproducció de fumonisines, zearalenona i deoxinivalenol en funció delsfactors abiòticos (aw i temperatura) en grans de panís irradiats.Es va veure que el 86 % de les mostres recollides durant els anys1998-2000, destinades al consum animal contenien FBi en un interval de 89-8760 ng g"1. Quatre d'aquestes mostres presentaren nivells de FBi superiorsa 5000 ng g"1, que és el límit recomanat pel Comité de Micotoxines de 1'Associació Americana de Veterinaris de Laboratoris de Diagnosi per cavallsi altres equins. El 23 % de las mostres destinades al consum humà estavencontaminades amb FBl5 tot i que els valors trobats van ser generalmentbaixos. Es va veure que els productes de panís que han estat processatsindustrialment, principalment per via tèrmica, presenten concentracionsmenors de FBi.En general, la producció de les micotoxines estudiades no semblatenir un paper lligat a l'obtenció d'un avantatge competitiu davant d'altresespècies. Tampoc s'observà una inhibició de la producció de micotoxinesdeguda a la presència d'altres espècies competidores. La producció va estarmés condicionada pels factors abiòtics, com la temperatura i la aw que per lapossible interacció entre diferents espècies de floridures.Els olis essencials que mostraren major activitat antifúngica forenels de canyella, clau, lemongrass, orenga i palmarosa. L'acció antimicòtica iantimicotoxigènica d'aquests cinc olis essencials fou més accentuada quan elgra tenia la màxima aw estudiada (0,995). Els olis essencials de orenga, clau ilemongrass inhibiren significativament el creixement de totes les soques deles tres espècies de Fusarium estudiades quan el gra de panís tenia una a^inicial de 0,995 i s'incubava a 20 o a 30 °C. La producció de FI?! per F.verticillioides i F. proliferatum, i la producció de DON per F. graminearumforen significativament inhibides pels cinc olis essencials estudiats quan elsgrans de panís tenien una aw inicial de 0,995 y s'incubaven a 30 °C. Noobstant, al realitzar la incubació a 20 °C, la producció de FB] per F.verticillioides fou estimulada pels olis essencials de clau i orenga. D'altrabanda, la producció de ZEA fou inhibida només per l'oli essencial depalmarosa, a les dues temperatures quan la aw inicial del panís era de 0,995Realitzar un seguiment de la temperatura, la precipitació y la humitatrelativa durant el desenvolupament del gra de panís al camp permetriaefectuar una sèrie de recomanacions sobre els tractaments a seguir. Eltractament amb olis essencials com a fungicides podria ser una alternativa,encara que prèviament s'haurien de fer més estudis per a determinar laviabilitat. La implementació d'un sistema integrat, que consistiriabàsicament en un programa de control basat en l'Anàlisi de Perills y PuntsCrítics de Control (APPCC), seria necessari per a assegurar una baixacontaminació en els aliments. / Fumonisins, which are mostly produced by Fusarium verticillioidesand F. proliferatum, and zearalenone (ZEA) and deoxynivalenol (DON),which are produced by F. graminearum among other Fusarium species, arecommon contaminants in maize. These mycotoxins production is influencedby some biotic and abiotic factors, therefore contamination level varies everyyear, and depends on environmental conditions and agricultural practices.Fusarium spp. is usually described as a field fungi, because it colonises thecrop before harvest; the preharvest control is the first step to prevent fromthe invasion of these Fusarium species and mycotoxins production underfield conditions. The use of synthetic fungicides is becoming morecontrolled, and there is an increasing pressure to find safer alternatives.Several researchers have focused in the search for fungicides that are safe tohumans and for the environment. Natural extracts from plants may providean alternative to synthetic fungicides. Researchers have examined the effectof some essential oils on growth rates of some fungi and have shown thatsome of them could be used as natural fungicides.The objectives of the present thesis were to investigate a) thefumonisin Bi (FBO contamination on corn and corn-based food productsfrom Spain, intended for animal and human consumption; b) the effect offungal interactions between producing fumonisin isolates, and isolates of F.graminearum producing zearalenone and deoxynivalenol, on growth rate andmycotoxins production and the relationship with abiotic factors; c) an invitro screening of some essential oils on inhibition of mycelial growth of F.verticillioides, F. proliferatum and F. graminearum; and d) the study wascontinued with five selected essential oils from the screening assess theirefficacy on growth rate of F. verticillioides, F. proliferatum and F.graminearum and inhibition of FBb zearalenone and deoxynivalenolproduction at different aw and temperature conditions in maize grain.