L'activitat hortícola al litoral mediterrani peninsular es desenvolupa seguint cicles de cultiu on alternen conreus a l'aire lliure i conreus protegits, en els quals es combinen una gran diversitat d'espècies vegetals. En aquesta zona es dóna un clima de transició entre el clima temperat i el tropical sec, amb estius calorosos i hiverns suaus. Amb aquestes condicions climatològiques i contràriament al que passa al centre i nord d'Europa, a la regió mediterrània molts organismes vius no aturen la seva activitat durant l'hivern o només l'aturen durant un període molt curt o en certs moments de l'estiu. En aquesta situació de presència continua de conreus i condicions ambientals òptimes, les plagues troben la possibilitat de desenvoluparse al llarg de tot l'any i assolir poblacions molt elevades. A això hi contribueix també la gran polifàgia que caracteritza a la majoria de les plagues, perquè els hi facilita l'adaptació a aquestes condicions heterogènies i canviants al llarg de l'any.Les estratègies de control biològic depenen del tipus de conreu al qual van dirigides, segons siguin protegits o d'aire lliure. En els conreus protegits les condicions ambientals més controlables faciliten la utilització de mètodes de control de tipus inoculatiu, amb alliberacions d'enemics naturals que s'han criat prèviament en una unitat de cria massiva. Aquest seria el cas de l'afelínid Encarsia formosa Gahan, parasitoid utilitzat en hivernacles de tomaqueres pel control de la mosca blanca dels hivernacles Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Castañé et al. 1988). Això no obstant, en els conreus protegits típics del litoral mediterrani peninsular també es poden desenvolupar estratègies de tipus augmentatiu o conservatiu. En aquesta zona els hivernacles són estructures semiobertes on les plagues i els seus enemics naturals tenen la possibilitat de colonitzarlos de forma espontània. Aquest seria el cas dels dípters minadors de fulla del gènere Liriomyza i dels seus enemics naturals. En el conreu de tomaquets a, els parasitoids autòctons estalvien, en molts casos, qualsevol intervenció per controlar aquesta plaga (Albajes et al. 1994). També colonitzen els hivernacles de tomaqueres de forma espontània certs heteròpters depredadors de règim alimentari polífag, els quals ajuden a reduir els nivells de mosca blanca i d'altres plagues. En els conreus d'aire lliure, l'estratègia majoritària va dirigida a la utilització dels enemics naturals autòctons, amb estratègies de tipus augmentatiu o conservatiu (Rabb et al 1976). La fauna d'enemics naturals és molt variada i abundant. Aquest seria el cas del programa de control integrat desenvolupat per l'IRTA de Cabrils destinat al control de la mosca blanca en camps de tomaquera d'exterior (Alomar et al. 1991). Aquest programa es basa en el maneig dels heteròpters de la família Miridae, que colonitzen espontàniament els camps de tomaquera i mantenen les poblacions de mosca blanca per sota del llindar de dany econòmic. / La actividad hortícola al litoral mediterráneo peninsular se desarrolla siguiendo ciclos de cultivo dónde alternan cultivos al aire libre y cultivos protegidos, en los cuales se combinan una grande diversidad de especies vegetales. En esta zona se da uno clima de transición entre el clima templado y el tropical seco, con veranos calurosos y inviernos suaves. Con estas condiciones climatológicas y contrariamente al que pasa al centro y norte de Europa, a la región mediterránea muchos organismos vivos no paran su actividad durante el invierno o sólo el paran durante uno periodoperíodo muy corto o en ciertos momentos del verano. En esta situación de presencia continúa de cultivos y condiciones ambientales óptimas, las plagas encuentran la posibilidad de desarrollarse a lo largo de todo el año y lograr poblaciones muy elevadas. A esto contribuye también la grande polifagia que caracteriza a la mayoría de las plagas, porque se los facilita la adaptación a estas condiciones heterogéneas y cambieantes a lo largo del año.Las estrategias de control biológico dependen del tipo de cultivo al cual van dirigidas, segundos sean protegidos o de aire libre. En los cultivos protegidos las condiciones ambientales más controlables facilitan la utilización de métodos de control de tipo inoculativo, con la liberación de enemigos naturales que se han criado previamente en una unidad de cría masiva. Este sería el caso del afelínid Encarsia formosa Gahan, parasitoide utilizado en invernaderos de tomateras por el control de la mosca blanca de los invernadero Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Castañé et al. 1988). Esto no obstante, en los cultivos protegidos típicos del litoral mediterráneo peninsular también se pueden desarrollar estrategias de tipo aumentativo o conservativo. En esta zona los invernadero son estructuras semiabiertas dónde las plagas y sus enemigos naturales tienen la posibilidad de colonizarlos de forma espontánea. Este sería el caso de los dípteros minadores de hoja el género Liriomyza y de sus enemigos naturales. En el cultivo de tomates a, los parasitoides autóctonos ahorran, en muchos casos, cualquiera intervención por controlar esta plaga (Albajes et al. 1994). También colonizan los invernaderos de tomateras de forma espontánea ciertos heterópteros depredadores de régimen alimentario polífago, los cuales ayudan a reducir los niveles de mosca blanca y de otros plagas. En los cultivos de aire libre, la estrategia mayoritaria va dirigida a la utilización de los enemigos naturales autóctonos, con estrategias de tipo aumentativo o conservativo (Rabb et al 1976). La fauna de enemigos naturales es muy variada y abundante. Este sería el caso del programa de control integrado desarrollado por el IRTA de Cabrils destinado al control de la mosca blanca en campos de tomaquera de exterior (Alomar te al. 1991). Este programa se basa en el manejo de los heterópteros de la familia Miridae, que colonizan espontáneamente los campos de tomatera y mantienen las poblaciones de mosca blanca por debajo del umbral de daño económico.

Es van mostrejar volàtils de pomera i noguer emesos per branques intactes en camp, rodejadesper bosses de plàstic, al matí i al crepuscle en diferents moments de la campanya. Aquestes mostres esvan analitzar per cromatografia de gasos-espectrometria de masses (GC-MS) i cromatografia de gasoselectroantenodetecció(GC-EAD) fent servir antenes de mascles de Cydia pomonella. Es van detectar 44compostos en pomera i 90 en noguer per mitjà de la GC-MS. Les emissions d'ambdues espècies vanvariar clarament, tant quantitativament com qualitativa. Els compostos alifàtics eren majoritaris en lesemissions de pomera, mentre les terpens ho eren a les de noguer. Es va trobar activitat EAD per 5compostos a les mostres de pomera i 10 a les de noguer. Posteriors proves d'electroantenografia (EAG)amb mascles i femelles van revelar una forta activitat EAG per nombrosos volàtils emesos per pomera.En aquests assajos la resposta dels mascles va ser sempre igual o superior a la de les femelles, excepte pelβ-mircè. Entre els compostos actius en les anàlisis de GC-EAD, el butanoat d'hexil era específic depomera, 3 compostos eren específics de noguer (al·loocimè, pinocarvona, i òxid de cariofil·lè) i la restaeren comuns entre ambdues espècies de planta. La 2-ciclopentilciclopentanona, un compost emès per lesbosses de plàstic, també va provocar intenses respostes EAG en antenes d'ambdós sexes.El (E,Z)-2,4-decadienoat d'etil (èster de pera), i el (E)-β-farnesè van ser completament atraientsen camp, però no van estimular contactes amb la font en túnel de vent, suggerint que d'altres estímulssensitius estan relacionats amb el seu funcionament en camp. La preexposició a la feromona sexual,(E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, va disminuir la resposta dels mascles a aquesta en túnel de vent, però vaincrementar la resposta a l'èster de pera; i no va tenir cap efecte sobre les femelles. De forma semblant,les captures en camp amb èster de pera van ser superiors sota confusió sexual. L'èster de pera va actuarcom antagonista de la feromona sexual en barrejar-se a altes quantitats. No obstant, l'antagonisme vadesaparèixer en presentar ambdós compostos en septes separats; i els mascles van ser incapaços dediscriminar entre la feromona sexual sola i la barreja antagonista quan ambdues es van oferir una al costatde l'altra.Assajos d'oviposició i aparellament van demostrar que la temperatura modula el moment del díaen que aquests comportaments tenen lloc. En camp, l'oviposició es va avançar a temperatures baixes; i vaser màxima al 3r i 4t dies de vida. En laboratori, l'oviposició també es va avançar a temperatures mésbaixes, però per la majoria de temperatures assajades, el pic d'oviposició va tenir lloc durant la primerahora de l'escotofase. A 12ºC no hi va haver oviposició, i la fecunditat va ser màxima a 22 i 27ºC. Per undia determinat. L'activitat diària d'aparellament tenia lloc abans que la d'oviposició.Paraules clau: Cydia pomonella, volàtils de planta hoste, comportament, EAG, GC-EAD, GC-MS,Lepidoptera, Tortricidae, preexposició a la feromona, èster de pera, (E)-β-farnesè, vol orientat, feromonasexual, noguer, pomera, variació diària, temperatura, activitat diària, intensitat lumínica. / Se recogieron colecciones de volátiles de manzano y de nogal emitidos por ramas intactas encampo, con hojas y frutos, rodeadas por bolsas de plástico, por la mañana y en el crepúsculo en diferentesmomentos de la campaña. Estas muestras se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometríade masas (GC-MS) y cromatografía de gases-electroantenodetección (GC-EAD) usando antenas demachos de Cydia pomonella. Se detectaron 44 compuestos en manzano y 90 en nogal por GC-MS. Lasemisiones de ambas especies variaron ampliamente, tanto cuantitativa como cualitativamente. Loscompuestos alifáticos fueron mayoritarios en las emisiones de manzano, mientras que los terpenos lofueron en las de nogal. Se observaron variaciones entre periodos tanto para la campaña como para el día.Se encontró actividad EAD para 5 compuestos en las muestras de manzano y 10 en las de nogal.Posteriores pruebas de electroantenografía (EAG) con machos y hembras revelaron una fuerte actividadEAG para múltiples volátiles emitidos por manzano. En estos ensayos la respuesta de los machos fuesiempre igual o superior a la de las hembras, con la excepción del β-mirceno. Entre los compuestosactivos en los análisis de GC-EAD, el butanoato de hexilo fue específico de manzano, 3 compuestosfueron específicos de nogal (aloocimeno, pinocarvona, y óxido de cariofileno) y los restantes erancompartidos por ambas especies de planta. 2-Ciclopentilciclopentanona, un compuesto emitido por lasbolsas de plástico, también provocó intensas respuestas EAG en antenas de ambos sexos.(E,Z)-2,4-Decadienoato de etilo (éster de pera), y (E)-β-farneseno fueron completamenteatrayentes en campo, pero no provocaron contactos con la fuente en túnel de viento, sugiriendo que otrosestímulos sensoriales están relacionados con su funcionamiento en campo. La preexposición a laferomona sexual, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, disminuyó la respuesta a ella de machos en túnel de viento,pero incrementó la respuesta al éster de pera; y no tuvo efecto alguno sobre las hembras. De formasimilar, las capturas en campo con éster de pera fueron superiores en confusión sexual. El éster de peraactuó como antagonista de la feromona sexual al mezclarlo con ésta en cantidades elevadas. No obstante,el antagonismo desapareció cuando ambos compuestos se presentaban en septos separados; y los machosno discriminaron entre la feromona sexual sola y la mezcla antagonista cuando ambas se ofrecieron una allado de la otra.Los ensayos de oviposición y apareamiento demostraron que la temperatura modula el momentodel día en que estos comportamientos tienen lugar. En campo, la oviposición se avanzó a temperaturasmás bajas; y fue máxima en el 3º y 4º días de vida. En laboratorio, la oviposición también se avanzó contemperaturas más bajas, pero para la mayoría de temperaturas ensayadas, el pico de oviposición tuvolugar durante la primera hora de la escotofase. A 12ºC no hubo oviposición, y la fecundidad fue máxima a22 y 27ºC. Para un día determinado. La actividad diaria de apareamiento tenía lugar antes que la deoviposición.Palabras clave: Cydia pomonella, volátiles de planta huésped, comportamiento, EAG, GC-EAD, GCMS,Lepidoptera, Tortricidae, preexposición a la feromona, éster de pera, (E)-β-farneseno, vueloorientado, feromona sexual, nogal, manzano, variación diaria, temperatura, actividad diaria, intensidadlumínica. / Volatile compounds from apple and walnut trees were collected in the field from attachedbranches, bearing leaves and fruits, enclosed in plastic bags in the morning and at dusk, in differentperiods of the season. Collections were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),and gas chromatography-electroantennodetection (GC-EAD) using antennae of male Cydia pomonella.Forty four compounds in apple and 90 in walnut were detected by GC-MS. Emissions of both plantspecies widely differed both qualitatively and quantitatively. Apple emissions were dominated byaliphatic compounds, whereas walnut ones by terpenes. Diel and seasonal variations were found inemissions of both plant species. GC-EAD revealed activity for 5 compounds in apple collections and 10in walnut ones. Further electroantennographic (EAG) analyses with males and females revealed importantEAG-activity for many other volatiles emitted by apple. In these analyses male responses were equal to orhigher than those of female for all compounds, except for β-myrcene. Amongst the EAD-activecompounds in the GC-EAD analyses, hexyl butanoate was apple-specific, 3 compounds were walnutspecific(alloocimene, pinocarrvone, and caryophyllene oxide), and the remaining were shared by bothplant species. 2-Cyclopentylcyclopentanone, a compound emitted by the plastic bags, also elicited strongEAG responses in antennae of both sexes.Ethyl (E,Z)-2,4-decadienoate (pear ester), and (E)-β-farnesene were fully attractive for C.pomonella in field trapping. However, they did not elicit source contacts in wind tunnel, suggesting thatother sensory cues are involved in their field attractiveness. Pre-exposure to the sex pheromone, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol (codlemone), decreased male upwind flight to itself in wind tunnel, but increasedpear ester attractiveness; and had no effect on females. Similarly, trap captures with pear ester were foundto increase under mating disruption. Pear ester acted as a codlemone antagonist when blended at largeamounts. However, this effect disappeared when both compounds were loaded onto different septa; andmales were unable to discriminate amongst codlemone and the antagonistic blend when offered side-byside.Oviposition and mating assays showed that C. pomonella diel oviposition and mating timings aremodulated by temperature. In the field, oviposition activity was advanced by lower temperatures; and wasmaximum in the 3rd and 4th days of life. In the laboratory, oviposition was also advanced by lowertemperatures, but for most of the assayed temperatures it peaked in the first hour of the scotophase.Oviposition did not take place at 12ºC, and fecundity was maximum at 22 and 27ºC. Mating activityoccurred before than oviposition activity in a given day.Keywords: Cydia pomonella, host-plant volatiles, behavior, EAG, GC-EAD, GC-MS, Lepidoptera,Tortricidae, pheromone pre-exposure, pear ester, (E)-β-farnesene, upwind flight, sex pheromone, walnut,apple, diel variation, temperature, diel activity, light intensity.

El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patògens enpostcollita de fruita i vegetals, una manca d'adequats substituts pels fungicides iuna preocupació creixent de la societat respecte als perills sanitaris imediambientals que comporten els pesticides i els seus residus, han generat ungran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius, efectius però mésrespectuosos amb el medi ambient. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes ha sorgit com una de les alternatives més prometedores. La socaCPA-1 del llevat Candida sake, el qual s'ha aïllat de la superfície de,mançanes alnostre laboratori, ha demostrat tenir una bona capacitat antagònica enfront elsprincipals fongs patògens en postcollita de fruita de llavor. L'aplicaciód'antagonistes en precollita per controlar les malalties de la fruita de llavor enpostcollita podria ser un mètode avantatjós ja que podria prevenir infeccionslatents, permetria una menor manipulació de la fruita i disminuiria potencialmentels danys i ferides que es donen durant qualsevol dels tractaments de postcollita.Així mateix, es reduiria el període entre la collita i l'emmagatzemament en fred is'evitaria la contaminació addicional per patògens que suposa el tractament químicde la fruita en el "drencher". No obstant, fins ara l'aplicació d'agents de biocontrolen el camp s'ha vist limitada per la sensibilitat que aquests tenen a l'estrèsmediambiental, ja que els microorganismes tenen uns intervals de creixement moltlimitats tant pel que fa a la temperatura com a la humitat.Els objectius del present estudi han estat la determinació de la dinàmicapoblacional de la microflora natural de les mançanes "Golden Delicious" durantdiferents estadis de desenvolupament (Capítol 2), durant la conservació en fred idurant el període de simulació de la comercialització o "shelf life" de la fruita, iavaluar l'efecte que té el tractament amb C. sake en la microflora pròpia de lesmançanes (Capitol 3). D'altra banda, volia avaluar-se el potencial pràctic de lautilització de l'antagonista al camp per aconseguir un bon control de l'agentcausant de la principal malaltia en postcollita de mançanes, Pénicillium expansum(Capitol 4). Tantmateix, els estudis detallats sobre l'ecofisiologia de C. sake hanpermès identificar mètodes per millorar la tolerància de les cèl·lules a l'estrèsmediambiental, la seva viabilitat i adaptació (Capítols 5 i 6); i, mitjançant lamanipulació del contingut de les reserves endògenes acumulades, millorar elcreixement en el camp i aconseguir un bon nivell de biocontrol de la podriduracausada per Pénicillium mitjançant el tractament a camp (Capítol 6).La població microbiana total va variar segons l'estat de desenvolupament del fruit,així com també amb les condicions climàtiques. La microflora predominant en lesmançanes durant el seu desenvolupament van ser les floridures Cladosporium,Alternaria spp. i els llevats blancs. D'altra banda, les floridures patògenes mésimportants en postcollita, P. expansum i Botrytis cinérea, rarament es van aïllardurant el desenvolupament del fruit. En canvi, la presència del gènere Pénicilliumen les mançanes va esdevenir important durant la seva conservació en fred i durantel període de "shelf life" després de la conservació. La població bacteriana va sermàxima a l'estadi de borró i va disminuir durant el període de desenvolupamentdel fruit, essent rarament aïllades durant la collita i la conservació en fred.L'aplicació de C. sake en mançanes, dos dies abans de la collita, va reduirsignificativament la població de Cladosporium i Pénicillium spp. al final de laconservació en fred i durant el període de simulació de la comercialització. Noobstant, l'aplicació del llevat antagonista en precollita, en mançanes foradades iinoculades artificialment va resultar menys efectiva contra la podridura perP. expansum que el tractament en postcollita amb C. saké. La població del'antagonista aplicada en precollita sobre mançanes "Golden Delicious" i ambdanys artificials, disminueix abans i més ràpidament que quan es tracta enpostcollita. Es fa necessària doncs, més recerca per entendre la raó per la qual esdóna aquesta supervivència més baixa de C. sake quan s'aplica en precollita idesprés s'emmagatzema en fred.Es van dur a terme estudis detallats d'ecologia i fisiologia de C. sake per aidentificar l'efecte de l'activitat d'aigua (ow), temperatura, pH i la seva interaccióen el seu creixement per així identificar els seus límits de creixementmediambientals. Es va trobar que les condicions mediambientals en les que l'agentde biocontrol pot desenvolupar-se estan limitades per una aw mínima entre 0.90 i0.92. C. sake va resultar tolerant a un ampli rang de pH (entre 3 i 7),independentment de l'aw i la temperatura.Els polihidroxialcohols i els sucres que es van acumular en major proporció en lescèl·lules de C. sake crescudes en medi basal no modificat (NYDB) van ser arabitol,trealosa i glucosa, amb petites quantitats de glicerol i eritritol. En experimentsin vitro, el creixement de C. sake en medi amb aw reduïda (0.96) va resultar en unamodificació d'aquestes reserves endògenes i una millora de la viabilitat a baixaowquan es compara amb cèl·lules no modificades. En assaigs de laboratori, lescèl·lules de C. sake modificades van mantenir la seva efectivitat i fins i tot la vanmillorar enfront la podridura causada per P. expansum en mançanes "GoldenDelicious". En assaigs de camp, però, no es van observar millores significatives enel control de la podridura per P. expansum en postcollita de mançanes foradadesartificialment i infectades quan comparem cèl·lules no modificades i cèl·lulestolerants a aw baixes. Immediatament després de l'aplicació de l'antagonista enprecollita, es va observar que les cèl·lules no modificades es van adherir millor a lasuperfície de la poma que no pas les modificades. No obstant, després d'unes horessota condicions de camp, la població de cèl·lules aw-tolerants va augmentarsignificativament, mentre que la població de cèl·lules no modificades va romandreconstant. És possible que els requeriments energètics per a la producció d'elevadesconcentracions de reserves endògenes puguin resultar en una modificació de laconcentració o característiques de la matriu extracel.lular del llevat.Probablementuna millora de l'adherència de les cèl·lules modificades podria donar lloc amillores en l'efectivitat.Així doncs, aquest enfoc es presenta com una via interessant per a poderaconseguir alguns avantatges en la formulació dels antagonistes, intentant fer-losmés tolerants a baixes aw permetent-los-hi així, un establiment més efectiu al camp,conservant l'eficàcia com a agents de biocontrol. En aquest aspecte, l'estudi vademostrar que existeix un gran potencial per a la utilització de mitjansecofisiològics que millorin l'adaptació ecològica dels agents de biocontrol aplicatsal camp. / El desarrollo de resistencia a los fungicidas por parte de muchos patógenos depostcosecha de frutas y vegetales, la falta de substitutos adecuados a losfungicidas, y el creciente interés social sobre los peligros ambientales y de saludque tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo demétodos de control alternativos que sean ambientalmente más favorables. Elcontrol biológico empleando microorganismos ha surgido como una de lasalternativas más prometedoras. La levadura Candida sake (cepa CPA-1), aislada ennuestro laboratorio a partir de manzanas, ha demostrado tener actividad antagónicafrente a los principales patógenos de postcosecha en fruta de pepita. Su aplicaciónen precosecha para el control de las enfermedades presentes en fruta de pepita enpostcosecha sería beneficiosa por varias razones. En primer lugar conseguiríamosuna prevención de infecciones latentes, además se requeriría una menormanipulación de la fruta y disminuiría la posibilidad de daños y heridas durante lostratamientos de postcosecha. Los períodos de tiempo entre la cosecha y laconservación en frío se reducirían y finalmente se evitaría la contaminaciónadicional debida a patógenos fúngicos procedentes de los tratamientos químicos dela fruta en el "drencher". Sin embargo, la aplicación de agentes de biocontrol encampo se ve limitada por la sensibilidad de los microorganismos al estrésambiental, especialmente a la humedad relativa y a la temperatura.Los objetivos del presente estudio han sido, la determinación de la dinámica depoblación microbiana propia de las manzanas "Golden Delicious" a lo largo de lasdiferentes fases de su crecimiento (Capítulo 2), durante la conservación en frío y elperíodo de vida útil o "shelf life", y la evaluación del efecto del tratamiento deC. sake sobre la microflora natural (Capítulo 3) . También se han llevado a caboestudios de la aplicabilidad del agente de biocontrol en precosecha; para ello serealizaron inoculaciones en campo del antagonista con el fin de lograr un controladecuado del agente causal de la principal enfermedad de postcosecha demanzanas, P. expansum (Capítulo 4). Los estudios detallados de la ecofisiología deC. sake han fijado los métodos para mejorar la tolerancia de las células al estrésambiental, su viabilidad y adaptación ecológica (Capítulos 5, 6) y, mediantemanipulación del contenido de azúcares y polialcoholes intracelulares, el aumentode su crecimiento en campo y el mantenimiento del biocontrol de la podredumbrede Pénicillium en el tratamiento en precosecha (Capítulo 7).Se ha encontrado que la población microbiana total varía con el estado dedesarrollo de la fruta y con las condiciones climáticas. La flora predominantedurante el desarrollo de las manzanas fueron los mohos filamentososCladosporium y Alternaria spp. y las levaduras blancas. Sin embargo, los patógenos más importantes en postcosecha, P. expanswn y Botrytis cinérea,raramente fueron aislados de manzanas durante los diferentes estadios dedesarrollo. Por el contrario, la presencia del género Pénicillium llegó a serimportante en las manzanas durante las etapas finales de la conservación en frío yen el período de "shelf life". La población bacteriana fue máxima en el estadio deyema y disminuyó durante el período de desarrollo de las manzanas, aislándoseraramente en el momento de la cosecha y durante la conservación en frío. Laaplicación en precosecha de C. saké a las manzanas dos días antes de surecolección disminuyó significativamente las poblaciones de Cladosporium yPénicillium spp. al final de las condiciones de conservación en frío y durante elperíodo de vida útil ambiental. Sin embargo, la aplicación en precosecha de lalevadura antagonista fue menos efectiva contra la podredumbre de Pénicillium enmanzanas artificialmente heridas e inoculadas que el tratamiento de postcosechacon C. sake. Las poblaciones de C. sake aplicada en precosecha sobre manzanas"Golden Delicious" y con daños artificiales, disminuyen antes y más rápidamenteque cuando el tratamiento es en postcosecha. Por esta razón se necesita unainvestigación adicional que permita entender por qué C. sake presenta una menorsupervivencia cuando la aplicación se realiza en precosecha y posteriorconservación en frío. Para ello, se llevaron a cabo estudios de la ecología yfisiología de C. sake con el fin de determinar el efecto de la actividad de agua (a .),temperatura, pH y su interacción en el crecimiento del microorganismo, y poder asífijar los límites ambientales del antagonista. Se encontró que las condicionesambientales en las cuales este agente de biocontrol crece efectivamente estabanlimitadas por una aw entre 0.90 - 0.92. C. sake fue tolerante a un amplio intervalode pH (3-7), independientemente de la temperatura y de la aw.Los principales polihidroxialcoholes y los azúcares intracelulares acumulados enC. sake crecida en un medio base no modificado (NYDB) fueron el arabitol, latrealosa y la glucosa junto con pequeñas cantidades de glicerol y eritritol. Enexperiencias in vitro la producción de C. sake en un medio con aw reducida (0.96)dio como resultado una modificación significativa de estas reservas endógenas yuna mejora en la viabilidad a baja aw, comparada con células no modificadas. Elbiocontrol de P. expansum en .manzanas "Golden Delicious" se mantuvo con esteinoculo modificado tolerante a baja a , y en algunos casos, incluso fue mejor enensayos de laboratorio. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en elbiocontrol en postcosecha de la podredumbre de P. expansum en manzanasartificialmente heridas e inoculadas en ensayos de campo con células de C. sake« .-tolerantes y no modificadas. Inmediatamente después de la aplicación enprecosecha del antagonista se observó una mejor adherencia a la superficie de lamanzana de las células de levadura no modificadas frente a las del inoculo modificado. No obstante, después de unas pocas horas en condiciones de campolas poblaciones del inoculo aw-tolerantes aumentaron significativamente, mientrasque las poblaciones del tratamiento no modificado permanecieron sin cambios.Estos resultados nos hacen pensar que la energía necesaria para la producción dealtas concentraciones de reservas endógenas pueda producir una modificación dela concentración o características de la matriz extracelular de la levadura.Probablemente una mejora en la adherencia de las células modificadas podríatraducirse en una mayor efectividad.Así pues, algunas de estas ventajas ecológicas deberían ser aprovechadas en laformulación del inoculo tolerante a aw bajas para de esta forma lograr unaestabilidad más efectiva en el campo, conservando su eficacia en el biocontrol.Este aspecto del estudio demostró que el empleo de medios ecofisiológicos paramejorar la adaptación ecológica de los agentes de biocontrol y para su aplicaciónen campo es altamente prometedora, y que ésto podría tener un profundo impactoen el desarrollo de agentes de control biológico efectivos en precosecha. / The development of resistance to fungicides by many postharvest pathogens offruits and vegetables, a lack of adequate fungicide replacements, and growingpublic concern over health and environmental hazards from pesticides, havetogether generated new interest in the development of alternative moreenvironmentally friendly control methods. Biological control usingmicroorganisms has emerged as one of the most promising alternatives. The yeastCandida sake (strain CPA-1), which was isolated from the apple surface in ourlaboratory, has been demonstrated to have antagonistic activity against the majorpostharvest pathogens of pome fruits. Preharvest antagonist application forpostharvest control of pome fruit diseases would be advantageous as latentinfections may be prevented, less fruit manipulation would be required, and itwould decrease the potential for damage and injuries during any postharvesttreatments. The time periods between harvest and cold storage would be reducedand additional contamination by pathogenic fungi from drenching solutions usedduring chemical treatments would be avoided. However, application of biocontrolagents in the field has been limited by sensitivity to environmental stressesincluding a narrow relative humidity and temperature range.The aims of the present study were to determine the microbial population dynamicson Golden Delicious apples during different developmental stages (Chapter 2),during cold storage and the ambient shelf-life period, and evaluate the effect ofC. sake treatment on the resident microflora (Chapter 3). Studies of the practicalpotential of using field inoculation of the antagonist to achieve good control theresponsible agent of the major postharvest disease of apples in Spain, Pénicilliumexpansum, was investigated (Chapter 4). Detailed studies of the ecophysiology ofC. sake identified methods for improving the environmental stress tolerance ofcells, their viability and ecological fitness (Chapters 5, 6); and by manipulation ofintracellular sugar alcohol and sugar content, to enhance growth in the field andconserve biocontrol of Pénicillium rot by field treatment (Chapter 7).Total microbial populations were found to vary with development stage, and withprevailing climatic conditions. The predominant mycoflora on apples duringdevelopment were the filamentous fungi Cladosporium mú Alternaria spp. andwhite yeasts. However, the most important postharvest pathogens/1, expansum andBotrytis cinérea were seldom isolated from ripening apples. On the contrary, thepresence of the Pénicillium genus became important on apples during later coldstorage and ambient shelf-life period. Bacterial populations were maximum at thebud stage and decreased during the development period of apples, isolated at harvest and during cold storage. Preharvest application of C. sake toapples two days before harvest significantly decreased populations ofCladosporium and Pénicillium spp. by the end of cold storage conditions andduring ambient shelf-life period. However, preharvest application of theantagonistic yeast was less effective against Pénicillium rot in artificiallyinoculated and wounded apples than postharvest treatment with C. sake. C, sakepopulations decreased faster after preharvest application than when appliedpostharvest during subsequent cold storage. Further research was thus needed tounderstand the reason for the lower survival of C. sake, when applied preharvestduring subsequent cold storage. Detailed studies were carried out on the ecologyand physiology of C. sake to identify the effect water activity (aw), temperature, pHand their interaction on growth and identify environmental limits of the antagonist.The environmental niche within which this biocontrol agent will effectively growwas found to be limited by about 0.90-0.92 aw. C. sake was tolerant of a wide rangeof pH levels (3-7) regardless of aw and temperature. The major intracellularpolyols/sugars accumulated in C. sake cells grown on unmodified basal medium(NYDB) were arabitol, trehalose and glucose with small amounts of glycerol anderythritol. Production of C. sake in reduced aw media (0.96) resulted in asignificant modification of these endogenous reserves and an improvement inviability at lowered aw when compared to unmodified cells in in vitro experiments.Biocontrol of P. expansum on Golden Delicious apples by these modified low owtolerantinocula was maintained, and in some cases improved in laboratory assays.However, no significant improvements were observed in postharvest biocontrol ofP. expansum rot in apples artificially wounded and infected in field trials with tocompare unmodified and aw-tolerant cells of C. sake. Immediately after preharvestapplication of the antagonist it was notable that unmodified yeast cells adheredbetter to the apple surfaces than the modified inocula. However, after a few hoursunder field conditions populations of the ow-tolerant inocula increasedsignificantly, while those of unmodified treatment populations remainedunchanged. It is also possible that the energy requirements for the production ofhigh concentrations of endogenous reserves could result in a modification of theconcentration or characteristics of the matrix. Some ecological advantages may begained in formulating low-aw tolerant inocula for more effective establishment inthe field, while conserving biocontrol efficacy. This aspect of the studydemonstrated that great potential exists for using ecophysiological means forimproving the ecological fitness of biocontrol agents applied in the field, and thiscould have a profound impact on the development of effective preharvestbiological control agents for use in the field.

Cydia pomonella (L.) es una plaga clave en el cultivo de frutales en gran parte del mundo, principalmente en manzanos. El manejo de esta plaga ha sido una constante en aquellas zonas donde ha representado un problema, ya sea por la severidad de los daños causados o por la necesidad de adoptar estrategias de lucha más racionales que el uso de insecticidas de amplio espectro. Con la implementación de programas de control integrado se han descartado un gran número de insecticidas por diversos motivos, comopor ejemplo su toxicidad, ya sea a mamí­feros o a otros organismos que no son la plaga en sí­. Esto ha permitido la entrada en el mercado de otros insecticidas o técnicas de control que se caracterizan por perfiles eco-toxicológicos más favorables pero también se caracterizan por ser productos que requieren de un conocimiento técnico más exhaustivo para poder ser utilizados con éxito. Generalmente es necesario conocersobre qué estados actúa el insecticida y si posee cierta acción y/o produce efectos subletales sobre los otros estados del insecto que puedan contribuir de forma significativa en el control de la plaga. Uno de los insecticidas de recienteimplementación en el control de carpocapsa ha sido tebufenocida, análogo de la hormona ecdisona, descubierto por Rohm and Haas Company (Philadelphia, PA) y presentado como larvicida especí­fico contra lepidópteros.La finalidad de esta tesis ha sido investigar en algunos parámetros de la actividad biológica de tebufenocida, análogo de la hormona ecdisona, sobre C. pomonella. Para dicho estudio se profundizó en el conocimiento de los efectos letales de tebufenocida en los diferentes estadios de C. pomonella; se estudió una metodologí­a para la evaluación de la susceptibilidad de una determinada población de carpocapsa a tebufenocida; se compará la actividad larvicida de tebufenocida con otros reguladores del crecimiento de insectos; se estudiaron los efectos subletales de tebufenocida en los diferentes estadios de C. pomonella; se determinó el momento de aplicación en campo y el efecto de la utilización de coadyuvantes y volumen de tratamiento en la efectividad de tebufenocida en el control de C. pomonella.En estudios sobre la actividad ovicida de tebufenocida en carpocapsa, se ha obtenidoque la actividad residual de tebufenocida en huevos varía considerablemente dependiendo del substrato en que los huevos han sido puestos. En aplicaciones en laboratorio, la CLso fue de 4,35 ppm en hojas de manzano tratadas con distintasconcentraciones de tebufenocida. No hubo diferencias entre el control y los tratamientos (excepto algunas dosis muy altas) en la mortalidad de los huevos cuando el substrato utilizado fueron manzanas o papel encerado. Tebufenocida fue unas 30 veces más activo cuando los huevos fueron puestos sobre el residuo en hojas, que cuando fueron tratados típicamente. Los huevos puestos sobre manzanas y tratadostípicamente no fueron afectados, y sí lo fueron afectados ligeramente los huevos colocados sobre papel encerado, aunque dependiendo de la edad en que eran tratados.La mortalidad conseguida en estos tratamientos osciló entre el 40 y el 60%, sin que sevieran afectados los huevos que se encontraban cerca de la eclosión. Por lo tanto, sedemuestra la acticidad ovicida de tebufenocida, aunque ésta se ve condicionada por factores como pueden ser el substrato de puesta y si las aplicaciones son típicas o residuales. Aunque no se han investigado las causas que producen estas diferencias en toxicidad entre tipo de aplicación y sobretodo entre substratos, se ha especulado en que son las propias caracterí­sticas fisiológicas de la hoja las que facilitan la penetración delinsecticida a través del corion al interior del huevo, y así­ conseguir afectar al embrión.Tebufenocida fue muy activo cuando las larvas neonatas de carpocapsa fueron alimentadas con manzanas tratadas con este insecticida, donde se obtuvo una LCso de 16,08 ppm. Se obtuvo un ligero daño en la superficie de las manzanas comoconsecuencia de la alimentación de las larvas, incluso en las concentraciones más altasevaluadas. Esto indica que el tiempo transcurrido entre la ingestión del insecticida y laparada de la alimentación de las larvas, como efecto de tebufenocida, es lo suficientecomo para que se produzcan ligeros daños. Cuando se utilizó dieta artificial se obtuvouna LC50 de 0,22 ppm para larvas neonatas, 0,40; 0,29 y 1,47 ppm para segundo, tercery cuarto estadio larvario respectivamente, siendo iguales las rectas Probit en el segundoy tercer estadio larvario. KKS15MKN tiMNKKAI.En cuanto a la actividad por contacto sobre larvas neonatas de carpocapsa. cuando laslarvas fueron expuestas durante una hora sobre hojas de manzano tratadas, la CL50 fuede 499.9 ppm, mucho menor que el valor obtenido cuando actuó por ingestión.También se observaron diferencias en la toxicidad de tcbufcnocida por contacto sobreneonatas dependiendo del substrato. Las CL50 fueron similares cuando se expusieron laslarvas sobre hojas tratadas durante 1 hora (499.9 ppm). que sobre plástico durante 4 horas (348.7 ppm). Estas diferencias pueden ser debidas a variaciones en la humedad, textura, etc. entre los dos substratos, que pueden facilitar que la larva está expuesta u mayores cantidades del insecticida en el caso de la hoja, o también debidas a una ingestión del insecticida cuando la larva realiza mordiscos exploratorios en la hoja.En aplicaciones típicas de tcbufcnocida. a una concentración de 400 ppm, sobre adultosde carpocapsa no se observó ningún efecto en la longevidad de las mariposas que fue entre 6 y 7 dí­as.Tcbufcnocida (RH 5992) fue menos activo que el también anàlogo de la hormona ccdisona RH 2485 cuando larvas neonatas fueron alimentadas con man Amas tratadas, siendo la LC50 de éste último compuesto unas cuatro veces menor que la detcbufcnocida. Fcnoxicarb no tuvo ningún efecto larvicida cuando larvas neonatas se alimentaron con manzanas tratadas con este insecticida a una dosis de 200 ppm. No se comprobó si dichas larvas podí­an desarrollarse y convertirse posteriormente en adultos normales. Diflubcnzurón tampoco tuvo ningún efecto larvicida cuando larvas neonatas se alimentaron con manzanas tratadas con diflubcnzurdn a una dosis de 200 ppm. No se observó nada anormal cuando se realizó la evaluación de la mortalidad larvaria, pero eneste caso tampoco se comprobó si las larvas continuarí­an desarrollándose normalmente.Se estudiaron los efectos sublctalcs de tcbufcnocida sobre huevos, por lo que se evaluóla duración del desarrollo embrionario de los huevos que sobrevivieron a aplicacionestípicas de tebufenocida Se obtuvo un retraso en el desarrollo embrionario que se produjo cuando los tratamientos se realizaron sobre huevos recién puestos (estado blanco) y cuando estaban aproximadamente en la mitad de su desarrollo (anillo rojo), pero no se observó cuando los huevos tratados estaban cerca de su eclosión. Esto indica que tebufenocida afecta en cierta forma el desarrollo embrionario, aunque a partir de cierto punto del desarrollo tebufenocida ya no produce ningún efecto en el embrión. Nose obtuvieron diferencias entre las distintas dosis de tebufenocida aplicadas, auque sí­entre éstas y el control.Se encontró que tebufenocida afecta a la fecundidad y viabilidad de los huevos puestoscuando se aplica típicamente sobre mariposas de carpocapsa. La fecundidad de hembras de carpocapsa fue menor cuando éstas fueron tratadas con tebufenocida a 400 ppm; la fertilidad también fue menor cuando se trataron tanto machos como hembras a la misma dosis con tebufenocida. También la fecundidad y fertilidad fueron menoresque el testigo cuando se trataron mariposas de carpocapsa a dosis iguales o inferiores a200 ppm, aunque en este caso las diferencias no eran estadí­sticamente significativas.Tebufenocida afectó a la fecundidad y fertilidad de adultos de C. pomonella cuandoéstos fueron expuestos durante 24 horas a follaje tratado en campo con tebufenocida a una dosis de 330 g ma/ha, donde los porcentajes de reducción obtenidos en el tratamiento con tebufenocida fueron del 66,8% en la fecundidad y del 73,6% en la fertilidad respecto al testigo.Aunque no se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos, cuando sesuministró tebufocida (0,1 ppm) en dieta a larvas mantenidas en condiciones diapausantes durante 50 dí­as el porcentaje de larvas en diapausa fue del 57%, mientras que en el control fue del 99%. Tampoco se observaron diferencias significativas entre tratamientos en la rotura de la diapausa cuando se cambiaron las condiciones a nodiapausantes.En tratamientos en campo contra la primera generación de carpocapsa, no se obtuvierondiferencias significativas entre las aplicaciones de tebufenocida aplicado como ovicidao como larvicida. La carencia de diferencias entre los distintos momentos de aplicaciónpuede indicar que en aplicaciones tempranas se obtiene el beneficio del control ovicidade tebufenocida, y en aplicaciones tardí­as la ventaja del efecto larvicida. Cuando tebufenocida fue aplicado como ovicida (50 grados dí­a) se obtuvo un 5% de penetraciones profundas en fruto. Cuando fue aplicado como larvicida (139 grados dí­a), se obtuvo un 8% de entradas. Sin embargo cuando la aplicación fue entre estos dosperiodos, el porcentaje de entradas fue del 21%. Esto puede ser debido a que en esta aplicación, tebufenocida actuó típicamente sobre un porcentaje considerable de huevos, y por lo tanto el tratamiento ovicida no fue eficaz, y demasiado pronto para actuar como larvicida.Se obtuvieron diferencias en el porcentaje de mortalidad larvaria entre volúmenes decaldo utilizado en campo, siendo del 64,4% cuando se utilizaron 935 I/ha y del 81,1% cuando se utilizaron 3.741 I/ha. Esto indica la importancia de alcanzar un buen nivel de cobertura en aplicaciones con tebufenocida para obtener un nivel de control alto. En las aplicaciones de tebufenocida en campo, prácticamente no disminuyó el porcentaje de control larvario de este insecticida hasta 24 dí­as después de su aplicación. Por lo tanto, tebufenocida es un insecticida que dispone de una persistencia considerable, mayor que un insecticida como por ejemplo metí­lazinfos. De los cuadyuvantes ensayados, parece ser que Silwet-77 y Latron AG-98 incrementan la persistencia de tebufenocida.