El escaldado superficial es una alteración fisiológica que se manifiesta en manzanas y perasdespués de un periodo de frigoconservación, durante la comercialización de los frutos. Lossíntomas se caracterizan por manchas irregulares en la piel de color marrón más o menososcuro. Pese a no afectar al sabor ni a la textura, esta alteración causa importantes pérdidaseconómicas, ya que en el mercado europeo no se admiten frutos con síntomas de escaldadopara el consumo en fresco. La variedad de manzanas Granny Smith es especialmente sensible,pudiendo llegar a alcanzar incidencias del orden del 100%, tras varios meses defrigoconservación.Para un control efectivo del escaldado superficial es importante conocer el origen bioquímicode la alteración, el cual todavía no ha sido determinado completamente. Se cree que estárelacionado con la oxidación del ct-fanasemo, compuesto volátil de la cutícula de los frutos.Los productos de esta oxidación, comúnmente conocidos como trieno conjugados, podríanalterar las células epidérmicas causando su desorganización y muerte, y por tanto la alteraciónen el color de la piel.Hasta la fecha, el escaldado superficial se ha controlado mediante tratamientos poscosecha condifenilamina o con etoxiquina, siendo ambos antioxidantes muy efectivos para evitar sudesarrollo. Sin embargo, existe una preocupación creciente por el nivel de residuos tóxicos enlos frutos, que ha obligado a buscar nuevos métodos de control. Desde hace unos años se estánensayando otros compuestos menos polémicos, tanto a nivel de legislación como a nivel deconsumidor. Así, los recubrimientos a base de esteres de sacarosa, formulados únicamente coningredientes permitidos en los alimentos, o los antioxidantes asimismo de uso alimentario,tienen una mayor aceptación. Los métodos físicos, consistentes en la modificación de laconcentración gaseosa durante la conservación, también son bien considerados y además estánconsiguiendo resultados muy satisfactorios.El objetivo del presente estudio ha sido ensayar diversos tratamientos, alternativos a lautilización de difenilamina, para el control del escaldado superficial. Asimismo se evaluó elefecto de los tratamientos a nivel fisiológico y cualitativo, para intentar determinar sumecanismo de acción sobre la alteración.Los ensayos se llevaron a cabo con manzanas Granny Smith (Malus domestica Borkh.)recolectadas en Lleida, en campos comerciales. En un estudio de cuatro años, correspondientea cuatro campañas frutícolas, se ensayaron diversos métodos de control para el escaldado,concretamente tratamientos poscosecha durante las dos primeras, y conservación enatmósferas controladas durante las dos últimas. Las manzanas se trataron mediante bañosposcosecha con disoluciones acuosas de difenilamina (DPA); de "Semperfresh" (recubrimientosucroéster) aplicado solo o junto con butilhidroxitolueno, palmitato de ascorbiloy/o galato depropilo o ct-tocoferol; y de CaCl2. Los baños se realizaron inmediatamente después de lacosecha o a las 6 semanas de permanecer los frutos en la cámara frigorífica de atmósferanormal, para evaluar el efecto del momento de aplicación sobre la eficacia del tratamiento. Losfrutos control no se bañaron. En las dos últimas campañas los frutos se recolectaron en dosfechas distintas, para evaluar el efecto del estado de madurez en el momento de la recolecciónsobre la incidencia de alteración. Tras cada cosecha, los frutos se conservaron en cámaras deatmósfera controlada (AC) con distintas condiciones gaseosas: AC estándar, AC con bajooxigeno (LO) y AC con muy bajo oxígeno (ULO). Como control los frutos se conservaron enatmósfera normal. En la cuarta campaña se ensayó la conservación en atmósfera normal, enAC estándar, o en LO, con y sin tratamiento previo de DPA.Las determinaciones analíticas se realizaron después de cada cosecha y después de variosmeses de conservación, durante los 10 días siguientes a la salida de la cámara, considerándoseeste intervalo de tiempo a 20 °C el periodo de vida útil del fruto. En las tres primeras campañasse realizaron las siguientes evaluaciones fisiológicas: producción de etileno, contenido de ácido1-aminociclopropano-l-carboxflico (ACC), actividad de la enzima ACC oxidasa y producciónde CO2 (para la medida de la respiración de los frutos). Como parámetros cualitativos sedeterminaron el peso, la firmeza, la acidez y el contenido en sólidos solubles. La incidencia deescaldado se evaluó visualmente y se determinó un índice de escaldado en base al porcentajede superficie de fruto afectada. En las dos últimas campañas se evaluó también el contenidoen la piel del frutos de a-farnaseno y de compuestos trieno conjugados (CTH).Adicionalmente, en este trabajo se han considerado los resultados obtenidos en el"Departament of Agricultural Botany" de la Universidad de Reading (Reino Unido), donde serealizaron ensayos paralelos a los de Lleida, y fruto de ambos se elaboraron dos publicacionesque se presentan en esta Tesis en el apartado correspondiente a los resultados.El mecanismo de acción de los diversos tratamientos sobre el metabolismo del etileno fuedistinto. El recubrimiento con Semperfresh creó una atmósfera interna en el fruto con unelevado nivel de CO2 que redujo la producción de etileno, reduciendo el contenido de ACC.La adición al recubrimiento de palmitato de ascorbilo bajó el nivel de O2 interno, lo cual pudoafectar a la actividad de la enzima ACC oxidasa. La concentración gaseosa mantenida en lascámaras de AC también afectó a la síntesis de etileno, inhibiéndola. Los baños poscosecha conCaCl2 disminuyeron la producción de etileno pero sin afectar al contenido de ACC ni a laactividad de la ACC oxidasa. El tratamiento con DPA, en cambio, no redujo la producción deetileno después de 4 y 6 meses de frigoconservación, detectándose niveles semejantes a los delcontrol.Los tratamientos que retrasaron el proceso de maduración, al inhibir la producción de etileno,retrasaron también el descenso de los parámetros de calidad durante la conservación en frío,especialmente la firmeza y la acidez. Los frutos recubiertos con Semperfresh presentaronmejores índices de calidad, respecto a los parámetros estudiados, que los tratados con DPAo los frutos control. Asimismo, los frutos conservados en AC estándar o con bajo O2mantuvieron valores de firmeza, acidez y sólidos solubles superiores a los alcanzados enatmósfera normalEl tratamiento con DPA evitó o redujo el desarrollo del escaldado superficial, confirmándosesu eficacia en el control de esta alteración. El recubrimiento con Semperfresh aplicado solo ojunto con un antioxidante de uso alimentario no evitó el desarrollo de escaldado, en lascondiciones del presente estudio. Solamente la aplicación de Semperfresh más palmitato deascorbilo, y también Semperfresh más palmitato de ascorbilo y galato de propilo, ejercieronun limitado control. El tratamiento con CaCl2 fue el más efectivo de los baños poscosecha,exceptuando el DPA. En general, la aplicación de los tratamientos a las 6 semanas de lafrigoconservación fiïe menos eficaz que la aplicación realizada inmediatamente después de lacosecha. Adicionalmente, la interrupción de la frigoconservación para aplicar el tratamiento,modificó los parámetros de calidad de los frutos, reduciendo la firmeza, la acidez y elcontenido en sólidos solubles.La conservación en AC, especialmente con baja concentración de O2, redujo la incidencia deescaldado, a niveles equiparables a los obtenidos con DPA. La menor incidencia de laalteración tuvo una alta correlación positiva con el contenido de CTH determinados alprincipio del periodo de frigoconservación y una alta correlación negativa con los valores defirmeza y acidez, determinados al final de dicho periodo.La susceptibilidad al escaldado superficial varió en función de la fecha de cosecha. Todos lostratamientos ensayados, incluido el DPA, perdieron eficacia en frutos de cosechas tempranas.El comportamiento de esta alteración y la manifestación de sus síntomas es típico de laenfermedad del frío (más conocida como "chilling injury"). La mayor susceptibilidad de losfrutos en estado prematuro, nos ha llevado a considerar que las manzanas de la variedadGranny Smith son sensibles al frío en función de su edad fisiológica, de manera que comomenos avanzado sea su estado de madurez, mayor es la sensibilidad al frío.Palabras clave: Malus domestica, manzanas, Granny Smith, escaldado superficial, fisiologíaposcosecha, etileno, calidad, difenilamina, antioxidantes de uso alimentario, recubrimientos,calcio, frigoconservación, atmósfera controlada, a-farnaseno, compuestos trieno conjugados.

L'estil de vida dels consumidors moderns, conjuntament amb el desig d'adquirir productes naturals i beneficiosos per la salut, ha fet que la producció i consum de fruites mitjançant processat mínim, com és el cas de les fruites tallades, s'hagi vist incrementat en els darrers anys. No obstant, l'obtenció d'aquests productes comporta una sèrie d'operacions que poden desencadenar canvis en la qualitat del producte final. Trobar mètodes que ajudin a reduir aquest deteriorament és un dels principals objectius dels sectors involucrats en la producció i conservació de fruites tallades. En aquest sentit, els recobriments comestibles constitueixen una estratègia potencial per tal de reduir els efectes perjudicials que infligeix el processat mínim en els teixits vegetals de fruites fresques tallades, constituint un camp innovador en l'àrea de la conservació d'aliments frescos.Determinar les condicions òptimes per al processat de poma fresca tallada, així com els mètodes que resultin eficients en la conservació i extensió de la seva vida útil, fou el principal objectiu d'aquesta recerca. En primer lloc, s'establiren les característiques òptimes per al processat de poma Fuji, avaluant l'efecte de diferents tractaments antioxidants en la conservació del color, així com l'estat òptim de maduresa per al seu processat. En segon lloc, s'avaluà la utilització de recobriments comestibles de basepolisacàrida com a mètode alternatiu de conservació, caracteritzant les seves propietats de barrera als gasos i al vapor d'aigua, i la seva habilitat per acomplir la funció de transport d'agents antioxidants i antimicrobians. L'estudi conclogué amb una valoració del període de vida útil dels trossos de poma recoberts, basat en canvis fisiològics, físico-químics, sensorials i microbiològics experimentats per la fruita.L'emprament d'antioxidants d'origen natural, especialment l'ús de N-acetilcisteïna enconcentracions superiors a 0,75% p/v, mostrà una notable eficàcia en la conservació del color de pomes trossejades. Per la seva banda, el processat de les pomes en un estat de maduresa intermedi, amb una fermesa d'aproximadament 67 N, produí els menors canvis degradatius en la fruita. De la mateixa forma, l'ús d'una atmosfera modificada amb concentracions reduïdes d'O2 comportà una notable milloria en la conservació de la qualitat general del trossos de fruita.D'igual forma, els recobriments comestibles elaborats a partir d'alginat i gelà, incorporant oli de girasol, milloraren la permeabilitat al vapor d'aigua en els trossos de fruita de 15,70 i 14,60 s cm-1 a valors de 19,2 i 27,6 s cm-1 respectivament, a més de servir com a suport d'antioxidants. Aquests recobriments van ralentir els processos respiratoris (concentracions d'etilè per sota de 50 µl l-1), mantingueren la textura al voltant de 10 N degut a la presència d'ions de calci i el color per l'ús de N-acetilcisteïna, i disminuïren el creixement microbià, allargant la vida útil dels trossos de poma fins a dues setmanes, període a partir del qual es feu patent la presència d'acetaldèhid i etanol.D'altra banda, la incorporació d'olis essencials amb finalitat antimicrobiana afectàsignificativament a les característiques dels recobriments elaborats a partir de puré de poma i d'una mescla d'alginat i puré de poma. En ambdues pel· lícules, l'oli d'orenga demostrà ser l'antimicrobià més efectiu en el control de E. coli O157:H7, seguit per l'oli de lemongrass i de canyella. El mateix ordre d'efectivitat fou observat quan s'empraren els seus corresponents compostos actius (carvacrol, citral i cinamaldèhid). La permeabilitat al vapor d'aigua de les pel· lícules de puré de poma (7,04±0,63 g-mm/kPa-h-m2) fins i tot es veié lleugerament millorada per la incorporació dels antimicrobians a la formulació, assolint valors de fins a 6,17±0,56 g-mm/kPa-h-m2 per l'ús de 0,1% d'oli d'orenga, encara que la incorporació d'aquests compostos també produí un augment en la seva permeabilitat a l'O2 (22,64±1,28 cm3-µm/m2-d-kPa) observant-se valors tan alts com 38,12±0,80 cm3-µm/m2-d-kPa, sense que les seves propietats mecàniques es veiessin afectades. La presència d'alginat tingué efectes beneficiosos en el recobriment, evidenciant-se una disminució de la permeabilitat a l'O2 de gairebé el 50%. D'altra banda, la incorporació dels antimicrobians en la formulació no causà cap efecte significatiu en les propietats de barrera del recobriment, encara que les propietats mecàniques es veieren lleugerament modificades.Finalment, els agents antimicrobians incorporats en recobriments comestibles d'alginatpuré de poma, inhibiren de forma efectiva el creixement de L. inocua inoculada en trossos de poma, reduint en alguns casos el nombre de colònies fins per sota del límit de detecció (2,0 log CFU/g), així com també el creixement de microorganismes aerobis psicròfils, llevats i floridures durant l'emmagatzematge. Nogensmenys, la seva incorporació en la formulació tingué efectes, en alguns casos perjudicials, sobre la vida útil dels trossos de poma recoberts. La incorporació de vainilla, com a agent antimicrobià, causà els menors efectes adversos en la fruita, mantenint la textura, el color i la qualitat sensorial durant l'emmagatzematge, tot i que el seu efecte com a barrera a la difusió dels gasos fou menor.Contràriament, l'oli de lemongrass, tot i funcionar com a barrera als gasos, tingué un efecte perjudicial en el color i textura dels trossos de poma, amb una repercussió directa sobre la seva qualitat sensorial. Per la seva banda, la incorporació d'oli d'orenga en la formulació tingué conseqüències negatives des del punt de vista sensorial, tot i que el seu efecte en la resta de propietats fou positiu.A partir de total la informació obtinguda en aquest estudi es pot concloure que les pomes Fuji fresques tallades poden conservar-se de forma adequada mitjançant l'ús combinat de substàncies d'origen natural i recobriments comestibles de base polisacàrida, els quals permeten retardar de forma efectiva els processos de pèrdua de qualitat induïts per les operacions de processat. / El estilo de vida de los consumidores modernos unido al deseo de adquirir productos naturales y beneficiosos para la salud ha hecho que la producción y consumo de frutas con proceso mínimo, como es el caso de las frutas cortadas, se haya visto incrementado en los últimos años. Sin embargo, la obtención de estos productos lleva consigo una serie de operaciones que pueden desencadenar cambios en la calidad del producto final. Encontrar métodos que ayuden a frenar este deterioro constituye uno de los principales objetivos de los sectores involucrados en la producción y conservación de frutas cortadas. En este sentido, los recubrimientos comestibles constituyen una estrategia potencial para reducir los efectos perjudiciales que inflige el procesado mínimo en los tejidos vegetales de frutas frescas cortadas, constituyendo un campo innovador en el área de la conservación de alimentos frescos.Determinar las condiciones óptimas para el procesado de manzana fresca cortada, así como métodos que resulten eficientes en la conservación y extensión de su vida útil, constituyeron el objetivo principal de esta investigación. En primer lugar, se establecieron las características óptimas para el procesado de manzana Fuji, evaluando el efecto de distintos tratamientos antioxidantes en la conservación del color, así como el estado óptimo de madurez para su procesamiento. En segundo lugar, se evaluó el empleo de recubrimientos comestibles de base polisacárida como método alternativo de conservación, caracterizando sus propiedades de barrera a los gases y al vapor de agua, y su habilidad para servir como transporte de agentes antioxidantes y antimicrobianos. El estudio concluyó con una valoración del período de vida útil de los trozos de manzana recubiertos, basado en los cambios fisiológicos, físico-químicos, sensoriales y microbiológicos experimentados por la fruta.El empleo de antioxidantes de origen natural, especialmente el uso de N-acetilcisteína en concentraciones superiores a 0,75% p/v, mostró tener una notable eficacia en laconservación del color de manzanas troceadas. Por su parte, el procesamiento de lasmanzanas en un estado de madurez intermedio, con una firmeza de aprox. 67 N, produjo los menores cambios degradativos en la fruta. De la misma forma, el uso de una atmósfera modificada con concentraciones reducidas de O2 conllevó una notable mejoría en la conservación de la calidad general de los trozos de fruta.De igual forma, los recubrimientos comestibles elaborados a partir de alginato y gelanoincorporando aceite de girasol, mejoraron la permeabilidad al vapor de agua en los trozos de fruta de 15,70 y 14,60 s cm-1 a valores de 19,2 y 27,6 s cm-1 respectivamente, además de servir como soporte de antioxidantes. Dichos recubrimientos permitieron ralentizar los procesos respiratorios (concentraciones de etileno por debajo de 50 µl l-1), mantener la textura alrededor de 10 N por la presencia de iones de calcio y el color por el uso de Nacetilcisteína, así como una disminución del crecimiento microbiano, alargando la vida útil de los trozos de manzana hasta dos semanas, período a partir del cual se detectó la presencia de acetaldehído y etanol. Por otro lado, la incorporación de aceites esenciales como agentes antimicrobianos causó un efecto significativo en las características de películas elaboradas a partir de puré de manzana y de una mezcla de alginato-puré de manzana. En ambas películas, el aceite de orégano demostró ser el antimicrobiano más efectivo en el control de E. coli O157:H7, seguido del aceite de hierba de limón y de canela. El mismo orden de efectividad fue observado cuando se emplearon sus correspondientes compuestos activos (carvacrol, citral y cinamaldehído). La permeabilidad al vapor de agua de las películas de puré de manzana (7,04±0,63 g-mm/kPa-h-m2) incluso se vio ligeramente mejorada por la incorporación de los antimicrobianos en la formulación, alcanzando valores de hasta 6,17±0,56 g-mm/kPa-hm2 por el uso de 0,1% de aceite de orégano, aunque la incorporación de estos compuestos también causaron un aumento en su permeabilidad al O2 (22,64±1,28 cm3-µm/m2-d-kPa) observándose valores tan altos como 38,12±0,80 cm3-µm/m2-d-kPa, sin que sus propiedades mecánicas se vieran afectadas. La presencia de alginato produjo efectos beneficiosos en la película, evidenciándose una disminución de la permeabilidad al O2 de casi el 50%. Por otro lado, la incorporación de los antimicrobianos en la formulación de alginato-puré de manzana no causó ningún efecto significativo en las propiedades de barrera de la película, aunque las propiedades mecánicas se vieron ligeramente modificadas.Finalmente, los agentes antimicrobianos incorporados en recubrimientos comestibles dealginato-puré de manzana inhibieron efectivamente el crecimiento de L. inocua inoculada en trozos de manzana, reduciendo en algunos casos el numero de colonias hasta por debajo del límite de detección (2,0 log CFU/g), así como también el crecimiento de microorganismos aerobios psicrófilos, mohos y levaduras durante el almacenamiento. Sin embargo, su incorporación dentro de la formulación causó efectos, en algunos casos perjudiciales, sobre la vida útil de los trozos de manzana recubiertos. La incorporación de vainilla, como agente antimicrobiano, causó los menores efectos adversos en la fruta, manteniendo la textura, el color, y la calidad sensorial durante el almacenamiento, aunque su efecto como barrera a la difusión de los gases fue menor. Por el contrario, el aceite de hierba de limón, aunque funcionó como barrera a los gases, causó un efecto perjudicial en el color y la textura de los trozos de manzana repercutiendo directamente en la calidad sensorial de los trozos de fruta. Por su parte, la incorporación de aceite de orégano en la formulación tuvo consecuencias negativas desde el punto de vista sensorial, aunque su efecto en el resto las propiedades fue bueno.A partir de toda la información obtenida en este estudio se puede concluir que las manzanas Fuji frescas cortadas pueden conservarse de forma adecuada mediante el uso combinado de sustancias de origen natural y recubrimientos comestibles de base polisacárida, los cuales permiten retrasar de manera efectiva los procesos de pérdida de calidad inducidos por las operaciones de procesado.

Es van mostrejar volàtils de pomera i noguer emesos per branques intactes en camp, rodejadesper bosses de plàstic, al matí i al crepuscle en diferents moments de la campanya. Aquestes mostres esvan analitzar per cromatografia de gasos-espectrometria de masses (GC-MS) i cromatografia de gasoselectroantenodetecció(GC-EAD) fent servir antenes de mascles de Cydia pomonella. Es van detectar 44compostos en pomera i 90 en noguer per mitjà de la GC-MS. Les emissions d'ambdues espècies vanvariar clarament, tant quantitativament com qualitativa. Els compostos alifàtics eren majoritaris en lesemissions de pomera, mentre les terpens ho eren a les de noguer. Es va trobar activitat EAD per 5compostos a les mostres de pomera i 10 a les de noguer. Posteriors proves d'electroantenografia (EAG)amb mascles i femelles van revelar una forta activitat EAG per nombrosos volàtils emesos per pomera.En aquests assajos la resposta dels mascles va ser sempre igual o superior a la de les femelles, excepte pelβ-mircè. Entre els compostos actius en les anàlisis de GC-EAD, el butanoat d'hexil era específic depomera, 3 compostos eren específics de noguer (al·loocimè, pinocarvona, i òxid de cariofil·lè) i la restaeren comuns entre ambdues espècies de planta. La 2-ciclopentilciclopentanona, un compost emès per lesbosses de plàstic, també va provocar intenses respostes EAG en antenes d'ambdós sexes.El (E,Z)-2,4-decadienoat d'etil (èster de pera), i el (E)-β-farnesè van ser completament atraientsen camp, però no van estimular contactes amb la font en túnel de vent, suggerint que d'altres estímulssensitius estan relacionats amb el seu funcionament en camp. La preexposició a la feromona sexual,(E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, va disminuir la resposta dels mascles a aquesta en túnel de vent, però vaincrementar la resposta a l'èster de pera; i no va tenir cap efecte sobre les femelles. De forma semblant,les captures en camp amb èster de pera van ser superiors sota confusió sexual. L'èster de pera va actuarcom antagonista de la feromona sexual en barrejar-se a altes quantitats. No obstant, l'antagonisme vadesaparèixer en presentar ambdós compostos en septes separats; i els mascles van ser incapaços dediscriminar entre la feromona sexual sola i la barreja antagonista quan ambdues es van oferir una al costatde l'altra.Assajos d'oviposició i aparellament van demostrar que la temperatura modula el moment del díaen que aquests comportaments tenen lloc. En camp, l'oviposició es va avançar a temperatures baixes; i vaser màxima al 3r i 4t dies de vida. En laboratori, l'oviposició també es va avançar a temperatures mésbaixes, però per la majoria de temperatures assajades, el pic d'oviposició va tenir lloc durant la primerahora de l'escotofase. A 12ºC no hi va haver oviposició, i la fecunditat va ser màxima a 22 i 27ºC. Per undia determinat. L'activitat diària d'aparellament tenia lloc abans que la d'oviposició.Paraules clau: Cydia pomonella, volàtils de planta hoste, comportament, EAG, GC-EAD, GC-MS,Lepidoptera, Tortricidae, preexposició a la feromona, èster de pera, (E)-β-farnesè, vol orientat, feromonasexual, noguer, pomera, variació diària, temperatura, activitat diària, intensitat lumínica. / Se recogieron colecciones de volátiles de manzano y de nogal emitidos por ramas intactas encampo, con hojas y frutos, rodeadas por bolsas de plástico, por la mañana y en el crepúsculo en diferentesmomentos de la campaña. Estas muestras se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometríade masas (GC-MS) y cromatografía de gases-electroantenodetección (GC-EAD) usando antenas demachos de Cydia pomonella. Se detectaron 44 compuestos en manzano y 90 en nogal por GC-MS. Lasemisiones de ambas especies variaron ampliamente, tanto cuantitativa como cualitativamente. Loscompuestos alifáticos fueron mayoritarios en las emisiones de manzano, mientras que los terpenos lofueron en las de nogal. Se observaron variaciones entre periodos tanto para la campaña como para el día.Se encontró actividad EAD para 5 compuestos en las muestras de manzano y 10 en las de nogal.Posteriores pruebas de electroantenografía (EAG) con machos y hembras revelaron una fuerte actividadEAG para múltiples volátiles emitidos por manzano. En estos ensayos la respuesta de los machos fuesiempre igual o superior a la de las hembras, con la excepción del β-mirceno. Entre los compuestosactivos en los análisis de GC-EAD, el butanoato de hexilo fue específico de manzano, 3 compuestosfueron específicos de nogal (aloocimeno, pinocarvona, y óxido de cariofileno) y los restantes erancompartidos por ambas especies de planta. 2-Ciclopentilciclopentanona, un compuesto emitido por lasbolsas de plástico, también provocó intensas respuestas EAG en antenas de ambos sexos.(E,Z)-2,4-Decadienoato de etilo (éster de pera), y (E)-β-farneseno fueron completamenteatrayentes en campo, pero no provocaron contactos con la fuente en túnel de viento, sugiriendo que otrosestímulos sensoriales están relacionados con su funcionamiento en campo. La preexposición a laferomona sexual, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, disminuyó la respuesta a ella de machos en túnel de viento,pero incrementó la respuesta al éster de pera; y no tuvo efecto alguno sobre las hembras. De formasimilar, las capturas en campo con éster de pera fueron superiores en confusión sexual. El éster de peraactuó como antagonista de la feromona sexual al mezclarlo con ésta en cantidades elevadas. No obstante,el antagonismo desapareció cuando ambos compuestos se presentaban en septos separados; y los machosno discriminaron entre la feromona sexual sola y la mezcla antagonista cuando ambas se ofrecieron una allado de la otra.Los ensayos de oviposición y apareamiento demostraron que la temperatura modula el momentodel día en que estos comportamientos tienen lugar. En campo, la oviposición se avanzó a temperaturasmás bajas; y fue máxima en el 3º y 4º días de vida. En laboratorio, la oviposición también se avanzó contemperaturas más bajas, pero para la mayoría de temperaturas ensayadas, el pico de oviposición tuvolugar durante la primera hora de la escotofase. A 12ºC no hubo oviposición, y la fecundidad fue máxima a22 y 27ºC. Para un día determinado. La actividad diaria de apareamiento tenía lugar antes que la deoviposición.Palabras clave: Cydia pomonella, volátiles de planta huésped, comportamiento, EAG, GC-EAD, GCMS,Lepidoptera, Tortricidae, preexposición a la feromona, éster de pera, (E)-β-farneseno, vueloorientado, feromona sexual, nogal, manzano, variación diaria, temperatura, actividad diaria, intensidadlumínica. / Volatile compounds from apple and walnut trees were collected in the field from attachedbranches, bearing leaves and fruits, enclosed in plastic bags in the morning and at dusk, in differentperiods of the season. Collections were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),and gas chromatography-electroantennodetection (GC-EAD) using antennae of male Cydia pomonella.Forty four compounds in apple and 90 in walnut were detected by GC-MS. Emissions of both plantspecies widely differed both qualitatively and quantitatively. Apple emissions were dominated byaliphatic compounds, whereas walnut ones by terpenes. Diel and seasonal variations were found inemissions of both plant species. GC-EAD revealed activity for 5 compounds in apple collections and 10in walnut ones. Further electroantennographic (EAG) analyses with males and females revealed importantEAG-activity for many other volatiles emitted by apple. In these analyses male responses were equal to orhigher than those of female for all compounds, except for β-myrcene. Amongst the EAD-activecompounds in the GC-EAD analyses, hexyl butanoate was apple-specific, 3 compounds were walnutspecific(alloocimene, pinocarrvone, and caryophyllene oxide), and the remaining were shared by bothplant species. 2-Cyclopentylcyclopentanone, a compound emitted by the plastic bags, also elicited strongEAG responses in antennae of both sexes.Ethyl (E,Z)-2,4-decadienoate (pear ester), and (E)-β-farnesene were fully attractive for C.pomonella in field trapping. However, they did not elicit source contacts in wind tunnel, suggesting thatother sensory cues are involved in their field attractiveness. Pre-exposure to the sex pheromone, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol (codlemone), decreased male upwind flight to itself in wind tunnel, but increasedpear ester attractiveness; and had no effect on females. Similarly, trap captures with pear ester were foundto increase under mating disruption. Pear ester acted as a codlemone antagonist when blended at largeamounts. However, this effect disappeared when both compounds were loaded onto different septa; andmales were unable to discriminate amongst codlemone and the antagonistic blend when offered side-byside.Oviposition and mating assays showed that C. pomonella diel oviposition and mating timings aremodulated by temperature. In the field, oviposition activity was advanced by lower temperatures; and wasmaximum in the 3rd and 4th days of life. In the laboratory, oviposition was also advanced by lowertemperatures, but for most of the assayed temperatures it peaked in the first hour of the scotophase.Oviposition did not take place at 12ºC, and fecundity was maximum at 22 and 27ºC. Mating activityoccurred before than oviposition activity in a given day.Keywords: Cydia pomonella, host-plant volatiles, behavior, EAG, GC-EAD, GC-MS, Lepidoptera,Tortricidae, pheromone pre-exposure, pear ester, (E)-β-farnesene, upwind flight, sex pheromone, walnut,apple, diel variation, temperature, diel activity, light intensity.

L'objectiu principal d'aquesta tesi era l'estudi dels mecanismes bioquímics que determinen la resistència de les pomes contra un atac de Penicillium expansum. Els diferents estudis es van centrar en determinar el paper que el peròxid d'hidrogen juga en la resistència, directament o com a inductor d'altres processos també involucrats en la resistència dels fruits, com és la lignificació. Es van estudiar també les possibles relacions entre la capacitat d'enfosquiment enzimàtic del fruit i la resistència. D'altra banda, i amb els objectius de comprovar els resultats obtinguts en fruits sencers i d'establir un model d'interpretació, es va utilitzar un cultiu cel·lular de poma. Tots aquests estudis tenien com finalitat determinar les mecanismes bioquímics claus involucrats en la resistència a P. expansum i proposar un marcador de susceptibilitat en pomes. Els resultats presentats en aquesta tesi demostren la participació del peròxid d'hidrogen en la resistència, ja que s'observava una acumulació d'aquest compost en fruits en resposta a l'atac fúngic. Aquesta acumulació era present en fruits immadurs (fruits resistents), però no en els fruits madurs (fruits sensibles). En fruits sencers, la generació de peròxid d'hidrogen estava determinada per un increment en l'activitat de l'enzim superòxid dismutasa (SOD) i una disminució dels enzims involucrats en la degradació del peròxid d'hidrogen, especialment de la peroxidasa (POX). Els resultats obtinguts en el model in vitro confirmen la intervenció del peròxid d'hidrogen en el procés de resistència segons un model d'interacció de tipus compatible. En aquest model, l'acumulació del peròxid estava principalment determinada per l'acció de l'enzim NADPH oxidasa, mentre que els altres enzims (SOD, CAT i POX) eren secundaris. Quan el cultiu cel·lular de poma s'inoculava amb suspensió aquosa de P. expansum filtrada, el model es comportava com un model d'interacció de tipus incompatible, fet que mostra l'existència d'un inductor hidrosoluble en el patogen que pot promoure l'acumulació de peròxid d'hidrogen. Els resultats obtinguts en fruit sencer, també demostren que el peròxid d'hidrogen actua principalment promovent l'acumulació de lignines en la zona ferida, i que el procés d'enfosquiment enzimàtic no està vinculat a la resistència dels fruits. Els canvis metabòlics descrits amb anterioritat semblen ésser induïts principalment per l'acció de la ferida i no són constitutius. Com a conseqüència, cap d'aquests paràmetres podria ser utilitzat com a marcador de susceptibilitat del fruit a la collita. / El principal objetivo de la presente tesis era el estudio de los mecanismos bioquímicos que determinan la resistencia de las manzanas contra un ataque por Penicillium expansum. Los diversos estudios se centraron en determinar el papel que el peróxido de hidrógeno juega en la resistencia, directamente o como inductor de otros procesos también involucrados en la resistencia de los frutos, como es la lignificación. Se estudiaron también las posibles relaciones entre la capacidad de empardecimiento enzimático del fruto y la resistencia. Por otro lado, y con los objetivos de comprobar los resultados obtenidos en fruto entero y de establecer un modelo de interpretación, se utilizó un cultivo celular de manzana. Todos estos estudios tenían como finalidad determinar los mecanismos bioquímicos clave involucrados en la resistencia a P. expansum y proponer un marcador de susceptibilidad de las manzanas. Los resultados presentados en esta tesis demuestran la participación del peróxido de hidrógeno en la resistencia, ya que se observaba una acumulación de este compuesto en frutos en respuesta al ataque fúngico. Esta acumulación se daba en frutos inmaduros (frutos resistentes), pero no en los frutos maduros (frutos sensibles). En frutos enteros, la generación de peróxido de hidrógeno estaba determinada por un incremento de actividad de la enzima superòxido dismutasa (SOD) y una disminución de las enzimas involucradas en la degradación del peróxido de hidrógeno, especialmente de la peroxidasa (POX). Los resultados obtenidos en el modelo in vitro confirman la intervención del peróxido de hidrógeno en el proceso de resistencia según un modelo de interacción de tipo compatible. En este modelo, la acumulación del peróxido estaba principalmente determinada por la acción de la enzima NADPH oxidasa, mientras que las otras enzimas (SOD, CAT y POX) eran secundarias. Cuando el cultivo celular de manzana se inoculaba con una suspensión acuosa de P. expansum filtrada, el modelo se comportaba como un modelo de interacción de tipo incompatible, hecho que muestra la existencia de un inductor hidrosoluble en el patógeno que puede promover la acumulación de peróxido de hidrógeno. Los resultados obtenidos en fruto entero, también muestran como el peróxido de hidrógeno actúa promoviendo la acumulación de ligninas en la zona dañada y que el proceso de empardecimiento enzimático no está relacionado con la resistencia de los frutos. Los cambios metabólicos descritos anteriormente parecen ser inducidos principalmente por la acción de la herida y no son constitutivos. En consecuencia, ninguno de estos parámetros podría ser utilizado como marcador de susceptibilidad del fruto a la cosecha. / The main objective of this thesis was to study the biochemical mechanisms that determine the resistance of apple in response to an attack by Penicillium expansum. Emphasis was given in determining the role that hydrogen peroxide played in the resistance, directly or in relation to the induction of other processes also involved in fruit resistance, such as lignification. The possible relationship between the enzymatic browning potential of the fruit and resistance was also studied. On the other hand, studies on apple cell suspension were also carried out in order to verify the results obtained in whole fruit and establish an interpretation model. The purposes of all these studies were to determine the key biochemical mechanisms involved in the resistance to P. expansum and to propose a marker of apple susceptibility. As shown in our results, hydrogen peroxide appeared to play an underlying role in resistance, because an accumulation of this compound was observed in response to the fungal attack. This accumulation was detected in immature fruit (resistant fruit) but not in mature fruit (susceptible fruit). In whole fruit, the generation of hydrogen peroxide was mainly determined by the increase of superoxide dismutase enzyme activity (SOD) but also by a decrease of H2O2-scavenging enzymes, especially peroxidase (POX). The results obtained in the in vitro model confirmed the contribution of hydrogen peroxide in the resistance process according to a compatible interaction model. In this model the accumulation of the peroxide was mainly determined by the action of NADPH oxidase enzyme, whereas the other enzymes (SOD, CAT and POX) were secondary. When apple cell suspension was inoculated with the filtered aqueous suspension of P. expansum, the model behaved as an incompatible model, showing the existence of a pathogen-related hydrosoluble elicitor that may also elicits the accumulation of hydrogen peroxide. The results obtained in whole fruit also showed that hydrogen peroxide is mainly involved in defence mechanism through its action on lignin accumulation and that the enzymatic browning process was not linked to fruit resistance. All the parameters involved in apple resistance were not constitutive and appeared to be triggered by the wounding response. In consequence, none of these parameters could be used to predict the fruit susceptibility at harvest.

El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patògens enpostcollita de fruita i vegetals, una manca d'adequats substituts pels fungicides iuna preocupació creixent de la societat respecte als perills sanitaris imediambientals que comporten els pesticides i els seus residus, han generat ungran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius, efectius però mésrespectuosos amb el medi ambient. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes ha sorgit com una de les alternatives més prometedores. La socaCPA-1 del llevat Candida sake, el qual s'ha aïllat de la superfície de,mançanes alnostre laboratori, ha demostrat tenir una bona capacitat antagònica enfront elsprincipals fongs patògens en postcollita de fruita de llavor. L'aplicaciód'antagonistes en precollita per controlar les malalties de la fruita de llavor enpostcollita podria ser un mètode avantatjós ja que podria prevenir infeccionslatents, permetria una menor manipulació de la fruita i disminuiria potencialmentels danys i ferides que es donen durant qualsevol dels tractaments de postcollita.Així mateix, es reduiria el període entre la collita i l'emmagatzemament en fred is'evitaria la contaminació addicional per patògens que suposa el tractament químicde la fruita en el "drencher". No obstant, fins ara l'aplicació d'agents de biocontrolen el camp s'ha vist limitada per la sensibilitat que aquests tenen a l'estrèsmediambiental, ja que els microorganismes tenen uns intervals de creixement moltlimitats tant pel que fa a la temperatura com a la humitat.Els objectius del present estudi han estat la determinació de la dinàmicapoblacional de la microflora natural de les mançanes "Golden Delicious" durantdiferents estadis de desenvolupament (Capítol 2), durant la conservació en fred idurant el període de simulació de la comercialització o "shelf life" de la fruita, iavaluar l'efecte que té el tractament amb C. sake en la microflora pròpia de lesmançanes (Capitol 3). D'altra banda, volia avaluar-se el potencial pràctic de lautilització de l'antagonista al camp per aconseguir un bon control de l'agentcausant de la principal malaltia en postcollita de mançanes, Pénicillium expansum(Capitol 4). Tantmateix, els estudis detallats sobre l'ecofisiologia de C. sake hanpermès identificar mètodes per millorar la tolerància de les cèl·lules a l'estrèsmediambiental, la seva viabilitat i adaptació (Capítols 5 i 6); i, mitjançant lamanipulació del contingut de les reserves endògenes acumulades, millorar elcreixement en el camp i aconseguir un bon nivell de biocontrol de la podriduracausada per Pénicillium mitjançant el tractament a camp (Capítol 6).La població microbiana total va variar segons l'estat de desenvolupament del fruit,així com també amb les condicions climàtiques. La microflora predominant en lesmançanes durant el seu desenvolupament van ser les floridures Cladosporium,Alternaria spp. i els llevats blancs. D'altra banda, les floridures patògenes mésimportants en postcollita, P. expansum i Botrytis cinérea, rarament es van aïllardurant el desenvolupament del fruit. En canvi, la presència del gènere Pénicilliumen les mançanes va esdevenir important durant la seva conservació en fred i durantel període de "shelf life" després de la conservació. La població bacteriana va sermàxima a l'estadi de borró i va disminuir durant el període de desenvolupamentdel fruit, essent rarament aïllades durant la collita i la conservació en fred.L'aplicació de C. sake en mançanes, dos dies abans de la collita, va reduirsignificativament la població de Cladosporium i Pénicillium spp. al final de laconservació en fred i durant el període de simulació de la comercialització. Noobstant, l'aplicació del llevat antagonista en precollita, en mançanes foradades iinoculades artificialment va resultar menys efectiva contra la podridura perP. expansum que el tractament en postcollita amb C. saké. La població del'antagonista aplicada en precollita sobre mançanes "Golden Delicious" i ambdanys artificials, disminueix abans i més ràpidament que quan es tracta enpostcollita. Es fa necessària doncs, més recerca per entendre la raó per la qual esdóna aquesta supervivència més baixa de C. sake quan s'aplica en precollita idesprés s'emmagatzema en fred.Es van dur a terme estudis detallats d'ecologia i fisiologia de C. sake per aidentificar l'efecte de l'activitat d'aigua (ow), temperatura, pH i la seva interaccióen el seu creixement per així identificar els seus límits de creixementmediambientals. Es va trobar que les condicions mediambientals en les que l'agentde biocontrol pot desenvolupar-se estan limitades per una aw mínima entre 0.90 i0.92. C. sake va resultar tolerant a un ampli rang de pH (entre 3 i 7),independentment de l'aw i la temperatura.Els polihidroxialcohols i els sucres que es van acumular en major proporció en lescèl·lules de C. sake crescudes en medi basal no modificat (NYDB) van ser arabitol,trealosa i glucosa, amb petites quantitats de glicerol i eritritol. En experimentsin vitro, el creixement de C. sake en medi amb aw reduïda (0.96) va resultar en unamodificació d'aquestes reserves endògenes i una millora de la viabilitat a baixaowquan es compara amb cèl·lules no modificades. En assaigs de laboratori, lescèl·lules de C. sake modificades van mantenir la seva efectivitat i fins i tot la vanmillorar enfront la podridura causada per P. expansum en mançanes "GoldenDelicious". En assaigs de camp, però, no es van observar millores significatives enel control de la podridura per P. expansum en postcollita de mançanes foradadesartificialment i infectades quan comparem cèl·lules no modificades i cèl·lulestolerants a aw baixes. Immediatament després de l'aplicació de l'antagonista enprecollita, es va observar que les cèl·lules no modificades es van adherir millor a lasuperfície de la poma que no pas les modificades. No obstant, després d'unes horessota condicions de camp, la població de cèl·lules aw-tolerants va augmentarsignificativament, mentre que la població de cèl·lules no modificades va romandreconstant. És possible que els requeriments energètics per a la producció d'elevadesconcentracions de reserves endògenes puguin resultar en una modificació de laconcentració o característiques de la matriu extracel.lular del llevat.Probablementuna millora de l'adherència de les cèl·lules modificades podria donar lloc amillores en l'efectivitat.Així doncs, aquest enfoc es presenta com una via interessant per a poderaconseguir alguns avantatges en la formulació dels antagonistes, intentant fer-losmés tolerants a baixes aw permetent-los-hi així, un establiment més efectiu al camp,conservant l'eficàcia com a agents de biocontrol. En aquest aspecte, l'estudi vademostrar que existeix un gran potencial per a la utilització de mitjansecofisiològics que millorin l'adaptació ecològica dels agents de biocontrol aplicatsal camp. / El desarrollo de resistencia a los fungicidas por parte de muchos patógenos depostcosecha de frutas y vegetales, la falta de substitutos adecuados a losfungicidas, y el creciente interés social sobre los peligros ambientales y de saludque tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo demétodos de control alternativos que sean ambientalmente más favorables. Elcontrol biológico empleando microorganismos ha surgido como una de lasalternativas más prometedoras. La levadura Candida sake (cepa CPA-1), aislada ennuestro laboratorio a partir de manzanas, ha demostrado tener actividad antagónicafrente a los principales patógenos de postcosecha en fruta de pepita. Su aplicaciónen precosecha para el control de las enfermedades presentes en fruta de pepita enpostcosecha sería beneficiosa por varias razones. En primer lugar conseguiríamosuna prevención de infecciones latentes, además se requeriría una menormanipulación de la fruta y disminuiría la posibilidad de daños y heridas durante lostratamientos de postcosecha. Los períodos de tiempo entre la cosecha y laconservación en frío se reducirían y finalmente se evitaría la contaminaciónadicional debida a patógenos fúngicos procedentes de los tratamientos químicos dela fruta en el "drencher". Sin embargo, la aplicación de agentes de biocontrol encampo se ve limitada por la sensibilidad de los microorganismos al estrésambiental, especialmente a la humedad relativa y a la temperatura.Los objetivos del presente estudio han sido, la determinación de la dinámica depoblación microbiana propia de las manzanas "Golden Delicious" a lo largo de lasdiferentes fases de su crecimiento (Capítulo 2), durante la conservación en frío y elperíodo de vida útil o "shelf life", y la evaluación del efecto del tratamiento deC. sake sobre la microflora natural (Capítulo 3) . También se han llevado a caboestudios de la aplicabilidad del agente de biocontrol en precosecha; para ello serealizaron inoculaciones en campo del antagonista con el fin de lograr un controladecuado del agente causal de la principal enfermedad de postcosecha demanzanas, P. expansum (Capítulo 4). Los estudios detallados de la ecofisiología deC. sake han fijado los métodos para mejorar la tolerancia de las células al estrésambiental, su viabilidad y adaptación ecológica (Capítulos 5, 6) y, mediantemanipulación del contenido de azúcares y polialcoholes intracelulares, el aumentode su crecimiento en campo y el mantenimiento del biocontrol de la podredumbrede Pénicillium en el tratamiento en precosecha (Capítulo 7).Se ha encontrado que la población microbiana total varía con el estado dedesarrollo de la fruta y con las condiciones climáticas. La flora predominantedurante el desarrollo de las manzanas fueron los mohos filamentososCladosporium y Alternaria spp. y las levaduras blancas. Sin embargo, los patógenos más importantes en postcosecha, P. expanswn y Botrytis cinérea,raramente fueron aislados de manzanas durante los diferentes estadios dedesarrollo. Por el contrario, la presencia del género Pénicillium llegó a serimportante en las manzanas durante las etapas finales de la conservación en frío yen el período de "shelf life". La población bacteriana fue máxima en el estadio deyema y disminuyó durante el período de desarrollo de las manzanas, aislándoseraramente en el momento de la cosecha y durante la conservación en frío. Laaplicación en precosecha de C. saké a las manzanas dos días antes de surecolección disminuyó significativamente las poblaciones de Cladosporium yPénicillium spp. al final de las condiciones de conservación en frío y durante elperíodo de vida útil ambiental. Sin embargo, la aplicación en precosecha de lalevadura antagonista fue menos efectiva contra la podredumbre de Pénicillium enmanzanas artificialmente heridas e inoculadas que el tratamiento de postcosechacon C. sake. Las poblaciones de C. sake aplicada en precosecha sobre manzanas"Golden Delicious" y con daños artificiales, disminuyen antes y más rápidamenteque cuando el tratamiento es en postcosecha. Por esta razón se necesita unainvestigación adicional que permita entender por qué C. sake presenta una menorsupervivencia cuando la aplicación se realiza en precosecha y posteriorconservación en frío. Para ello, se llevaron a cabo estudios de la ecología yfisiología de C. sake con el fin de determinar el efecto de la actividad de agua (a .),temperatura, pH y su interacción en el crecimiento del microorganismo, y poder asífijar los límites ambientales del antagonista. Se encontró que las condicionesambientales en las cuales este agente de biocontrol crece efectivamente estabanlimitadas por una aw entre 0.90 - 0.92. C. sake fue tolerante a un amplio intervalode pH (3-7), independientemente de la temperatura y de la aw.Los principales polihidroxialcoholes y los azúcares intracelulares acumulados enC. sake crecida en un medio base no modificado (NYDB) fueron el arabitol, latrealosa y la glucosa junto con pequeñas cantidades de glicerol y eritritol. Enexperiencias in vitro la producción de C. sake en un medio con aw reducida (0.96)dio como resultado una modificación significativa de estas reservas endógenas yuna mejora en la viabilidad a baja aw, comparada con células no modificadas. Elbiocontrol de P. expansum en .manzanas "Golden Delicious" se mantuvo con esteinoculo modificado tolerante a baja a , y en algunos casos, incluso fue mejor enensayos de laboratorio. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en elbiocontrol en postcosecha de la podredumbre de P. expansum en manzanasartificialmente heridas e inoculadas en ensayos de campo con células de C. sake« .-tolerantes y no modificadas. Inmediatamente después de la aplicación enprecosecha del antagonista se observó una mejor adherencia a la superficie de lamanzana de las células de levadura no modificadas frente a las del inoculo modificado. No obstante, después de unas pocas horas en condiciones de campolas poblaciones del inoculo aw-tolerantes aumentaron significativamente, mientrasque las poblaciones del tratamiento no modificado permanecieron sin cambios.Estos resultados nos hacen pensar que la energía necesaria para la producción dealtas concentraciones de reservas endógenas pueda producir una modificación dela concentración o características de la matriz extracelular de la levadura.Probablemente una mejora en la adherencia de las células modificadas podríatraducirse en una mayor efectividad.Así pues, algunas de estas ventajas ecológicas deberían ser aprovechadas en laformulación del inoculo tolerante a aw bajas para de esta forma lograr unaestabilidad más efectiva en el campo, conservando su eficacia en el biocontrol.Este aspecto del estudio demostró que el empleo de medios ecofisiológicos paramejorar la adaptación ecológica de los agentes de biocontrol y para su aplicaciónen campo es altamente prometedora, y que ésto podría tener un profundo impactoen el desarrollo de agentes de control biológico efectivos en precosecha. / The development of resistance to fungicides by many postharvest pathogens offruits and vegetables, a lack of adequate fungicide replacements, and growingpublic concern over health and environmental hazards from pesticides, havetogether generated new interest in the development of alternative moreenvironmentally friendly control methods. Biological control usingmicroorganisms has emerged as one of the most promising alternatives. The yeastCandida sake (strain CPA-1), which was isolated from the apple surface in ourlaboratory, has been demonstrated to have antagonistic activity against the majorpostharvest pathogens of pome fruits. Preharvest antagonist application forpostharvest control of pome fruit diseases would be advantageous as latentinfections may be prevented, less fruit manipulation would be required, and itwould decrease the potential for damage and injuries during any postharvesttreatments. The time periods between harvest and cold storage would be reducedand additional contamination by pathogenic fungi from drenching solutions usedduring chemical treatments would be avoided. However, application of biocontrolagents in the field has been limited by sensitivity to environmental stressesincluding a narrow relative humidity and temperature range.The aims of the present study were to determine the microbial population dynamicson Golden Delicious apples during different developmental stages (Chapter 2),during cold storage and the ambient shelf-life period, and evaluate the effect ofC. sake treatment on the resident microflora (Chapter 3). Studies of the practicalpotential of using field inoculation of the antagonist to achieve good control theresponsible agent of the major postharvest disease of apples in Spain, Pénicilliumexpansum, was investigated (Chapter 4). Detailed studies of the ecophysiology ofC. sake identified methods for improving the environmental stress tolerance ofcells, their viability and ecological fitness (Chapters 5, 6); and by manipulation ofintracellular sugar alcohol and sugar content, to enhance growth in the field andconserve biocontrol of Pénicillium rot by field treatment (Chapter 7).Total microbial populations were found to vary with development stage, and withprevailing climatic conditions. The predominant mycoflora on apples duringdevelopment were the filamentous fungi Cladosporium mú Alternaria spp. andwhite yeasts. However, the most important postharvest pathogens/1, expansum andBotrytis cinérea were seldom isolated from ripening apples. On the contrary, thepresence of the Pénicillium genus became important on apples during later coldstorage and ambient shelf-life period. Bacterial populations were maximum at thebud stage and decreased during the development period of apples, isolated at harvest and during cold storage. Preharvest application of C. sake toapples two days before harvest significantly decreased populations ofCladosporium and Pénicillium spp. by the end of cold storage conditions andduring ambient shelf-life period. However, preharvest application of theantagonistic yeast was less effective against Pénicillium rot in artificiallyinoculated and wounded apples than postharvest treatment with C. sake. C, sakepopulations decreased faster after preharvest application than when appliedpostharvest during subsequent cold storage. Further research was thus needed tounderstand the reason for the lower survival of C. sake, when applied preharvestduring subsequent cold storage. Detailed studies were carried out on the ecologyand physiology of C. sake to identify the effect water activity (aw), temperature, pHand their interaction on growth and identify environmental limits of the antagonist.The environmental niche within which this biocontrol agent will effectively growwas found to be limited by about 0.90-0.92 aw. C. sake was tolerant of a wide rangeof pH levels (3-7) regardless of aw and temperature. The major intracellularpolyols/sugars accumulated in C. sake cells grown on unmodified basal medium(NYDB) were arabitol, trehalose and glucose with small amounts of glycerol anderythritol. Production of C. sake in reduced aw media (0.96) resulted in asignificant modification of these endogenous reserves and an improvement inviability at lowered aw when compared to unmodified cells in in vitro experiments.Biocontrol of P. expansum on Golden Delicious apples by these modified low owtolerantinocula was maintained, and in some cases improved in laboratory assays.However, no significant improvements were observed in postharvest biocontrol ofP. expansum rot in apples artificially wounded and infected in field trials with tocompare unmodified and aw-tolerant cells of C. sake. Immediately after preharvestapplication of the antagonist it was notable that unmodified yeast cells adheredbetter to the apple surfaces than the modified inocula. However, after a few hoursunder field conditions populations of the ow-tolerant inocula increasedsignificantly, while those of unmodified treatment populations remainedunchanged. It is also possible that the energy requirements for the production ofhigh concentrations of endogenous reserves could result in a modification of theconcentration or characteristics of the matrix. Some ecological advantages may begained in formulating low-aw tolerant inocula for more effective establishment inthe field, while conserving biocontrol efficacy. This aspect of the studydemonstrated that great potential exists for using ecophysiological means forimproving the ecological fitness of biocontrol agents applied in the field, and thiscould have a profound impact on the development of effective preharvestbiological control agents for use in the field.

Cydia pomonella (L.) es una plaga clave en el cultivo de frutales en gran parte del mundo, principalmente en manzanos. El manejo de esta plaga ha sido una constante en aquellas zonas donde ha representado un problema, ya sea por la severidad de los daños causados o por la necesidad de adoptar estrategias de lucha más racionales que el uso de insecticidas de amplio espectro. Con la implementación de programas de control integrado se han descartado un gran número de insecticidas por diversos motivos, comopor ejemplo su toxicidad, ya sea a mamí­feros o a otros organismos que no son la plaga en sí­. Esto ha permitido la entrada en el mercado de otros insecticidas o técnicas de control que se caracterizan por perfiles eco-toxicológicos más favorables pero también se caracterizan por ser productos que requieren de un conocimiento técnico más exhaustivo para poder ser utilizados con éxito. Generalmente es necesario conocersobre qué estados actúa el insecticida y si posee cierta acción y/o produce efectos subletales sobre los otros estados del insecto que puedan contribuir de forma significativa en el control de la plaga. Uno de los insecticidas de recienteimplementación en el control de carpocapsa ha sido tebufenocida, análogo de la hormona ecdisona, descubierto por Rohm and Haas Company (Philadelphia, PA) y presentado como larvicida especí­fico contra lepidópteros.La finalidad de esta tesis ha sido investigar en algunos parámetros de la actividad biológica de tebufenocida, análogo de la hormona ecdisona, sobre C. pomonella. Para dicho estudio se profundizó en el conocimiento de los efectos letales de tebufenocida en los diferentes estadios de C. pomonella; se estudió una metodologí­a para la evaluación de la susceptibilidad de una determinada población de carpocapsa a tebufenocida; se compará la actividad larvicida de tebufenocida con otros reguladores del crecimiento de insectos; se estudiaron los efectos subletales de tebufenocida en los diferentes estadios de C. pomonella; se determinó el momento de aplicación en campo y el efecto de la utilización de coadyuvantes y volumen de tratamiento en la efectividad de tebufenocida en el control de C. pomonella.En estudios sobre la actividad ovicida de tebufenocida en carpocapsa, se ha obtenidoque la actividad residual de tebufenocida en huevos varía considerablemente dependiendo del substrato en que los huevos han sido puestos. En aplicaciones en laboratorio, la CLso fue de 4,35 ppm en hojas de manzano tratadas con distintasconcentraciones de tebufenocida. No hubo diferencias entre el control y los tratamientos (excepto algunas dosis muy altas) en la mortalidad de los huevos cuando el substrato utilizado fueron manzanas o papel encerado. Tebufenocida fue unas 30 veces más activo cuando los huevos fueron puestos sobre el residuo en hojas, que cuando fueron tratados típicamente. Los huevos puestos sobre manzanas y tratadostípicamente no fueron afectados, y sí lo fueron afectados ligeramente los huevos colocados sobre papel encerado, aunque dependiendo de la edad en que eran tratados.La mortalidad conseguida en estos tratamientos osciló entre el 40 y el 60%, sin que sevieran afectados los huevos que se encontraban cerca de la eclosión. Por lo tanto, sedemuestra la acticidad ovicida de tebufenocida, aunque ésta se ve condicionada por factores como pueden ser el substrato de puesta y si las aplicaciones son típicas o residuales. Aunque no se han investigado las causas que producen estas diferencias en toxicidad entre tipo de aplicación y sobretodo entre substratos, se ha especulado en que son las propias caracterí­sticas fisiológicas de la hoja las que facilitan la penetración delinsecticida a través del corion al interior del huevo, y así­ conseguir afectar al embrión.Tebufenocida fue muy activo cuando las larvas neonatas de carpocapsa fueron alimentadas con manzanas tratadas con este insecticida, donde se obtuvo una LCso de 16,08 ppm. Se obtuvo un ligero daño en la superficie de las manzanas comoconsecuencia de la alimentación de las larvas, incluso en las concentraciones más altasevaluadas. Esto indica que el tiempo transcurrido entre la ingestión del insecticida y laparada de la alimentación de las larvas, como efecto de tebufenocida, es lo suficientecomo para que se produzcan ligeros daños. Cuando se utilizó dieta artificial se obtuvouna LC50 de 0,22 ppm para larvas neonatas, 0,40; 0,29 y 1,47 ppm para segundo, tercery cuarto estadio larvario respectivamente, siendo iguales las rectas Probit en el segundoy tercer estadio larvario. KKS15MKN tiMNKKAI.En cuanto a la actividad por contacto sobre larvas neonatas de carpocapsa. cuando laslarvas fueron expuestas durante una hora sobre hojas de manzano tratadas, la CL50 fuede 499.9 ppm, mucho menor que el valor obtenido cuando actuó por ingestión.También se observaron diferencias en la toxicidad de tcbufcnocida por contacto sobreneonatas dependiendo del substrato. Las CL50 fueron similares cuando se expusieron laslarvas sobre hojas tratadas durante 1 hora (499.9 ppm). que sobre plástico durante 4 horas (348.7 ppm). Estas diferencias pueden ser debidas a variaciones en la humedad, textura, etc. entre los dos substratos, que pueden facilitar que la larva está expuesta u mayores cantidades del insecticida en el caso de la hoja, o también debidas a una ingestión del insecticida cuando la larva realiza mordiscos exploratorios en la hoja.En aplicaciones típicas de tcbufcnocida. a una concentración de 400 ppm, sobre adultosde carpocapsa no se observó ningún efecto en la longevidad de las mariposas que fue entre 6 y 7 dí­as.Tcbufcnocida (RH 5992) fue menos activo que el también anàlogo de la hormona ccdisona RH 2485 cuando larvas neonatas fueron alimentadas con man Amas tratadas, siendo la LC50 de éste último compuesto unas cuatro veces menor que la detcbufcnocida. Fcnoxicarb no tuvo ningún efecto larvicida cuando larvas neonatas se alimentaron con manzanas tratadas con este insecticida a una dosis de 200 ppm. No se comprobó si dichas larvas podí­an desarrollarse y convertirse posteriormente en adultos normales. Diflubcnzurón tampoco tuvo ningún efecto larvicida cuando larvas neonatas se alimentaron con manzanas tratadas con diflubcnzurdn a una dosis de 200 ppm. No se observó nada anormal cuando se realizó la evaluación de la mortalidad larvaria, pero eneste caso tampoco se comprobó si las larvas continuarí­an desarrollándose normalmente.Se estudiaron los efectos sublctalcs de tcbufcnocida sobre huevos, por lo que se evaluóla duración del desarrollo embrionario de los huevos que sobrevivieron a aplicacionestípicas de tebufenocida Se obtuvo un retraso en el desarrollo embrionario que se produjo cuando los tratamientos se realizaron sobre huevos recién puestos (estado blanco) y cuando estaban aproximadamente en la mitad de su desarrollo (anillo rojo), pero no se observó cuando los huevos tratados estaban cerca de su eclosión. Esto indica que tebufenocida afecta en cierta forma el desarrollo embrionario, aunque a partir de cierto punto del desarrollo tebufenocida ya no produce ningún efecto en el embrión. Nose obtuvieron diferencias entre las distintas dosis de tebufenocida aplicadas, auque sí­entre éstas y el control.Se encontró que tebufenocida afecta a la fecundidad y viabilidad de los huevos puestoscuando se aplica típicamente sobre mariposas de carpocapsa. La fecundidad de hembras de carpocapsa fue menor cuando éstas fueron tratadas con tebufenocida a 400 ppm; la fertilidad también fue menor cuando se trataron tanto machos como hembras a la misma dosis con tebufenocida. También la fecundidad y fertilidad fueron menoresque el testigo cuando se trataron mariposas de carpocapsa a dosis iguales o inferiores a200 ppm, aunque en este caso las diferencias no eran estadí­sticamente significativas.Tebufenocida afectó a la fecundidad y fertilidad de adultos de C. pomonella cuandoéstos fueron expuestos durante 24 horas a follaje tratado en campo con tebufenocida a una dosis de 330 g ma/ha, donde los porcentajes de reducción obtenidos en el tratamiento con tebufenocida fueron del 66,8% en la fecundidad y del 73,6% en la fertilidad respecto al testigo.Aunque no se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos, cuando sesuministró tebufocida (0,1 ppm) en dieta a larvas mantenidas en condiciones diapausantes durante 50 dí­as el porcentaje de larvas en diapausa fue del 57%, mientras que en el control fue del 99%. Tampoco se observaron diferencias significativas entre tratamientos en la rotura de la diapausa cuando se cambiaron las condiciones a nodiapausantes.En tratamientos en campo contra la primera generación de carpocapsa, no se obtuvierondiferencias significativas entre las aplicaciones de tebufenocida aplicado como ovicidao como larvicida. La carencia de diferencias entre los distintos momentos de aplicaciónpuede indicar que en aplicaciones tempranas se obtiene el beneficio del control ovicidade tebufenocida, y en aplicaciones tardí­as la ventaja del efecto larvicida. Cuando tebufenocida fue aplicado como ovicida (50 grados dí­a) se obtuvo un 5% de penetraciones profundas en fruto. Cuando fue aplicado como larvicida (139 grados dí­a), se obtuvo un 8% de entradas. Sin embargo cuando la aplicación fue entre estos dosperiodos, el porcentaje de entradas fue del 21%. Esto puede ser debido a que en esta aplicación, tebufenocida actuó típicamente sobre un porcentaje considerable de huevos, y por lo tanto el tratamiento ovicida no fue eficaz, y demasiado pronto para actuar como larvicida.Se obtuvieron diferencias en el porcentaje de mortalidad larvaria entre volúmenes decaldo utilizado en campo, siendo del 64,4% cuando se utilizaron 935 I/ha y del 81,1% cuando se utilizaron 3.741 I/ha. Esto indica la importancia de alcanzar un buen nivel de cobertura en aplicaciones con tebufenocida para obtener un nivel de control alto. En las aplicaciones de tebufenocida en campo, prácticamente no disminuyó el porcentaje de control larvario de este insecticida hasta 24 dí­as después de su aplicación. Por lo tanto, tebufenocida es un insecticida que dispone de una persistencia considerable, mayor que un insecticida como por ejemplo metí­lazinfos. De los cuadyuvantes ensayados, parece ser que Silwet-77 y Latron AG-98 incrementan la persistencia de tebufenocida.