Es konnte gezeigt werden, dass die in Monozyten und in Thrombozyten produzierten Cannabinoide Anandamid und 2-Arachidonylglycerol zur Blutdruckernierdrigung nach akutem Myokradinfarkt der Ratte beitragen. Durch CB1-Rezeptor-Blockade wurde der Abfall des arteriellen Mitteldruckes verhindert, aber die Mortaliät zwei Stunden nach MI erhöht. Dies geschieht möglicherweise durch Beeinträchtigung der endothelialen Funktion. Durch chronische CB1-Rezeptorstimulation konnte bei Ratten mit grossen Infarkten trotz erhöhtem LVEDP der Abfall des linksventrikulären systolischen Drucks und des arteriellen Mitteldrucks vermindert und das Auftreten einer endothelialen Dysfunktion verhindert werden. Bei Ratten mit kleinen Infarkten wurde durch Verabreichung von HU-210 der Herzindex verbessert und der totale periphere Widerstand vermindert. Die linksventrikuläre CB1-Rezeptorexpression war bei Ratten mit grossen Infarkten im Vergleich zu nicht-infarzierten Tieren unverändert. Durch CB1-Rezeptorantagonisierung wurde die maximale Druckentwicklungskapazität weiter vermindert, die Druck-Volumen-Kurve weiter nach rechts verschoben und das Arbeitsvolumen von Ratten mit grossen Infarkten vermindert. / Endogenous Cannabinoids mediate hypotension during experimental myokardial infarction. Blockade of the CB1-receptor lead to a relatively increased MAP, but as well to an increased mortality. This might be caused by an impaired endothelial function. Chronic stimulation of the CB1-receptor lead to an increased LVSP and MAP in rats with large myocardial infarction, in spite of an increased LVEDP. Enothelial dysfunction could be prevented. In rats with small infarcts, HU-210 improved the cardiac index and reduced the TPRI. Left ventricular CB1-receptor- expression was unchanged in rats with large infarcts compared animals without infarction. Antagonism of the CB-1-receptor lead to a further reduced developed pressure in the left ventricle, pressure-volume-relation was shifted to the right and the operating volume in rats with large infarction was reduced.

Phytohormone, insbesondere solche mit östrogenem Potential werden heute vermehrt in der postklimakterischen Hormonersatztherapie als natürliche Alternative zu Designeröstrogenen eingesetzt, da sie vermutlich ein besseres Wirkungs-Nebenwirkungsprofil besitzten. Mengenmäßig am bedeutensten sind die Phytoöstrogene aus den Stoffgruppen der Isoflavone, Cumestane und Indol-3-carbinole. Weit über 100 Pflanzen produzieren Phytohormone. Die bekanntesten sind die Sojabohne, Weintrauben, Leinsamen, Haferflocken, Spargel, Traubensilberkerze und roter Klee. Phytohormone können täglich in großer Menge aufgenommen werden (1mg pro kg Körpergewicht), wobei durchaus Plasmaspiegel von über 1µM erreicht werden. Gerade deshalb darf nicht davon ausgegangen werden, daß natürliche Produkte per se gut für die Gesundheit wären. Phytohormone und insbesondere deren Metaboliten, die während der intestinalen Passage entstehen, wurden vielfach nicht den gleichen Prüfbedingungen unterzogen wie sie für andere in Lebensmitteln vorkommenden Substanzen, wie z.B. Konservierungs-, Farb- oder Aromastoffen, heute selbstverständlich ist. Diese Arbeit soll deshalb anhand von in-vitro Tests an Mauslymphomzellen L5178Y für eine Auswahl an Phytohormonen und deren Metaboliten mögliche toxische oder gentoxische Effekte detektieren und die bestehende Datenlage ergänzen. Aus der Gruppe der Isoflavone wurden die Daidzeinmetaboloiten Equol und O-desmethylangolensin und die Glyceteinmetaboliten 3,4,7- und 4,6,7-Trihyroxyisoflavon untersucht. Aus der Gruppe der Flavone wurde Fisetin und aus der Gruppe der Stilbene Resveratrol untersucht. Weiterhin wurden Daten zu den Anthocyanen Delphinidin-, Pelargonidin- und Cyanidin-Chlorid erhoben. Toxische Effekte wurden anhand von Proliferatiosexperimenten, durch die Bestimmung der Zellvitalität (Ethidiumbromid-Flouresceinmethode) und durch die Analyse der Teilungsaktivität nach Behandlung mit Cytocalasin B und anschließender Bestimmung des Anteils mehrkerniger Zellen detektiert. Zur Bestimmung von gentoxischen Effekte wurde auf den Mikrokerntest zurückgegriffen. Ergänzend sollte eine Immunfloureszenzfärbung der Kinetochorproteine in Mikrokernen Aufschluß über aneugene oder klastogene Wirksamkeit der untersuchten Substanzen geben. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten weisen darauf hin, daß erste adverse Effekte der Phytohormone oder deren Metaboliten im Bereich der erreichbaren Plasmakonzentration liegen, so daß eine übertriebene Aufnahme hochdosierter Phytohormonen derzeit als kritisch erachtet und weiterer Forschungsbedarf festgestellt werden muß. / Phytohormones, particulary those which have oestrogen potential, are nowadays increasingly used in the postclimacteric hormone replacement therapy, as a natural alternative to artificially synthesized oestrogens, since they are thought to have a better effect/side effect profile.Most important in terms of quantity are the phytoestroges which are part of either the isoflavone- coumestane- or indol 3 carbinol-substance group. For more than 100 plants produce phytohormones, the most well-known of which are the soy bean, the grape, linseeds, oat flakes, asparagus and red clover. Phytohormones can be taken up in large quantities each day (1 mg per kg body weight), whereby plasma levels of more than 1 µM can be reached. That is exactely why one can not proceed on the assumption that natural products are per se healthy. In many cases, when phytohormones and especially their metabolites, which are synthesized during the intestinal passage process, are tested, the test conditions, which are used today for the testing of other substances which are contained in food (e.g. preservatives, artificial colourings or flavouring substances), are not applied. This work is intended to detect possible toxic or genotoxic effects of phytohormones and their metabolites on the basis of tests with mouse lymphoma cells. From the isoflavone-group, the daidzein metabolites equol and o-desmethylangolensine, and the glycetein metabolites 3,4,7- and 4,6,7-trihydroxyisoflavone have therefore been examined, as well as fisetin and resveratrol from the substance-group of flavones and stilbenes respectively. This work also provides new data on anthocyanes delphinidin-, pelargonidin- and cyanidin-chloride. Toxic effects were detected o the basis of experimental registration of the proliferation process, by determining the cell vitality (ethidium bromide – flouresceine – method) and by analysis of the separation-activity after the application of cytochalsine B, directely followed by the determination of the proportion of cells with more than one nucleus. The detemination of genotoxic effects was done using the micronucleus-test. Additionally, an immune flourescense couloring of the kinetochore proteins in micronuclei should explain the aneugene or clastogene effectiveness of the substances examined. The data established through this study indicates that primary adverse effects of phytohormones or their metabolites can be detected within reachable plasma concentrations, so that an excessive take-up of phytohormones has to be classified as critical and it also shows, that there is need for further research in this field.

Auf der Suche nach neuen Vitamin D-responsiven Genen wurde die Methodik des Differential Display verwendet. Die eingesetzten Oligonukleotid-Primer waren homolog zur 24-Hydroxylase, einem für den Vitamin D-Stoffwechsel wichtigen Enzym, das von Vitamin D selbst reguliert wird. Mit diesem Ansatz sollten neue Mitglieder aus der Familie der P450-Enzyme gefunden werden. Mehrere differentiell exprimierte DNA-Fragmente wurden in der Folge isoliert und aufgearbeitet, die Sequenzierung eines 550 bp großen Fragments ergab beim Datenbankabgleich keine signifikanten Homologien und ließ daher auf ein noch unbekanntes Gen schließen. Die Klonierung und weitere Charakterisierung dieses Gens wies letztlich in eine nicht erwartete Richtung. Mit der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase war ein Gen aus der Familie der Metallopeptidasen gefunden worden, eine Exopeptidase mit einem Zink-Ion im katalytischen Zentrum. Proteinchemisch schon vor einigen Jahren isoliert, war über die PSA (Puromycin-sensitive Aminopeptidase) bekannt, daß sie N-terminale Aminosäuren hydrolysiert mit einer Spezifität für basisch / neutrales und hydrophobes Substrat und überwiegend im Cytoplasma lokalisiert ist. Namengebend ist die starke Hemmbarkeit der Enzymaktivität durch Puromycin. Vorstehendes summiert die wichtigsten biochemischen Eigenschaften des Enzyms, aus molekularbiologischer Sicht war zum Zeitpunkt der Aufnahme der Arbeiten jedoch noch wenig über die PSA bekannt. Dies hat sich in letzter Zeit geändert, während der Sequenzierarbeiten im Rahmen dieser Arbeit konnte eine schweizer Arbeitsgruppe die Klonierung und Sequenz-Charakterisierung der murinen und später humanen cDNA des Gens veröffentlichen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe wie auch den im Zuge der vorliegenden Dissertation erarbeiteten Resultaten konnte das molekularbiologische Wissen um die PSA erheblich erweitert werden. So liegt mittlerweile die komplette Nukleotid- und Aminosäurensequenz des Gens vor, das Auffinden des Zink-Bindungsmotives HEXXH(X)18E erlaubte die Einordnung des Enzyms in die Familie M1 der Metallopeptidasen, weiterhin konnte das Gen auf dem Chromosom 17q21 lokalisiert werden. Weitere Daten zur Gewebe- und Zellinienexpression sind nun ebenfalls vorhanden, interessant hierbei neben der erwartet starken Expression im Gehirn das deutliche Vorhandensein in Hoden und Nebennierenrinde. Auch in Bezug auf die Regulation der PSA wurden neue Ergebnisse erzielt, wichtigstes Resultat im Rahmen dieser Arbeit ist hier, daß sich die früher festgestellte Vitamin D –Responsivität nicht bestätigen ließ. Für die Zukunft von außerordentlichem Interesse dürfte das kürzlich gelungene Erstellen PSA-defizienter Mäuse sein, das nun erste Beobachtungen von Auswirkungen der Gen-Deletion am lebenden Organismus erlaubt. Trotz alledem sind in Bezug auf die physiologische Rolle der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase weiterhin viele Fragen ungeklärt. Wie hoffentlich in dieser Dissertation herausgearbeitet, ergeben sich dabei interessante Perspektiven für die mögliche Funktion des Enzyms im Organismus. / Searching for new vitamin D responsive genes we employed the differential display-technique. Oligonucleotide-primers used were homologous to the 24-hydroxylase, an enzyme important in vitamin D metabolism and itself regulated by vitamin D. With the above we were hoping to isolate new members of the p450 enzyme family. Several DNA fragments showed differential expression and were subsequently isolated and analysed. Comparing the sequence of one 550 bp fragment with published Genbank sequences resulted in no significant homologies indicating the possibility of an unknown gene. Cloning and characterization of this gene did lead in an unexpected direction. We had found the Puromycin-sensitive aminopeptidase, a member of the family of metallopeptidases and an exopeptidase with a zinc-ion in the catalytical centre. The protein chemistry of this enzyme had been known for several years. The PSA (Puromycin-sensitive aminopeptidase) was known to hydrolyse N-terminal amino acids with specificity for alkaline/neutral as well as hydrophobic substrate. Localized predominantly in the cytoplasm the activity of the enzyme is inhibited by Puromycin. The above summarizes the protein chemistry of the PSA, however, little was known in the beginning about the molecular biology of the gene. This has changed as of late, a Swiss team has recently published the cloning and sequencing of the murine and later the human gene. These published results and data gathered within the scope of this thesis helped to widen our knowledge of the molecular biology of the PSA. The DNA- as well as the amino acid sequence of the gene is now established, since the protein contains the zinc-binding motif HEXXH(X)18E it could be identified as a member of family M1 of metallopeptidases. Furthermore its chromosomal localization could be identified at 17q21. There are also more data about expression in tissues as well as cell lines with the most interesting being the strong expression in testes and adrenal cortex. Regarding the regulation of the gene more results were gathered, the previously found regulation by vitamin D could not be confirmed. The construction of PSA-deficient mice, which has been accomplished recently, promises insight into the consequences of gene-deletion in the living organism. However, in terms of the physiologic role of the Puromycin-sensitive Aminopeptidase, many interesting questions remain unanswered.

In der vorliegenden Studie wurde die Magnetresonanzbildgebung als nichtinvasives diagnostisches Verfahren mit dem herkömmlichen Verfahren der lichtmikroskopischen Untersuchung histologischer Präparate anhand der Gefäßvermessung arteriosklerotisch veränderter Mäuseaorten verglichen. Es war Ziel der Arbeit zu prüfen, ob die nichtinvasive Bildgebung mit getriggerter Aufnahmetechnik zur Unterdrückung von atmungs- und herzschlagbedingten Bewegungsartefakten ebenso verläßliche und akkurate Ergebnisse liefert wie die Histometrie mit dem Mikroskop. Hierzu wurden eine Versuchsgruppe genetisch manipulierter Mäuse (Apolipoprotein-E Knockout) und eine kleinere Kontrollgruppe gesunder Mäuse zunächst magnetresonanztomographisch untersucht. Nach Euthanasierung folgte anschließend die Präparation der Aorta mit dem Herz und benachbarter Strukturen für die histologische Analyse. Anhand der anatomischen Strukturen erfolgte der Vergleich der Schnittbilder, um die korrespondierenden Ebenen in Übereinstimmung zu bringen. Insgesamt wurden 79 MR/histopathologisch korrespondierende Gefäßquerschnitte mit entsprechender Bildanalysesoftware vermessen. Die für die vergleichende Analyse relevanten Meßparameter umfaßten Wandfläche, Gefäßumfang, Wanddicke max. und Wanddicke min.. Die histomorphologischen Auswertungen umfaßten weiterhin Messungen der Plaques und der einzelnen Plaquekomponenten. Die Ergebnisse der Messungen zeigten eine hohe Korrelation zwischen MR-Bildgebung und Histometrie mit durchwegs geringfügig größeren Werten der MR-Messungen, hervorgerufen durch verschiedene Faktoren wie Summationseffekte der MR-Bilder durch größere Schichtdicken, unterschiedliche Meßzeitpunkte (MR-Bilder während der Systolenmitte, diastolischer Zustand der histologischen Präparate) und Gewebeschrumpfung während der einzelnen Schritte der histologischen Präparateherstellung. Die Atmungs- und EKG-getriggerte MR-Methode gewährleistete die Aufnahme von Bildern mit hoher Auflösung frei von Verzerrungs- und Verwischungsartefakten. Aufgrund technischer Limitationen in Auflösung und Kontrast war eine Differenzierung der Plaques und ihrer Zusammensetzung nicht möglich. Die hier dargestellten Ergebnisse stehen mit zahlreichen Berichten in der Literatur in Einklang, in denen ähnliche methodenbedingte Differenzen zwischen MR- und histologischen Meßergebnissen beschrieben sind. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß die MR-Bildgebung das Potential zur Gewebecharakterisierung auch am Gefäßsystem der Maus hat. Zusammenfassend stellt man fest, daß die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die hohe Wertigkeit der MR-Bildgebung als nichtinvasives Verfahren für die kardiovaskuläre Grundlagenforschung bestätigen. Die Anwendung der beschriebenen Methode verspricht interessante neue Einblicke sowohl in die Gefäßbiologie, als auch in die Pathophysiologie der Arteriosklerose. / Genetically engineered mouse models provide enormous potential for investigation of the underlying mechanisms of atherosclerotic disease, but noninvasive imaging methods for analysis of atherosclerosis in mice are currently limited. This study aimed to demonstrate the feasibility of MRI to noninvasively visualize atherosclerotic plaques in the thoracic aorta in mice deficient in apolipoprotein-E, who develop atherosclerotic lesions similar to those observed in humans. To freeze motion, MR data acquisition was both ECG- and respiratory-gated. T1- weighted MR images were acquired with TR/TE ~1000/10 ms. Spatial image resolution was 49 x 98 x 300 µm3. MRI revealed a detailed view of the lumen and the vessel wall of the entire thoracic aorta. Comparison of MRI with corresponding crosssectional histopathology showed excellent agreement of aortic vessel wall area (r = 0.97). Hence, noninvasive MRI should allow new insights into the mechanisms involved in progression and regression of atherosclerotic disease.

Die Dissertation beschreibt, dass die menschliche Gleichgewichtsregulation zur Aufrechterhaltung der Stellung im Raume, zur Regulation der Blickmechanismen, aber auch zur inneren Erzielung eines gleichgewichtes auf komplizierten kybernetischen Regelkreisen beruht. Mit Hilfe eines umpfangreichen neurootometrischen Netzwerkes unter Einschaltung aequilibriometrischer Gleichgewichtsmessungen und audiometrischer Gehörfunktionsmessungen lässt sich nachweisen, dass die Regulationsmuster mindestens im quantitativen Bereich während des gesamten Lebens wechseln. sie sind netzwerkartig miteinander verknüft. Wenn aber dieses System im Alter nicht mehr passend einreguliert ist, empfinden die Patienten zahlreiche Symptome, die wir mit der Vorsilbe Alter (Presby) wie zum Beispiel Altersschwindel, Presbyvertigo, Alterstaumligkeit, Presbytaxie, Altershörstörungen, Presbyakusis, Altersohrgeräusche, Presbytnnitus usw., bezeichnen Aus medizinischer Sicht kommt es unter anderem darauf an, altersbedingte Fehlregulationen rechtzeitig messend zu erfassen, damit diesen durch entsprechende Behandlungen unter Einsatz von Physiotherapie, Psychtherapie, aber auch medikamentöser Therapie begegnet werden kann. / Die Dissertation beschreibt, dass die menschliche Gleichgewichtsregulation zur Aufrechterhaltung der Stellung im Raume, zur Regulation der Blickmechanismen, aber auch zur inneren Erzielung eines gleichgewichtes auf komplizierten kybernetischen Regelkreisen beruht. Mit Hilfe eines umpfangreichen neurootometrischen Netzwerkes unter Einschaltung aequilibriometrischer Gleichgewichtsmessungen und audiometrischer Gehörfunktionsmessungen lässt sich nachweisen, dass die Regulationsmuster mindestens im quantitativen Bereich während des gesamten Lebens wechseln. sie sind netzwerkartig miteinander verknüft. Wenn aber dieses System im Alter nicht mehr passend einreguliert ist, empfinden die Patienten zahlreiche Symptome, die wir mit der Vorsilbe Alter (Presby) wie zum Beispiel Altersschwindel, Presbyvertigo, Alterstaumligkeit, Presbytaxie, Altershörstörungen, Presbyakusis, Altersohrgeräusche, Presbytnnitus usw., bezeichnen Aus medizinischer Sicht kommt es unter anderem darauf an, altersbedingte Fehlregulationen rechtzeitig messend zu erfassen, damit diesen durch entsprechende Behandlungen unter Einsatz von Physiotherapie, Psychtherapie, aber auch medikamentöser Therapie begegnet werden kann.

Das Ausmaß der Proteinbindung eines Arzneistoffs hat Auswirkungen auf eine Vielzahl pharmakokinetischer Parameter wie z.B. das Verteilungsvolumen, die Metabolisierung oder Ausscheidung. Da nur der freie, ungebundene Anteil eines Arzneistoffs durch bio-logische Membranen diffundieren kann, ist dieser direkt für die pharmakologische Wirkung verantwortlich. Lediglich diese ungebundenen und damit frei beweglichen Arzneistoffmoleküle sind also in der Lage, an Rezeptoren zu binden und damit einen Effekt auszulösen. Je größer der ungebundene Anteil eines Arzneistoffs ist, desto größer kann auch der Effekt sein, den er zu bewirken vermag. Wird nun diese freie Konzentration verändert, so kann sich demzufolge die Wirkintensität des Arzneistoffs verändern. Daraus folgt, dass die Kenntnis über die Proteinbindung speziell für die Dosisfindung eines Arzneistoffs unerlässlich ist. Diese Zusammenhänge veranschaulichen, welche Bedeutung das Ausmaß der Proteinbindung eines Arzneistoffs hat. Für die Bestimmung der Proteinbindung existiert eine Vielzahl von Methoden. Neben der klassischen Gleichgewichtsdialyse werden vor allem Ultrafiltrationstechniken angewendet. Neuere Verfahren stellen verschiedenste kapillarelektrophoretische Methoden dar. Allen Verfahren ist gemein, dass es sich um In-vitro-Methoden handelt. Als einzige In-vivo-Methode hat sich die Mikrodialyse etabliert. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Bestimmungsmethode für das Ausmaß der Proteinbindungen stellt eine kontinuierliche Variante der Ultrafiltration dar. Mit Hilfe des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es im möglich, mit einem einzigen Experiment Proteinbindungen über einen großen Bereich verschiedener Arzneistoff-Protein-Verhältnisse zu berechnen. Dadurch wird die Bestimmung schneller und auch kostengünstiger. Zusätzlich wurde dieses Verfahren teilweise automatisiert, d.h. die Versuche werden programmgesteuert durchgeführt und ein manuelles Eingreifen ist nur noch an wenigen Stellen eines Versuches notwendig. Die Messanlage zur kontinuierlichen Ultrafiltration wurde nach dem Vorbild der Anlage von Oehlmann aufgebaut und im Zuge dessen fortentwickelt. Herzstück ist die Messzelle aus Plexiglas. Sie besteht aus einem Ober- und einem Unterteil. In diesem befindet sich eine Vertiefung für die Rührscheibe. Beim Zusammenbau werden zwischen die beiden Teile die Filterunterstützung und eine Ultrafiltrationsmembran gelegt. Die Ultrafiltrationsmembran hält hierbei aufgrund ihrer Trenngrenze die Proteinmoleküle in der Messzelle zurück und lässt nur freie Arzneistoffmoleküle durch. Ein Dichtungsring sorgt dafür, dass die Zelle, nachdem sie in einem Gestell fixiert wurde, nach außen hin dicht abschließt. Während eines Versuches werden abwechselnd Arzneistofflösung und reine Pufferlösung durch die Messzelle gepumpt. Am Auslass der Ultrafiltrationszelle wird die Absorption gemessen, die zu Absorptions-Zeit-Diagrammen führen. Wird nun der gleiche Versuch durchgeführt, nachdem eine Proteinlösung in die Messzelle injiziert wurde, verschiebt sich diese Kurve aufgrund der Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Proteinlösung nach rechts. Die Fläche zwischen diesen beiden Kurven kann als Maß für die Proteinbindung herangezogen werden. Für die Auswertung der Versuche wird aus den Messdaten errechnet, wie viel Arzneistoff sich zu jedem Zeitpunkt des Versuchs in der Messzelle befunden hat und wie viel ungebunden vorlag und damit am Detektor messbar ist. Da die Konzentration an Arzneistoff in der Messzelle im Laufe eines Versuches kontinuierlich gesteigert wird, erhält man Bindungsdaten über einen weiten Bereich von Arzneistoff-Protein-Verhältnissen. In dieser Arbeit wurden sowohl Versuche mit Rinderserumalbumin (BSA) als auch mit humanem Serumalbumin (HSA) durchgeführt. Die Standardabweichungen der bestimmten Proteinbindungswerte steigen mit fallender Proteinbindung. Damit sind sie nach außen hin neutral und ihre Löslichkeit sinkt. Wie die Ergebnisse zeigen, konnte dennoch das Ausmaß der Proteinbindung für eine Reihe von Fluorochinolonen bestimmt werden. Zusätzlich wurden mit dem Oxazolidinon Linezolid und dem Ketolid Telithromycin weitere Antibiotika vermessen. Die Proteinbindungen aller untersuchten Arzneistoffe gegenüber HSA stimmen mit Daten aus der Literatur überein. Wie bereits erwähnt lassen sich hierbei kleine Abweichungen sowohl mit unterschiedlichen Bestimmungsmethoden als auch mit verschiedenen eingesetzten Proteinen erklären. Die Literaturdaten geben meist die Plasmaproteinbindung eines Arzneistoffes wider und die Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden allesamt mit Albumin, sei es vom Mensch oder Rind, durchgeführt. Da jedoch neben dem Albumin auch noch weitere Bestandteile des Plasmas mit den Arzneistoffmolekülen wechselwirken können, sind unterschiedliche Proteinbindungen zu erwarten. / The extent of the protein binding of drugs influences many pharmacokinetic parameters such as the volume of distribution, the metabolism or excretion of a drug. Only the free and unbound fraction of a drug is capable to penetrate biological membranes and as a result, only this fraction is responsible for the pharmacological effect. Just these unbound and therefore mobile drug molecules are able to bind to receptors and cause a certain effect. The larger the free fraction of a drug, the stronger the effect which can be expected. Changes of the concentration of the free drug likely affect the intensity of the pharmacological response. Therefore, the knowledge about the extent of the protein binding is especially important for the finding of the dosage of a drug. All these points demonstrate the importance of the extent of the protein binding for a drug. There are many methods available for the determination of the extent of the protein binding. Besides the classical method of equilibrium dialysis, mainly ultrafiltration techniques are used. Among the new methods are various capillary electrophoretic methods. All methods have in common that they represent in-vitro methods. Only microdialysis has been established as an in-vivo method. Comparing binding data achieved by different methods is difficult because these data often vary a lot. The aim is to develop a method which measures under almost physiological conditions and which allows a fast and easy determination of the protein binding of a drug so that many experiments being carried out with a similar method can be compared. The method for the determination of the extent of the protein binding of drugs developed in this work utilizes continuous ultrafiltration. Using the method described in this work, with one single experiment protein binding data can be calculated over a wide range of drug-protein ratios. Therefore, the determination is faster and even cheaper. Additionally, this method was automated which means that experiments are mostly done by computer and a manual intervention is only necessary at a few points. The measuring system for continuous ultrafiltration is build up according to Oehlmann and was further developed. The heart of the system is the ultrafiltration cell made of acrylic glass. It consists of two parts, a bottom and a top part. The bottom part has a dent for the stirrer. In assembled state, a filter support and an ultrafiltration membrane is put between the two parts. The ultrafiltration membrane keeps the protein molecules inside the ultrafiltration cell due to its molecular weight cut-off. Only unbound drug molecules can pass the membrane. A gasket seals the cell when it is fixed tightly in a frame. During the steps of an experiment, a drug-buffer solution and a pure buffer solution are pumped alternatively through the cell. The absorbance is measured at the outlet side and absorbance-time curves are obtained. Repeating this experiment after injection of protein solution into the cell, gives a curve which is moved to the right due to the interaction between drug and protein. The area between both curves represents the degree of the extent of the protein binding. For evaluation of the data, the amount of drug in the cell and the amount of the detected unbound drug at every single time point is calculated. Since the concentration of the drug in the ultrafiltration cell is continuously increased throughout the experiment, binding data over a wide range of drug/protein ratios are calculated. During this work, measurements using bovine and human serum albumin were performed. Zlotos et al.42 and Oehlmann95 already showed that the determination of drugs with a high extent of the protein binding was easier than the determination of drugs with lower extents of protein binding. The standard deviations of the data increase with decreasing protein binding. Furthermore, the solubility of the drugs should be high enough. The difficulties in the experiments with some fluoroquinolones occur because they are zwitterionic under physiological conditions, thus they are neutral and their solubility is low. However, as the data shows, the extent of the protein binding of some fluoroquinolones could be determined. Additionally, more antibiotics including the new oxazolidinone linezolid and the macrolide telithromycin were determined. The protein binding of all examined drugs measured with HSA was in accordance to literature data. As described earlier, slight differences in the results may result from different methods or different proteins. In literature, mostly the binding towards human plasma is given and the experiments in this work were performed with human or bovine albumin. Apart from albumin, also other molecules of the plasma can interact with drug molecules and can therefore contribute to the whole binding constant. Therefore, different data could be easily expected.

Die lokale Bioverfügbarkeit von osteoinduktiven Wachstumsfaktoren hat einen entscheidenden Einfluss auf das Ausmaß der Knochenbildung. Die Affinität der Proteine zu Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflusst ihre Ortsständigkeit und damit ihre biologische Aktivität am Implantationsort. In der vorliegenden Arbeit wurden BMP-2 und seine gentechnologisch hergestellten Varianten mit verstärkter (T3, T4) und aufgehobener (EHBMP-2) Bindung an die EZM untersucht. Die Wachstumsfaktoren wurden einzeln sowie in Kombination mit EHBMP-2 in Bezug auf die erzielbare Knochenneubildungsrate im heterotopen Implantatlager (Oberschenkelmuskulatur der Ratte) verglichen. Durch den Einsatz der Proteinkombinationen wurde der Frage nachgegangen, inwieweit die Knochenneubildung durch die Mischung einer kaum an die extrazelluläre Matrix bindenden Varianten (EHBMP-2) mit einem „normal“ (BMP-2 Wildtyp) bzw. verstärkt (T3, T4) an die extrazelluläre Matrix bindenden Morphogen verbessert werden kann. Mittels röntgenologischer, biochemischer und histologischer Untersuchungen wurden die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Knochenneubildung analysiert. Bei allen Proteinen bzw. Proteinkombinationen wurde eine direkte Abhängigkeit der Knochenneubildung von den eingesetzten Proteinmengen beobachtet. Bei niedriger Konzentration (2 µg) waren BMP-2 bzw. die Varianten T3 und T4 den Proteinkombinationen mit EHBMP-2 immer überlegen. Bei höherer Dosis (4 µg) waren BMP-2 und T4 den Kombinationen mit EHBMP-2 überlegen. Nur bei T3 in höherer Dosierung konnte ein positiver Effekt einer Kombination mit EHBMP-2 beobachtet werden. / The amount of bone formation depends on the localy available osteoinductive growth factors. The affinity to components of the extracellular matrix influences the local concentration of the proteins and their biological activity at the site of implantation. BMP-2 and its variants with increased (T3, T4) and eliminated binding (EHBMP-2) to the extracellular matrix were investigated. The osteoinductive growth factors were assessed for their osteoinductivity by comparing the single proteins with combinations of EHBMP-2 in a heterotopic, intramuscular site of implantation (hind legs of rats). The variant without affinity to extracellular matrix (EHBMP-2) was combined with a regular- binding morphogen (BMP-2 wildtype) or with the increased- binding morphogens (T3, T4). The rate of bone formation of the different combinations was evaluated. The rate of new bone formation and the amount of newly formed bone were analyzed radiologically, biochemically and histologically. For all proteins and their combinations a dose-depend new bone formation was observed. At low dose (2 µg) no positive effect of the combination with EHBMP-2 could be shown. At high doses (4 µg) a positive effect of the combination with EHBMP-2 could only be demonstrated for T3.

Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren. / Among the environmental cues that influence morphological development in Candida albicans, the ambient pH has a defining role. The morphogenetic programme that is induced by this signal is termed “pH-regulated dimorphism”. In C. albicans the pH-response pathway activates Rim101p, which shows functional homologies to the transcription factors PacC of Aspergillus nidulans and Rim101p of Saccharomyces cerevisiae. Fundamental cell functions, including morphological development as well as cell wall biosynthesis are under the control of C. albicans-Rim101p. Insight into the roles of PHR1, PHR2 and the pH-response in polymorphism was gained through reversion analysis of homozygous phr2D mutants. Analyses of fourteen revertants demonstrated that they had acquired dominant activation mutations in RIM101 leading to premature stop codons. A null mutation of Efg1p was epistatic to the RIM101 mutation and suppressed filamentation but not RIM101 mediated activation of PHR1 expression. Thus, Rim101p effects are mediated both in an Efg1p-dependent and independent manner. We differentiated between RIM101 regions involved in the regulation of polymorphism from those controlling pH-dependent gene expression. We constructed 6 strains containing a carboxy-terminal truncated RIM101 gene by replacing codons 281, 305, 333, 385, 411 and 464 with nonsense codons. The replacement of codons 281, 305 and 333, located within or in proximity to the zinc-finger domain, did not allow growth at pH 4. Replacement of codons 385 and 411 resulted in strains which: (i) grew at pH 4, (ii) expressed the PHR1 gene at pH 4, but in contrast to mutagenesis of codon 464 (iii) were not able to filament at pH 4. These results suggest that the region located between codons 411 and 464 is essential for the Rim101p mediated induction of filamentation in C. albicans. In addition to beeing a regulator of morphological development, which is linked to pathogenesis, Rim101p also plays an important role in cell wall biosynthesis. Understanding the function of Rim101p in C. albicans will provide key insights into how these two fundamental processes are integrated. Besides the switch between growth forms, the secretion of aspartic proteases (SAPs) seems to be one of the important virulence factors in C. albicans. In order to provide an optimum adaption to different host niches, it is likely that various virulence factors are regulated in coordinated fashion by specific host signals. In the final part of this work, we started to investigate a potential role of Rim101p in regulating the expression of a set of SAP-genes. By using the URA3 gene of C. albicans as a reporter of gene expression, we tended to observe consequences of RIM101 mutations on the induction of SAP4, SAP5 and SAP6, which are members of a hypha-specific gene family. Linking the respective regulatory pathways of the known virulence factors might be a crucial step towards a comprehensive view of the pathogenetic process preceding candidiasis in humans.

Postoperatives Erbrechen ist ein häufiges und den Patienten belastendes Problem, insbesondere nach Inhalationsanaesthesien. Anhand von fünf Risikofaktoren, die wir anhand eines ausreichend großen Patientenkollektivs evaluieren und validieren konnten, nämlich niedriges Alter, weibliches Geschlecht, bekannte Übelkeit/bekanntes Erbrechen nach Narkosen und/oder bekannte Reisekrankheit, Nichtraucher-Status und längere Operationsdauer, entwickelten wir einen rasch ablesbaren prädiktiven Scores, um das individuelle Risiko eines erwachsenen Patienten für postoperatives Erbrechen nach Inhalationsanaesthesien zu ermitteln. / Postoperative emesis is a common and subjectively encumering problem, known especially after inhalational anaesthesias. With five risk factors, which we had evaluated and validated in a large collective of patients, namely young age, female gender, known vomiting/emesis and/or known travel-sickness, non- smoker-status and a long duration of the operation, we developed an easy-to-read predictive score to determine the individual risk for a patient to suffer from emesis after inhalational anaesthesias.

Für diese retrospektive Studie wurden die Unterlagen von 490 Patienten, die im Zeitraum von 1990 bis 1999 wegen einer lateralen Mittelgesichtsfraktur in der Universitätsklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke in Würzburg operativ versorgt wurden, erfasst und nach verschiedenen Kriterien statistisch ausgewertet. 77,35% der Patienten waren männlich, 22,65% der Patienten weiblich. Der jüngste Verunfallte, der operativ versorgt wurde, war 4 Jahre, die älteste Patientin 87 Jahre alt. Frauen waren in diesem Krankengut um mehr als acht Jahre älter als die Männer. An erster Stelle der Unfallursachen stehen mit annähernd gleicher Anzahl die Verkehrsunfälle(25,51%) und Roheitsdelikte (24,28%), dicht gefolgt von den Unfällen des täglichen Lebens (22,22%) und den Sportunfällen (20,78%). Berufsunfälle sind mit 7,2% nur gering vertreten. Bei den Verkehrsunfällen stehen die PKW-Unfälle mit 58,43%, bei den Sportunfällen die Verletzungen beim Fußballspiel mit 76,4% im Vordergrund. Die häufigste Verletzung in dem untersuchten Zeitraum war die isolierte Orbitabodenfraktur, die zweithäufigste war die Jochbeinfraktur. An dritter Stelle folgte die Kombination aus Orbitaboden- und Orbitarahmenfraktur. Selten war die isolierte Jochbogenfraktur. Die mittlere Zeit bis zur operativen Versorgung nach einer Verletzung betrug 8,05 Tage, welche sich aber bei Visusbeeinträchtigung verlängerte und bei Alkoholkonsum verkürzte. Der häufigste operative Zugang war der subtarsale Zugang, weitere richtetet sich nach der Verletzung. Für die verwendeten Materialien für die Orbitabodenrekonstruktion zeigte sich eine Verschiebung weg von der konservierten Dura, hin zur konservierten Fascia lata und perforierter PDS-Folie. / A total of 490 patients with lateral midface fracture, treated between 1990 and 1999 in the Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery of the University of Wuerzburg, was retrospectively analysed. 77,35% of these patients were men, 22,65% women. The youngest patient was operated in the age of 4, the oldest in the age of 87. In this study women were on average 8 years older than men. The most common causes of injuries were traffic accidents (25,51%)and violence (24,28%), followed closely by injuries of daily life (22,22%) and sports (20,78%). Work accident-related injuries occured in 7,2%. Car accidents were the most common reason in the group of traffic-related accidents. The majority of sport accidents occured during soccer (76,4%). The most common fractures were isolated orbital floor fractures, followed by fractures of the zygoma. Isolated zygomatic arch fractures were rare. The average time from injury until operative treatment was 8,05 days. The most common approach used for treatment was the midlower eyelid incision. Over the analysed 10-year period the use of conservated dura mater decreased in favour of conservated fascia lata and perforated polydioxanone(PDS)-sheet.