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The phylotypic stage, as part of the embryonic period, is the stage where embryos of different species of a phylum show a high degree of similarity. Johann Friedrich Meckel, Karl Ernst von Baer and Ernst Haeckel already described it for vertebrates in the 19th century. They observed that vertebrate embryos pass through a period of morphological similarity. Since then, scientists have researched the field of the phylotypic stage and it was subject of many controversial discussions. The name “phylotypic stage” was coined by Klaus Sander in 1983 and describes not only the stage of the highest similarity but also the stage, typical (characteristic) for a phylum. The following study examines the phylotypic stage of zebrafish (Danio rerio). Looking at different conserving mechanisms like internal constrains and stabilizing selection, different hypothesis and concepts by several researchers were tested. To test if the phylotypic stage is accessible to selection (although it generally is considered a conserved evolutionary stage) I have studied patterns of variation during embryogenesis. I have looked at the phenotypic variance and the number of significant correlations among embryonic traits and described the phylotypic stage as a period characterized by a high number of internal correlations and declining phenotypic variance. Then, I tested if changes in the raising conditions could elicit phenotypic changes. Therefore, zebrafish embryos have been raised under different experimental conditions to see if developmental plasticity can be induced during the early developmental period and if clearly defined modules can be identified. Eggs of zebrafish were raised in: (1) different temperatures; (2) different salinities; and (3) different levels of oxygen concentration. Up to 14 characters of individual embryos were measured during early development, encompassing the phylotypic stage. In particular I found a considerable degree of heterochrony and modularity. Embryos grew slower at lower temperatures and lower oxygen levels. Plasticity was detected in the overall size of the embryo and the size of somites in the oxygen and temperature experiment. The development of the eye and otic vesicle was shifted to a later x stage under severe hypoxia. Thus, eye and otic vesicle could be identified as modules, which can be dissociated from other characters of the developing embryo (heterochrony). Changes in raising condition affect early development of the zebrafish on three levels: (1) developmental rate (2) size and shape, and (3) dissociation of modules. Thus, plasticity and modularity are effective during early embryonic development. Finally I studied the heritability of embryonic traits to examine how inheritance contributes to the stabilization of the phylotypic stage in variable environments. Following the heritabilities of certain traits reveals that the phylotypic stage is not characterized by a certain pattern of decreased heritability and thus decreased additive genetic variance. The results suggest that the phylotypic stage of zebrafish is constrained by multiple internal correlations when embryos are developing in standard conditions. However, under marginal developmental conditions so far ineffective modules become effective and buffer the embryo against disruptive effects of the environment. Patterns of family resemblance are present, indicating an inherited genetic portion of the phylotypic stage. However, under strong environmental influence it is dominated by variation associated with phenotypic plasticity. My general conclusion is that the phylotypic stage is not established because additive genetic variance is exhausted during the early period of vertebrate development but that it is under environmental and genetic influence, thus is accessible to selection. Internal constraints could be identified to stabilize morphology during the phylotypic stage, but a certain degree of phenotypic variation can be observed. / Das phylotypische Stadium ist das Embryonalstadium, in dem sich die Embryonen eines Phylums sehr ähnlich sind; ähnlicher als in jedem anderen Embryonalstadium. Es wurde in der Embryonalentwicklung der Wirbeltiere bereits von Johann Friedrich Meckel, Karl Ernst von Baer und Ernst Haeckel im 19. Jahrhundert beschrieben und ist seitdem Grundlage kontroverser Diskussionen in der Wissenschaft. Sie beobachteten, dass die Wirbeltierembryonen eine Periode in ihrer Entwicklung durchlaufen, in der sie sich sehr ähnlich sehen. Der Name “Phylotypisches Stadium” wurde 1983 von Klaus Sander geprägt und beschreibt neben dem Stadium mit der größten Ähnlichkeit auch das Embryonalstadium, das für einen Tierstamm (Phylum) typisch ist. Die folgende Studie untersucht das phylotypische Stadium anhand der Embryonen der Zebrabärblinge (Danio rerio). Unterschiedliche Hypothesen für die Ausbildung und Konservierung dieses Stadiums werden aufgrund von empirischen Daten getestet. Zunächst wird der genaue Zeitraum festgelegt, in dem das phylotypische Stadium bei den Zebrabärblingen auftritt. Hierfür wurde die phänotypische Varianz und die Anzahl signifikanter Korrelationen von embryonalen Merkmalen bestimmt. Das phylotypische Stadium bei Zebrabärblingen zeichnet sich als eine Entwicklungsperiode, definiert durch das Auftreten einer größeren Anzahl signifikanter Korrelationen zwischen den einzelnen Merkmalen und einer sich verringernden phänotypischen Varianz, aus. Als nächstes habe ich getestet, ob sich Änderungen in den Aufzuchtsbedingungen auf den Phänotyp auswirken. Die Embryonen wurden unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen aufgezogen, um zu sehen ob in der Embryonalentwicklung Plastizität beobachtet werden kann und ob klar definierte Entwicklungsmodule (Modularität) identifiziert werden können. Dafür wurden die Eier der Zebrabärblinge unterschiedlichen Temperaturen, Salinitäten und Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt. Bis zu 14 embryonale Strukturen wurden an den einzelnen Individuen während der Frühentwicklung (das phylotypische Stadium eingeschlossen) vermessen. Insbesondere konnte Heterochronie und Modularität nachgewiesen werden. Des Weiteren war zu beobachten, dass Embryos bei niedrigeren Temperaturen und bei xii niedrigerer Sauerstoffkonzentration langsamer wuchsen. Merkmale wie die Größe des Embryos und Somitengröße zeigten ein größeres Maß an Plastizität in den Temperatur- und Sauerstoffkonzentrationversuchen. Bei einer reduzierten Sauerstoffkonzentration wurde die Entwicklung der Anlagen für das Auge und die Ohranlage im Vergleich zu anderen embryonalen Merkmalen erst zu einem späteren Zeitpunkt realisiert. Somit konnten Auge und Ohranlage als abgegrenzte Module identifiziert werden, die sich unabhängig von anderen embryonalen Strukturen entwickeln und in ihrer Entwicklungslaufbahn unter bestimmten Bedingungen verschoben werden können. Veränderungen der Aufzuchtsbedingungen beeinflussen die Entwicklung der Embryonen auf drei Ebenen: (1) Entwicklungsgeschwindigkeit, (2) Größe und Gestalt und (3) Verschiebung von Modulen in der Entwicklungslaufbahn (Heterochronie). Daraus folgt, dass Plastizität, Modularität und Heterochronie bereits in der embryonalen Frühentwicklung und somit auch während des phylotypischen Stadiums nachgewiesen werden können. Als letztes wurden die Heritabilitäten von embryonalen Merkmalen untersucht, um zu bestimmen inwieweit Vererbung für die Konservierung des phylotypischen Stadiums, auch unter variierenden Umwelteinflüssen, verantwortlich ist. Die Heritabililtäten einzelner Merkmale ergaben, dass sich das phylotypsche Stadium nicht durch ein spezifisches Muster von sich verringernden Heritabilitäten und somit auch nicht durch verringernder additiver genetischer Varianz beschreiben lässt. Die Gesamtheit der Resultate ergibt, dass das phylotypische Stadium durch entwicklungsbedingte Zusammenhänge einzelner Strukturen unter standardisierten Bedingungen konserviert wird. Jedoch unter grenzwertigen Aufzuchtsbedingungen werden einzelne Module sichtbar und puffern wahrscheinlich die Embryonalentwicklung gegen die Effekte widriger Umwelteinflüsse. Muster von familiären Ähnlichkeiten sind vorhanden und weisen auf einen genetischen Einfluss auf das phylotypische Stadium hin. Allerdings sind unter starken Umwelteinflüssen auch im phylotypischen Stadium Variationen zu finden, die auf Plastizität zurückzuführen sind. Zusammenfassend ist zu sagen, dass während des phylotypischen Stadiums die additive genetische Varianz keines Falls erschöpft ist, sondern dass das phylotypische Stadium unter einem genetischen und umweltbedingten Einfluss steht, und somit auch den xiii selektiven Kräften unterliegt. Interne Zwänge konnten als der Hauptgrund für die Konservierung des phylotypischen Stadiums identifiziert werden, aber ein gewisser Grad an phänotypischer Varianz bleibt erhalten.

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Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine sehr häufig auftretende autoimmune Augenerkrankung bei Pferden, welche meist mit dem Verlust der Sehfähigkeit der betroffenen Augen einhergeht. Da die ERU das einzig spontane Tiermodell für die humane autoimmune Uveitis darstellt, ist die Erforschung der zugrundeliegenden Pathomechanismen der ERU nicht nur veterinärmedizinisch, sondern auch für die Humanmedizin von großer Bedeutung. Charakteristisch für die ERU sind der Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke (BRS) und die Infiltration von autoaggressiven T-Lymphozyten in das innere Auge mit anschließender Zerstörung retinaler Strukturen. Beim Pferd wird die BRS, aufgrund der weitestgehend avaskulären Retina, hauptsächlich von der äußeren Komponente der BRS gebildet, dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Im physiologischen Zustand stellt das RPE durch feste Zell-Zellverbindungen sowohl eine stabile mechanische, als auch durch seine Fähigkeit, mit Mediatoren des Immunsystems kommunizieren und interagieren zu können, eine effektive immunologische Barriere dar. Die im Verlauf der ERU stattfindenden pathophysiologischen Mechanismen, welche für den Zusammenbruch dieser Barriere verantwortlich sind, konnten bislang nicht ausreichend geklärt werden. Vor allem Änderungen im Expressionsmuster des Zelloberflächenproteoms könnten hierbei aufgrund der ständigen Interaktion und Kommunikation der RPE-Zellen mit ihrer Umgebung eine entscheidende Rolle spielen. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit, differentiell regulierte Zelloberflächen-proteine zwischen gesunden und uveitischen RPE-Zellen zu detektieren, welche maßgeblich an der Pathogenese der ERU beteiligt sein könnten. Um so nah wie möglich die am RPE in vivo stattfindenden physiologischen und pathophysiologischen Prozesse widerspiegeln zu können, wurden RPE-Zelloberflächenproteine von gesunden und an ERU erkrankten Pferden in dieser Studie mittels einer neuartigen in situ Biotinylierungsmethode angereichert und anschließend massenspektrometrisch analysiert. Dabei konnten insgesamt 148 Proteine identifiziert werden, von denen 81,8 % Plasmamembranproteine waren, was deutlich für den Erfolg der neuartigen Anreicherungsmethode sprach. Unter den 148 insgesamt identifizierten Proteinen befanden sich 27 differentiell regulierte Proteine, wovon in uveitischem RPE drei hoch- und 24 herunterreguliert waren. Neben den für RPE-Zellen klassischen Proteinen wie RPE65, Rhodopsin und S-Arrestin konnten auch mehrere Proteine detektiert werden, die unseres Wissens zuvor noch nicht in RPE-Zellen beschrieben wurden, wie der Glukosetransporter 4, Synaptotagmin 1 und Peripherin 2. Funktionell besonders interessant fanden wir die vier Proteine Synaptotagmin 1, Basigin, Collectrin und Perpherin 2, welche alle mit einer verminderten Expression in uveitischem RPE zu finden waren. Interessanterweise ergab sich aus einer Pathway-Analyse für alle vier Proteine eine Beteiligung an „Visual Functions“ und „Immunological Diseases“. Mittels weiterführender Analysen wie der Durchflusszytometrie, der Immunhistologie und der Quantifizierung der Protein-Fluoreszenzintensitäten ist es gelungen die bereits massenspektrometrisch identifizierte verminderte Expression von Synaptotagmin 1, Basigin, Collectrin und Perpherin 2 zu verifizieren und die Proteine näher zu charakterisieren. Die in dieser Arbeit präsentierte neuartige in situ Biotinylierungsmethode zur Anreicherung von Oberflächenproteinen, welche anschließend mittels LC-MS/MS identifiziert wurden, erwies sich als sehr effektive und innovative Methode, um Oberflächenproteine so nah wie möglich in ihrem physiologischen und pathophysiologischen in vivo Vorkommen zu untersuchen. Daher liefert der in dieser Arbeit generierte Datensatz der differentiell regulierten Proteine zwischen gesunden und uveitischen RPE-Zellen eine solide Grundlage für weitere funktionelle Analysen zur Aufklärung der Pathogenese der ERU. / Equine recurrent uveitis (ERU) is a highly prevalent autoimmune eye disease in horses, which usually results in blindness of affected eyes. Since ERU is the only spontaneous animal model for human autoimmune uveitis, investigations of underlying pathomechanisms of ERU are not only of high importance for veterinary medicine, but also for human medicine. Characteristic features of ERU are the breakdown of blood-retinal barrier (BRB) and infiltration of autoaggressive T-lymphocytes into the inner eye with subsequent destruction of retinal structures. The BRB of the horse is, due to its widely avascular retina, formed by the outer component of the BRB, the retinal pigment epithelium (RPE). Based on its strong cell-cell connections, the RPE constitutes a solid mechanical barrier and due to its ability to communicate and interact with mediators of the immune system, an effective immunological barrier under physiological conditions, as well. Pathophysiological mechanisms taking place in course of ERU, which are responsible for the breakdown of BRB, were not sufficiently clarified to date. In this context, especially changes of cell surface proteome could play a decisive role due to the continuous communication and interaction of the RPE cells with their environment. Therefore, the goal of this study was to detect differentially expressed cell surface proteins of healthy and uveitic RPE cells, which might crucially contribute to the pathogenesis of ERU. To reflect physiological and pathophysiological processes taking place at the RPE as close as possible to the in vivo situation, cell surface proteins of RPE cells of healthy and ERU diseased horses were captured by a novel in situ biotinylation method and afterwards analyzed by mass spectrometry. Thereby, a total of 148 proteins were identified, of which 81.8 % were plasma membrane proteins, representing the success of this novel enrichment method. 27 of 148 totally identified proteins were differentially expressed. Among these, three proteins were upregulated and 24 proteins were downregulated in uveitic RPE. In addition to proteins typically expressed by RPE cells like RPE65, rhodopsin and S-arrestin, several proteins like glucose transporter 4, synaptotagmin 1 and peripherin 2 were detected, which to our knowledge were not described in RPE cells so far. Of high functional interest to us were four proteins, namely synaptotagmin 1, basigin, collectrin and peripherin 2, which were all downregulated in uveitic RPE cells. Interestingly, a pathway analysis showed involvement of all four proteins in “visual functions” and “immunological diseases”. By performing further analysis such as flow cytometry, immunohistochemistry and quantification of fluorescence intensities, reduced expression of synaptotagmin 1, basigin, collectrin and peripherin 2, which were identified by mass spectrometry, was verified and the proteins were further characterized. In this study, a novel in situ biotinylation method used for cell surface protein enrichment with following identification of these proteins by LC-MS/MS was undertaken. The method proved to be an effective and innovative method to investigate cell surface proteins as closely as possible to their physiological and pathophysiological appearance in vivo. Therefore, the data set of differentially regulated proteins of healthy and uveitic RPE cells, which was generated within the present study, sets a great foundation for further functional analysis for clarifying the pathogenesis of ERU.

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Adulte Weichgewebesarkome (engl. soft tissue sarcoma; STS) werden zu einer Gruppe seltener maligner und teilweise aggressiver Tumoren klassifiziert, die eine Tendenz zur Bildung von hämatogenen Fernmetastasen aufweisen. Die Kombination der Regionalen Hyperthermie mit einer Chemotherapie erwies sich in vorangegangenen Studien als eine vielversprechende Behandlungsoption beim lokalisierten Hochrisiko STS. Es wurde gezeigt, dass eine neoadjuvante Chemotherapie mit Regionaler Hyperthermie bei diesen Sarkomen das Tumoransprechen, das lokale progressionsfreie und das krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu einer alleinigen Chemotherapie signifikant verbessert. Auf zellulärer Ebene induziert ein Hitzeschock (HS) bei klinisch relevanten Temperaturen (41,8°C/43°C) unter anderem eine temporäre Defizienz der Homologen Rekombinationsreparatur (HR), einem essentiellen Mechanismus für die fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB). Dies steht im Zusammenhang mit einer hitzeinduzierten proteosomalen Degradierung von BRCA2, einer unerlässlichen Komponente der HR. Trabectedin (Tr) ist eine antiproliferativ wirksame Substanz, die ursprünglich aus dem marinen Tunikat Ecteinascidia turbinata isoliert wurde. Die vielfältigen zytotoxischen Aktivitäten von Tr umfassen neben dem Interferieren mit der aktivierten Transkription und der Modulation der Tumor-Mikroumgebung hauptsächlich die Induktion von DSBs. Seit 2007 wird Tr in der Zweitlinientherapie zur Behandlung refraktärer STS, sowie bei Patienten eingesetzt, bei denen die Erstlinientherapie (Ifosfamid und/oder Doxorubicin) nicht angewendet werden kann. In Anbetracht der hitzeinduzierten Inaktivierung von BRCA2 und den DNA schädigenden Eigenschaften von Tr wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie die Hyperthermie zu einer Wirkungsverstärkung der zytotoxischen Effekte von Tr beitragen kann. Tr bewirkt in vitro bei Zelllinien unterschiedlicher Sarkomentitäten (U2Os, SW872, SW982) eine dosisabhängige Reduktion des klonogenen Überlebens, das durch einen HS zusätzlich verstärkt wird. Die erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem HS wird als thermale Chemosenitivierung definiert. Zudem konnte durch die Analyse der DNA-Verteilung bei U2Os und SW872 Zellen eine Intensivierung und Verlängerung der Tr-induzierten G2/M-Blockade nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden Zelllinien-spezifische Unterschiede bezüglich einer behandlungsinduzierten Apoptoseinduktion oder Senseszenzantwort identifiziert. SW872 Zellen weisen einen dosis- und temperaturabhängigen Anstieg des Anteiles apoptotischer Zellen auf, der mit einer starken Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7 einhergeht. Dem entgegen gehen U2Os Zellen in eine ausgeprägte behandlungsinduzierte zelluläre Seneszenz über. Anhand der quantitativen Analyse Tr-induzierter H2AX Foci hat sich ein relevanter Anstieg an DSBs durch eine zusätzliche Hitzeexposition herausgestellt, der eine Beeinträchtigung der BRCA2-vermittelten vollständigen Assemblierung der DNA-Reparaturfoci vermuten lässt. Die Hypothese einer thermalen Chemosensitivierung gegenüber Tr durch eine hitzeinduzierte HR-Defizienz – insbesondere im Rahmen der hitzeinduzierten BRCA2 Degradierung – wurde zudem durch das Ausbleiben der hitzebedingten Verstärkung der Tr-induzierten Zytotoxizität bei BRCA2-defizienten Zellen bekräftigt. Darüber hinaus wurde durch Hochdurchsatzanalysen bestätigt, dass eine hitzevermittelte, erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem Knockdown zahlreicher HR-spezifischer Komponenten ausbleibt. Durch Hochdurchsatzanalysen sowie durch anschließende Validierungsexperimente wurden Proteine identifiziert, die sich als relevant für weitere präklinische und klinische Untersuchungen herausgestellt haben. Die Proteine BRCA1, PARP1 und CHEK1 stellen dabei potentielle molekulare Marker für ein Tumoransprechen auf die Kombinationstherapie von Tr und Hyperthermie dar. Deren Inhibition erwies sich zudem als eine weitere Strategie, um die Effektivität der ursprünglichen Behandlung zusätzlich zu erhöhen. Darüber hinaus wurde die Funktion von FANCD2 als prädiktiver Marker und von ERCC1 als Resistenzmarker für das Therapieansprechen einer alleinigen Tr-Behandlung in vitro bestätigt. Die herausgearbeitete thermale Chemosensitivierung gegenüber Tr mit Hyperthermie durch die induzierte HR-Defizienz mittels passagerer BRCA2 Degradierung (induzierte synthetische Letalität) sowie die Identifizierung weiterer Proteine, deren medikamentöse Inhibition die Effektivität der Kombinationsbehandlung zusätzlich erhöhen könnte, eröffnen neue Möglichkeiten in der Therapie solider Tumoren.

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