Zirkadiane Rhythmen haben sich in allen Lebensbereichen aufgrund täglicher Wechselwirkungen zwischen internen Zeitgebern und Umweltreizen entwickelt. Molekulare Oszillatoren bestehen aus einer Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleife (TTFL), die selbsterregte Rhythmen ermöglicht. Eine verzögerte negative Rückkopplungsschleife ist zentral für dieses genregulatorische Netzwerk. Die Theorie sagt voraus, dass selbsterregte Oszillationen robuste Verzögerungen und Nichtlinearitäten (Ultrasensitivität) erfordern. Wir untersuchen die zirkadianen Rhythmen in dem filamentösen Pilz Neurospora crassa, um die zugrundeliegenden Uhrmechanismen zu studieren. Seine TTFL umfasst den aktivierenden White Collar Complex (WCC) und den hemmenden FFCKomplex, der aus FRQ (Frequency), FRH (FRQ-interacting RNA Helicase) und CK1a (Caseinkinase 1a) besteht. Darüber hinaus gibt es mehrere Phosphorylierungsstellen auf FRQ (~100) und WCC (~ 95). FRQ wird durch CK1a phosphoryliert. Während wir die zeitliche Dynamik dieser Proteine erforschen, untersuchen wir: 1) wie multiple, langsame und zufällige Phosphorylierungen die Verzögerung und Nichtlinearität in der negativen Rückkopplungsschleife bestimmen. 2) wie Grenzzyklus-Oszillationen entstehen und wie molekulare Schalter selbsterregte Rhythmen unterstützen. In der ersten Veröffentlichung simulieren wir FRQ-Multisite-Phosphorylierungen mit Hilfe gewöhnlicher Differentialgleichungen. Das Modell zeigt zeitliche und stationäre Schalter für die freie Kinase und das phosphorylierte Protein. In der zweiten Veröffentlichung haben wir ein mathematisches Modell von 10 Variablen mit 26 Parametern entwickelt. Unser Modell offenbarte einen Wechsel zwischen WC1-induzierter Transkription und FFC-unterstützter Inaktivierung von WC1. Zusammenfassend wurde die Kernuhr von Neurospora untersucht und dabei die Mechanismen, die den molekularen Schaltern zugrunde liegen, aufgedeckt. / Circadian rhythms have evolved across the kingdoms of life due to daily interactions between internal timing and environmental cues. Molecular oscillators consist of a transcription-translation feedback loop (TTFL) allowing self-sustained rhythms. A delayed negative feedback loop is central to this gene regulatory network. Theory predicts that self-sustained oscillations require robust delays and nonlinearities (ultrasensitivity). We study the circadian rhythms in the filamentous fungi Neurospora crassa to investigate the underlying clock mechanisms. Its TTFL includes the activator White Collar Complex (WCC) (heterodimer of WC1 and WC2) and the inhibitory FFC complex, which is made of FRQ (Frequency protein), FRH (Frequency interacting RNA Helicase) and CK1a (Casein kinase 1a). Moreover, there are multiple phosphorylation sites on FRQ (~ 100) and WCC (~ 95). FRQ is phosphorylated by CK1a. While exploring the temporal dynamics of these proteins, we investigate: 1) how multiple, slow and random phosphorylations govern delay and nonlinearity in the negative feedback loop. 2) how limit cycle oscillations arise and how molecular switches support selfsustained rhythms. In the first publication, we simulate FRQ multisite phosphorylations using ordinary differential equations. The model shows temporal and steady state switches for the free kinase and the phosphorylated protein. In the second publication, we developed a mathematical model of 10 variables with 26 parameters consisting of WC1 and FFC elements in nuclear and cytoplasmic compartments. Control and bifurcation analysis showed that the model produces robust oscillations. Our model revealed a switch between WC1-induced transcription and FFC-assisted inactivation of WC1. Using this model, we also studied possible mechanisms of glucose compensation. In summary, the core clock of Neurospora was examined and mechanisms underlying molecular switches were revealed.

Zirkadiane Uhren sind Zell-autonome Oszillatoren. Aus diesem Grund ist deren interzelluläre Kopplung essentiell, um die Synchronität zirkadianer Oszillatornetzwerke zu erhalten und die Störung zirkadianer Gewebsfunktionen zu verhindern. Neuronale Oszillatoren des Nucleus suprachiasmaticus (SCN), der Schrittmacher-Uhr im Zentralnervensystem der Säugetiere, koppeln interzellulär und über den Austausch sekretierter Neurotransmitter. Die Fähigkeit zirkadianen Oszillatoren peripherer Gewebe interzellulär zu koppeln ist hingegen stark umstritten und molekulare Mechanismen sind unbekannt. In dieser Dissertation zeigen wir, dass periphere Oszillatoren in der Tat interzellulär über den Austausch sekretierter Signalmoleküle koppeln und identifizieren TGF-b als peripheren Kopplungsfaktor. Weiterhin zeigen wir, dass TGF-b die cAMP Enhancer-Motiv abhängige, als auch Immediate Early Expression des Uhr-Gens PER2 induziert und folglich die Phasenanpassung molekularer zirkadianer Oszillationen reguliert. Genetische und pharmakologische Störeinflüsse verursachen die Dysregulation des TGF-b Signalweges und begünstigen die Desynchronisierung zellulärer Oszillatoren, welche sich in Amplitudenreduktion und verstärkter Sensitivität gegenüber Zeitgeber-Signalen äußert. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse, legen einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus intrazellulärer Kopplung peripherer zirkadianer Oszillatoren dar und eröffnen neue Perspektiven auf die Bedeutung der Synchronität peripher zirkadianer Uhren für rhythmische Organfunktionen und zirkadiane Gesundheit. / Circadian clocks are cell-autonomous oscillators. Intercellular coupling is crucial to prevent desynchronization of oscillator networks and thus, the disruption of circadian tissue functions. While neuronal oscillators within the mammalian central clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN), couple intercellularly via the exchange of secreted neurotransmitters, intercellular coupling among peripheral oscillators is highly debated and molecular mechanisms are unknown. Here, we show that peripheral circadian oscillators couple intercellularly via exchange of secreted signaling molecules and identify TGF-ß as peripheral coupling factor. TGF-ß signaling induces the cAMP response element dependent, immediate-early expression of the clock gene PER2, thereby phase-adjusting the molecular circadian oscillator. Genetic or pharmacologic disruption of TGF-ß signaling causes desynchronization of cellular oscillators resulting in amplitude reduction and increased sensitivity towards Zeitgeber cues. Our findings reveal a previously unknown mechanism of peripheral coupling and open new perspectives on the importance of peripheral clock synchrony for rhythmic organ functions and circadian health.