Paclitaxel (PTX) is one of the leading drugs against breast and ovarian cancer. Due to its low solubility, treatment of the patients with this drug requires a very well-suited combination with a soluble pharmaceutical excipient to increase the bioavailability and reduce the strong side ef-fects. One efficient way to achieve this in the future could be the incorporation of PTX into pol-ymeric micelles composed of poly(2-oxazoline) based triblock copolymers (POL) which ena-bles PTX loadings of up to 50 wt.%. However, structural information at an atomic level and thus the knowledge of interaction sites within these promising but complex PTX-POL formula-tions were not yet available. Such results could support the future development of improved excipients for PTX and suitable excipients for other pharmaceutical drugs. Therefore, a solid-state MAS NMR investigation of these amorphous formulations with different POL-PTX com-positions was performed in this thesis as this gives insights of the local structure at an atomic level in its solid state. NMR in solution showed very broad 13C signals of PTX for this system due to the reduced mobility of the incorporated drug which exclude this as an analytical meth-od. In a first study, crystalline PTX was structurally characterized by solid-state NMR as no com-plete 13C spectrum assignment and no 1H NMR data existed for the solid state. In addition, the asymmetric unit of the PTX crystal structure consists of two molecules (Z'=2) that can only be investigated in its solid state. As crystalline PTX in total has about 100 different 13C and 1H chemical shifts with very small differences due to Z’=2, and furthermore, its unit cell consisting of more than 900 atoms, accompanying GIPAW (CASTEP) calculations were required for NMR signal assignments. These calculations were performed using the first three available purely hydrous and anhydrous PTX structures, which were determined by XRD and published by Vel-la-Zarb et al. in 2013. Within this thesis, is was discovered that two investigated batches of commercially available PTX from the same supplier both contained an identical and so far un-known PTX phase that was elucidated by PXRD as well as solid-state NMR data. One of the two batches consists of an additional phase that was shown to be very similar to a known hy-drated phase published in 2013.[1] By heating the batch with the mixture of the two phases un-der vacuum, it is transformed completely to the new dry phase occurring in both PTX batches. Since the drying conditions to obtain anhydrous PTX in-situ on the PXRD setup described by Vella-Zarb et. al.[1] were much softer than ours, we identify our dry phase as a relaxed version of their published anhydrate structure. The PXRD data of the new anhydrate phase was trans-ferred into a new structural model, which currently undergoes geometry optimization. Based on solid-state NMR data at MAS spinning frequencies up to 100 kHz, a 13C and a partial 1H signal assignment for the new anhydrous structure were achieved. These results provided sufficient structural information for further investigations of the micellar POL-PTX system. In a second study, the applicability and benefit of two-dimensional solid-state 14N-1H HMQC MAS NMR spectra for the characterization of amorphous POL-PTX formulations was investi-gated. The mentioned technique has never been applied to a system of similar complexity be-fore and was chosen because around 84% of the small-molecule drugs contain at least one nitrogen atom. In addition, the number of nitrogen atoms in both POL and PTX is much smaller than the number of carbons or hydrogens, which significantly reduces the spectral complexity. 14N has a natural abundance of 99.6% but leads to quadrupolar broadening due to its nuclear spin quantum number I = 1. While this is usually undesirable due to broadening in the resulting 1D 14N NMR spectra, this effect is explicitly used in the 2D 14N-1H HMQC MAS experiment. The indirect 14N measurement can avoid the broadening while maintaining the advantage of the high natural abundance and making use of the much more dispersed signals due to the additional quadrupolar shifts as compared to 15N. This measurement method could be successfully applied to the complex amorphous POL-PTX mixtures. With increasing PTX loading of the formulations, additional peaks arise as spatial proximities of the amide nitrogens of POL to NH or OH groups of PTX. In addition, the 14N quadrupolar shift of these amide nitrogens decreases with increasing PTX content indicating a more symmetric nitrogen environment. The latter can be explained by a transformation of the trigonal planar coordination of the tertiary amide nitrogen atoms in pure POL towards a more tetrahedral environment upon PTX loading induced by the formation of hydrogen bonds with NH/OH groups of PTX. In the third and last project, the results of the two abovementioned studies were used and ex-tended by solid state 13C and two-dimensional 1H-13C as well as 1H-1H MAS NMR data with the aim to derive a structural model of the POL-PTX formulations at an atomic level. The knowledge of the NMR signal assignments for crystalline PTX was transferred to amorphous PTX (present in the micelles of the formulations). The 13C solid-state NMR signals were evalu-ated concerning changes in chemical shifts and full widths of half maximum (FWHM) for the different PTX loadings. In this way, the required information about possible interaction sites at an atomic level becomes available. Due to the complexity of these systems, such proximities often cannot be assigned to special atoms, but more to groups of atoms, as the individual de-velopments of line widths and line shifts are mutually dependent. An advantageous aspect for this analysis was that pure POL already forms unloaded micelles. The evaluation of the data showed that the terminal phenyl groups of PTX seem to be most involved in the interaction by the establishment of the micelle for lowest drug loading and that they are likely to react to the change in the amount of PTX molecules as well. For the incorporation of PTX in the micelles, the following model could be obtained: For lowest drug loading, PTX is mainly located in the inner part of the micelles. Upon further increasing of the loading, it progressively extends to-ward the micellar shell. This could be well shown by the increasing interactions of the hydro-phobic butyl chain of POL and PTX, proceeding in the direction of the polymer backbone with rising drug load. Furthermore, due to the size of PTX and the hydrodynamic radius of the mi-celles, even at the lowest loading, the PTX molecules partially reach the core-shell interface of the micelle. Upon increasing the drug loading, the surface coverage with PTX clusters increas-es based on the obtained model approach. The latter result is supported by DLS and SANS data of this system. The abovementioned results of the 14N-1H HMQC MAS investigation of the POL-PTX formulations support the outlined model. As an outlook, the currently running geometry optimization and subsequently scheduled calcu-lation of the chemical shieldings of the newly obtained anhydrous PTX crystal structure can further improve the solid-state NMR characterization through determination of further spatial proximities among protons using the existing 2D 1H(DQ)-1H(SQ) solid-state MAS NMR spec-trum at 100 kHz rotor spinning frequency. The 2D 14N-1H HMQC MAS NMR experiments were shown to have great potential as a technique for the analysis of other disordered and amor-phous drug delivery systems as well. The results of this thesis should be subsequently applied to other micellar systems with varying pharmaceutical excipients or active ingredients with the goal of systematically achieving higher drug loadings (e.g., for the investigated PTX, the similar drug docetaxel or even different natural products). Additionally, it is planned to transfer the knowledge to another complex polymer system containing poly(amino acids) which offers hy-drogen bonding donor sites for additional intermolecular interactions. Currently, the POL-PTX system is investigated by further SANS studies that may provide another puzzle piece to the model as complementary measurement method in the future. In addition, the use of MD simu-lations might be considered in the future. This would allow a computerized linking of the differ-ent pieces of information with the aim to determine the most likely model. / Paclitaxel (PTX) ist eines der führenden Medikamente gegen Brust-und Eierstockkrebs. Aufgrund seiner geringen Löslichkeit erfordert die Behandlung der Patienten mit diesem Medikament eine sehr gut geeignete Kombination mit einem löslichen pharmazeutischenHilfsstoff, um die Bioverfügbarkeit zu erhöhen und die starken Nebenwirkungen zu reduzieren. Ein effizienter Weg, dies in Zukunft zu erreichen, könnte der Einbau von PTX in polymere Mizellen sein, die aus Poly(2-oxazolin)-basierten Triblock-Copolymeren (POL) bestehen und PTX-Beladungen von bis zu 50 Gew.-% ermöglichen. Strukturelle Informationen auf atomarer Ebene und damit die Kenntnis von Wechselwirkungeninnerhalb dieser vielversprechenden, aber komplexen PTX-POL-Formulierungen waren jedoch bisher nichtverfügbar. Solche Ergebnisse könnten die zukünftige Entwicklung von verbesserten Hilfsstoffen für PTX und von geeigneten Hilfsstoffen für andere pharmazeutische Wirkstoffe unterstützen. Aus diesem Grund wurdenin der vorliegenden DissertationFestkörper-NMR-Untersuchungen andiesenamorphen Formulierungen mit unterschiedlichen POL-PTX Zusammensetzungen durchgeführt, weil damit Einblickein die lokale Struktur auf atomarer Ebene im festen Zustand erhalten werden können. Aufgrund der verringerten Mobilität des eingebrachten Wirkstoffs in diesem System ergeben NMR-Messungen in Lösung sehr breite 13C-PTX-Signale, was diese Technikals Analysemethode ausschließt. ...

Main objectives of the present dissertation can be divided in two parts. The first part deals with setting up a spectroscopic technique for reliable and accurate measurements of the two-photon absorption (2PA) cross section spectra. In the second part, this firmly established experimental technique together with conventional spectroscopic characterization, quantum-chemical computations and theoretical modelling calculations was combined and therefore used as a tool to gain information for the so-called structure-property relationship through several molecular compounds. / Die Hauptziele der vorliegenden Dissertation lassen sich in zwei Teile gliedern. Der erste Teil befasst sich mit dem Aufbau einer spektroskopischen Technik zur zuverlässigen und genauen Messung der Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnittsspektren (2PA). Im zweiten Teil wurde diese fest etablierte experimentelle Technik zusammen mit konventioneller spektroskopischer Charakterisierung, quantenchemischen Berechnungen und theoretischen Modellrechnungen kombiniert und damit als Werkzeug genutzt, um über mehrere molekulare Verbindungen Informationen für die sogenannte Struktur-Eigenschafts-Beziehung zu gewinnen.

Nucleic acids are one of the important classes of biomolecules together with carbohydrates, proteins and lipids. Both deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) are most well known for their respective roles in the storage and expression of genetic information. Over the course of the last decades, nucleic acids with a variety of other functions have been discovered in biological organisms or created artificially. Examples of these functional nucleic acids are riboswitches, aptamers and ribozymes. In order to gain information regarding their function, several analytical methods can be used. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is one of several techniques which can be used to study nucleic acid structure and dynamics. However, EPR spectroscopy requires unpaired electrons and because nucleic acids themselves are not paramagnetic, the incorporation of spin labels which carry a radical is necessary. Here, three new spin labels for the analysis of nucleic acids by EPR spectroscopy are presented. All of them share two important design features. First, the paramagnetic center is located at a nitroxide, flanked by ethyl groups to prevent nitroxide degradation, for example during solid phase synthesis. Furthermore, they were designed with rigidity as an important quality, in order to be useful for applications like pulsed electron double resonance (PELDOR) spectroscopy, where independent motion of the spin labels relative to the macromolecule has a noticeable negative effect on the precision of the measurements. Benzi-spin is a spin label which differs from most previous examples of rigid spin labels in that rather than being based on a canonical nucleoside, with a specific base pairing partner, it is supposed to be a universal nucleoside which is sufficiently rigid for EPR measurements when placed opposite to a number of different nucleosides. Benzi-spin was successfully incorporated into a 20 nt oligonucleotide and its base pairing behavior with seven different nucleosides was examined by UV/VIS thermal denaturation and continuous wave (CW) EPR experiments. The results show only minor differences between the different nucleosides, thus confirming the ability of benzi-spin to act as a universally applicable spin label. Lumi-spin is derived from lumichrome. It features a rigid scaffold, as well as a free 2'-hydroxy group, which should make it well suited for PELDOR experiments once it is incorporated into RNA oligonucleotides. EÇr is based on the Ç family of spin labels, which contains the most well known rigid spin labels for nucleic acids to this day. It is essentially a version of EÇm with a free 2'-hydroxy group. It was converted to triphosphate EÇrTP and used for primer extension experiments to test the viability of enzymatic incorporation of rigid spin labels into oligonucleotides as an alternative to solid-phase synthesis. Incorporation into DNA by Therminator III DNA polymerase in both single-nucleotide and full-length primer extensions was achieved. All three of these spin labels represent further additions to the expanding toolbox of EPR spectroscopy on nucleic acids and might prove valuable for future research. / Nukleinsäuren sind neben den Kohlenhydraten, Proteinen und Lipiden eine der wichtigen Klassen von Biomolekülen. Sowohl Deoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) sind am besten für ihre Funktionen bei der Speicherung und Expression der genetischen Informationen bekannt. Während der letzten Jahrzehnte wurden Nukleinsäuren mit einer Vielzahl von Funktionen in biologischen Organismen entdeckt oder künstlich hergestellt. Beispiele für diese funktionellen Nukleinsäuren sind Riboswitches, Aptamere und Ribozyme. Um Informationen über ihre Funktionsweisen zu erhalten, können verschiedene analytische Methoden verwendet werden. Elektronenspinresonanzspektroscopie (ESR) ist eine Analysetechnik, die Aufschluss über Struktur und Dynamik von Nukleinsäuren geben kann. Für ESR Messungen werden ungepaarte Elektronen benötigt, sodass nicht paramagnetische Verbindungen mit einem Spinmarker modifiziert werden müssen, der ein Radikal trägt. In dieser Arbeit werden drei neue Spinmarker für die ESR Analyse von Nukleinsäuren vorgestellt. Allen liegen zwei Designprinzipien zugrunde. Erstens wird als paramagnetische Verbindung ein Nitroxid verwendet, welches von Ethylgruppen flankiert wird um das Radikal zu stabilisieren, zum Beispiel gegen Reagenzien, die in der Festphasensynthese verwendet werden. Zweitens sind die Nitroxide Teil starrer Ringsysteme. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen wie Abstandsmessungen mittels Pulselektronendoppelresonanzspektroskopie (PELDOR), wo die Genauigkeit der Messung von Bewegungen der Spinmarker relativ zum Makromolekül beeinträchtigt wird. Benzi-spin unterscheidet sich von vielen anderen starren Spinmarkern dadurch, dass es nicht auf einem kanonischen Nukleosid mit einem spezifischen Bindungspartner basiert. Stattdessen handelt es sich um ein universelles Nukleosid, das unabhängig vom gegenüberliegenden Nukleosid starr genug für ESR Messungen ist. Benzi-spin wurde erfolgreich in ein Oligonucleotid eingebaut und seine Basenpaarung mit sieben verschiedenen Nukleosiden mittels UV/VIS Schmelzkurven und Continuous Wave (CW) ESR Experimenten untersucht. Die Ergebnisse zeigen nur geringe Unterschiede zwischen den verschiedenen Nukleosiden, was die Einsetzbarkeit von Benzi-spin als universeller Spinmarker bestätigt. Lumi-spin ist vom Lumichrom abgeleitet. Es zeichnet sich durch ein starres Gerüst und eine freie 2'-Hydroxygruppe aus, wodurch es gut für PELDOR Messungen in RNA geeignet sein sollte. EÇr gehört zur Ç Familie, welche die am besten bekannten starren Spinmarker für Nukleinsäuren enthält. Es handelt sich um eine Version von EÇm mit einer freien 2'-Hydroxygruppe. EÇr wurde zum Triphosphat EÇrTP konvertiert und für Primer Extension Experimente verwendet um die Möglichkeit des enzymatischen Einbaus starrer Spinmarker in Oligonukleotide als Alternative zur Festphasensynthese zu prüfen. Der Einbau in DNA mit Therminator III DNA Polymerase in Primer Extensions war erfolgreich. Alle drei Spinmarker erweitern die Möglichkeiten der ESR-spektroskopischen Untersuchung von Nukleinsäuren und können sich für zukünftige Forschung als nützlich erweisen.

A series of monomeric chirally substituted indolenine squaraine monomers were successfully synthesized and utilized for the construction of various oligo- and polymers, in order to study their chiroptical properties in terms of exciton chirality. The quaternary carbon atom at the 3-position of the indolenine subunit, as well as the alkyl side chain attached to the indolenine nitrogen were selected as the most suitable site for chiral functionalization. For the C(3)-chiral derivatives, two synthetic routes depending on the desired substitution at the stereogenic center were established. The chiral side chains were prepared via Evans asymmetric alkylation where the resulting branching point at the 2 position constituted the chiral center. While the chiral substitution only had minor effects on the linear optical properties and geometric structure of the chromophore, all compounds exhibited a distinct and measurable CD signal that correlated with the distance of the chiral center to the central chromophore. Polymers bearing chiral side chains exhibited a solvent- and temperature-dependent helix-coil equilibrium, which was influenced by the type of side chain used. CD spectroscopy revealed the helical conformation to possess a preferred twist sense, and temperature-dependent measurements showed the degree of homohelicity to be nearly complete in certain cases. Furthermore, a CPL signal was able to be obtained for the helical conformer of one polymer. Various (co)oligo- and polymers comprising the C(3)-chiral monomers only displayed a solvent-independent J-type absorption behavior and thus did not form helical conformations in solution. CD spectroscopy revealed a solvent-dependent adoption of quasi-enantiomeric conformers, which was elucidated by quantum chemical TDDFT calculations. / Eine Reihe von monomeren, chiral substituierten Indolenin-Squarain-Monomeren wurde erfolgreich synthetisiert und für die Konstruktion verschiedener Oligo- und Polymere verwendet, um ihre chiroptischen Eigenschaften in Bezug auf die Exzitonenchiralität zu untersuchen. Als geeignete Stelle für die chirale Funktionalisierung wurden das quartäre Kohlenstoffatom an der 3-Position der Indolenineinheit sowie die an den Indolenin- Stickstoff gebundene Alkylseitenkette ausgewählt. Für die C(3)-chiralen Derivate wurden je nach gewünschter Substitution am stereogenen Zentrum zwei Synthesrouten etabliert. Die chiralen Seitenketten wurden über eine asymmetrische Evans-Alkylierung synthetisiert, wobei der resultierende Verzweigungspunkt an der 2-Position das chirale Zentrum darstellte. Während die chirale Substitution nur geringe Auswirkungen auf die linearen optischen Eigenschaften und die geometrische Struktur des Chromophors hatte, zeigten alle Verbindungen ein deutliches und messbares CD-Signal, das mit dem Abstand des chiralen Zentrums zum zentralen Chromophor korrelierte. Polymere mit chiralen Seitenketten zeigten ein lösungsmittel- und temperaturabhängiges Helix-Knäuel-Gleichgewicht, das durch die Art der verwendeten Seitenkette beeinflusst wurde. Durch CD Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die helikale Konformation einen bevorzugten Drehsinn besitzt. Temperaturabhängige CD Messungen zeigten, dass der Grad der Homohelizität in bestimmten Fällen nahezu vollständig ist. Weiterhin konnte für das helikale Konformer eines Polymers ein CPL-Signal erhalten werden. Verschiedene (Co)oligo- und Polymere bestehend aus den C(3)-chiralen Monomere zeigten nur ein lösungsmittelunabhängiges J- Typ Absorptionsverhalten und bildeten daher in Lösung keine helikalen Konformationen. CD-Spektroskopie zeigte eine lösungsmittelabhängige Annahme von quasi-enantiomeren Konformationen, was durch quantenchemische TDDFT-Rechnungen aufgeklärt wurde.

In der vorliegenden Publikation wurden stabile kolloidale Lösungen aus CVD-Diamant, Detonationsdiamant sowie artverwandten Materialien hergestellt und charakterisiert Besonderes Augenmerk wurde bei der Zerkleinerung von CVD Diamant daraufgelegt, dass die nanoskaligen Partikel ihre materialspezifischen Eigenschaften auch bei Reduktion der Größe beibehalten. Systematisch wurde die Zerkleinerung in einer Planetenmühle analysiert. Es wurde sowohl die minimal erreichbare Partikelgröße, als auch die Menge an erzeugtem, nanoskaligem Material bewertet. Um die Vermahlung zu verbessern, wurden die Geschwindigkeit der Mühle, die Größe der Mahlkörper, die Dauer der Vermahlung, sowie die eingesetzten Lösemittel variiert. Des Weiteren konnten durch die Vermahlung unterschiedlich hergestellter CVD Diamantfilme in einer Vibrationsmühle die Einflüsse von Schichtdicke und Korngröße der Diamantkristalle untersucht werden. Durch Bearbeitung von Detonationsdiamanten und Kohlenstoffnanozwiebeln wurden stabile kolloidale Lösungen hergestellt, mit Partikelgrößen im unteren Nanometerbereich. Diese sind im alkalischen pH-Bereich stabil sein, hierfür wurde durch Luft und Säureoxidation oxidierter Detonationsdiamant und oxidierte Kohlenstoffnanozwiebeln hergestellt. Mithilfe der thermogravimetrischen Analyse und Infrarotspektroskopie wurde die hierfür optimale Temperatur und Dauer bestimmt. / In the present publication, stable colloidal solutions of CVD diamond, detonation diamond and related materials were produced and characterized. During the grinding of CVD diamond, special attention was paid to ensuring that the nanoscale particles retain their material-specific properties even when their size is reduced. The grinding in a planetary mill was analyzed systematically. Both the minimum achievable particle size and the amount of nanoscale material produced were evaluated. In order to improve the grinding, the speed of the mill, the size of the grinding media, the duration of the grinding and the solvents used were varied. Furthermore, the influences of layer thickness and grain size of the diamond crystals could be investigated by grinding differently produced CVD diamond films in a vibration mill. Stable colloidal solutions were prepared from detonation diamonds and carbon nano onions, with particle sizes in the sub-nanometer range. These are stable in alkaline pH range. For this purpose oxidized detonation diamond and oxidized carbon nano onions were modified by air and acid oxidation. The optimum temperature and duration for this was determined with the aid of thermogravimetric analysis and infrared spectroscopy.

Herein described is the discovery of three novel types of dimeric naphthylisoquinoline alkaloids, named mbandakamines, cyclombandakamines, and spirombandakamines. They were found in the leaves of a botanically as yet unidentified, potentially new Ancistrocladus species, collected in the rainforest of the Democratic Republic of the Congo (DRC). Mbandakamines showed an exceptional 6′,1′′-coupling, in the peri-position neighboring one of the outer axes, leading to an extremely high steric hindrance at the central axis, and to U-turn-like molecular shape, which – different from all other dimeric NIQs, whose basic structures are all quite linear – brings three of the four bicyclic ring systems in close proximity to each other. This created an unprecedented follow-up chemistry, involving ring closure reactions, leading to two further, structurally even more intriguing subclasses, the cyclo- and the spirombandakamines, displaying eight stereogenic elements (the highest total number ever found in naphthylisoquinoline alkaloids). The metabolites exhibited pronounced antiplasmodial and antitrypanosomal activities. Likewise reported in this doctoral thesis are the isolation and structural elucidation of naphthylisoquinoline alkaloids from two further potentially new Ancistrocladus species from DRC. Some of these metabolites have shown pronounced antiausterity activities against human pancreatic cancer PANC-1 cells. / In dieser Arbeit wird die Entdeckung von drei neuen Typen von dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloiden (NIQs) beschrieben, die als Mbandakamine, Cyclombandakamine und Spirombandakamine bezeichnet werden. Sie wurden in den Blättern einer botanisch noch nicht identifizierten, möglicherweise neuen Ancistrocladus-Art gefunden, die im Regenwald der Demokratischen Republik Kongo (DR Kongo) gesammelt wurde. Mbandakamine zeigen eine außergewöhnliche 6',1''-Kupplung in der peri-Position neben einer der äußeren Achsen, was zu einer extrem hohen sterischen Hinderung an der zentralen Achse und zu einer U-förmigen Molekülform führt. Diese unterschiedet sich von allen anderen dimeren NIQs, deren Grundstrukturen alle ziemlich linear sind. Im Fall der Mbandakamine werden drei der vier bicyclischen Ringsysteme in enger Nachbarschaft zueinander gebracht. Dies führte zu einer beispiellosen Folgechemie mit Ringschlussreaktionen, die zu zwei weiteren, strukturell noch faszinierenderen Unterklassen führte, den Cyclo- und Spirombandakaminen, die acht stereogene Elemente aufweisen (die höchste Gesamtzahl, die jemals in Naphthylisochinolin-Alkaloiden gefunden wurde). Die Metaboliten zeigten ausgeprägte antiplasmodiale und antitrypanosomale Aktivitäten. Ebenfalls in dieser Dissertation wird über die Isolierung und Strukturaufklärung von Naphthylisochinolin-Alkaloiden aus zwei weiteren potentiell neuen Ancistrocladus-Arten aus der DR Kongo berichtet. Einige dieser Metaboliten zeigten ausgeprägte Antiaustizitäts-Aktivitäten gegen humane Pankreaskrebs-PANC-1-Zellen.

Die Zelle stellt die kleinste Einheit des Lebens dar und zeichnet sich durch die hoch koordinierte Anordnung von mehreren Millionen (Bio-)Molekülen zu einem mikrometergroßen Objekt aus. Als struktureller Bestandteil der Lipiddoppelschicht eukaryotischer Zellen spielt neben Sterolen und Glycerolipiden die Verbindungsklasse der Sphingolipide eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membranintegrität.[472] Darüber hinaus sind bioaktive Sphingolipide bei vielen grundlegenden zellulären Prozessen wie Apoptose, Wachstum, Differenzierung, Migration und Adhäsion entscheidend beteiligt.[87,120] Ein gestörtes Gleichgewicht des Sphingolipidmetabolismus und Defekte der entsprechenden Stoffwechselwege stehen im Zusammenhang mit vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, chronischen Entzündungen und Autoimmunerkrankungen sowie viraler und bakterieller Pathogenese.[22,143,473,474] Die Entwicklung und Anwendung von Sphingolipidanaloga als potenzielle Wirkstoffe rückten in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der interdisziplinären Forschung von Biologen, Chemikern und Medizinern. Als bekanntestes Beispiel ist Fingolimod (FTY720) zu nennen, das als Sphingosin-1-phosphat-Mimetikum heute unter dem Markennamen Gilenya® erfolgreich als Arzneistoff zur Behandlung von Multipler Sklerose eingesetzt wird.[475] Es besteht jedoch die Gefahr, dass Fingolimod zur Schädigung anderer Zellfunktionen und zu gravierenden Nebeneffekten wie Bradykardie führen kann.[476] Da Sphingolipide ebenfalls in der Kontrolle von bakteriellen und viralen Infektionen essentiell beteiligt sind, spielen Sphingolipide und deren synthetisch dargestellte Derivate vermehrt eine Rolle in der Wirkstoffentwicklung im Kampf gegen pathogene Krankheitserreger.[175,477-479] Die Wirkweise von antimikrobiellen Sphingolipiden ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. Für eine Weiterentwicklung von bekannten Medikamenten gegen verschiedene Krankheiten oder für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen Erreger ist eine umfassende Untersuchung der zugrundeliegenden zellulären Mechanismen auf molekularer Ebene entscheidend. Hierfür finden aufgrund der relativ einfachen Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie häufig fluoreszenzmarkierte Sphingolipidderivate breite Anwendung.[480] Die kovalent gebundene Farbstoffeinheit bringt jedoch wesentliche Nachteile mit sich, da sich die Biomoleküle durch die veränderte Struktur und Polarität in ihren biologischen Eigenschaften von den natürlichen Substraten unterscheiden können. Die Verwendung von bioorthogonal funktionalisierten Biomolekülen umgeht dieses Problem, da die strukturellen Änderungen minimal gehalten werden. Nach dem zellulären Einbau dieser Derivate ist eine schnelle und spezifische Konjugation mit einem komplementären Fluorophor zu einem gewünschten Zeitpunkt durch sogenannte Click-Reaktionen wie CuAAC oder SPAAC möglich.[12,46] Das Prinzip der Click-Chemie wurde bereits auf eine Vielzahl an Biomolekülen wie Sphingolipide, Fettsäuren, Aminosäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Nukleoside oder Nukleinsäuren (DNA und RNA) übertragen.[47,280] Jedoch bedarf es weiterer spezifisch modifizierter Verbindungen, die vielfältige bioorthogonale Reaktionen für die Untersuchung von Zellprozessen zulassen ‒ sowohl in vitro als auch in vivo. Um neue Therapieansätze gegen verschiedene Krankheiten zu entwickeln und schwerwiegende Nebenwirkungen zu vermeiden, ist die detaillierte Erforschung hochkomplexer Zellvorgänge auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese und Charakterisierung von molekularen Werkzeugen, die in Kombination mit verschiedenen aktuellen Mikroskopie- und Massenspektrometriemethoden die Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse ermöglichen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine Vielzahl an Sphingolipiden und deren bioorthogonal funktionalisierte Analoga ausgehend von der Aminosäure L-Serin erfolgreich synthetisiert. Die vorgestellten Verbindungen eignen sich in Kombination mit Massenspektrometrie und Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung des komplexen Sphingolipidmetabolismus sowie des Einbaus und der Dynamik von Sphingolipiden in Modell- und Zellmembranen. Sowohl in humanen und tierischen Zellen als auch in Bakterien wurden die azidmodifizierten Sphingolipide durch Click-Reaktionen visualisiert, um ein verbessertes Verständnis von bakteriellen und viralen Infektionsprozessen zu erhalten. Der modulare Ansatz der Click-Chemie ermöglicht die Verwendung verschiedener komplementär funktionalisierter Farbstoffe, die unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der Membrandurchgängigkeit oder Absorptions- und Emissionswellenlängen besitzen und somit je nach biologischer Fragestellung gezielt eingesetzt werden können. Alles in allem tragen die in dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen dazu bei, die Rolle von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und Krankheitsverläufen auf subzellulärer Ebene aufzuklären. Dadurch wird ein entscheidender Beitrag für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen bakterielle oder virale Erreger sowie innovativer Therapien gegen verschiedene humane Krankheiten geliefert. / The cell represents the smallest unit of life and is characterized by the highly coordinated arrangement of several million (bio)molecules to form a micrometer-sized object. As a structural component of the lipid bilayer of eukaryotic cells, in addition to sterols and glycerophospholipids, the compound class of sphingolipids plays a central role in maintaining membrane integrity.[472] In addition, bioactive sphingolipids are critically involved in many basic cellular processes such as apoptosis, growth, differentiation, migration and adhesion.[87,120] A disturbed balance of the sphingolipid metabolism and defects in the corresponding metabolic pathways are associated with many diseases such as cancer, diabetes, obesity, arteriosclerosis, chronic inflammation and autoimmune diseases as well as viral and bacterial pathogenesis.[22,143,473,474] The development and application of sphingolipid analogues as potential active ingredients have moved more and more into the focus of interdisciplinary research by biologists, chemists and medical professionals in recent years. The best-known example is fingolimod (FTY720), which is now successfully used as a sphingosine-1-phosphate mimetic under the brand name Gilenya® as a drug for the treatment of multiple sclerosis.[475] However, there is a risk that fingolimod can damage other cell functions and lead to serious side effects such as bradycardia.[476] Since sphingolipids are also essential for the control of bacterial and viral infections, sphingolipids and their synthetically produced derivatives are playing an increasing a role in the development of active ingredients in the fight against pathogenic germs.[175,477-479] The mode of action of antimicrobial sphingolipids has not yet been fully elucidated. A comprehensive investigation of the underlying cellular mechanisms at the molecular level is crucial for further development of known drugs against various diseases or for the development of novel active substances against pathogens. Due to the relatively easy detection by fluorescence microscopy, fluorescence-labeled sphingolipid derivatives are widely used for this purpose.[480] However, the covalently bonded dye unit has significant disadvantages since the biological properties of the biomolecules can differ from the natural substrates concerning structure and polarity changes. The usage of bioorthogonally functionalized biomolecules avoids this problem because the structural changes are kept to a minimum. After the cellular incorporation of these derivatives, rapid and specific conjugation with a complementary fluorophore at a desired point of time is possible by so-called click reactions such as CuAAC or SPAAC.[12,46] The concept of click chemistry has already been applied to a large number of biomolecules such as sphingolipids, fatty acids, amino acids, proteins, carbohydrates, nucleosides or nucleic acids (DNA and RNA).[47,280] However, further specifically modified compounds are required, allowing diverse bioorthogonal reactions for the investigation of cell processes – both in vitro and in vivo. In order to develop new therapeutic approaches against numerous diseases and to avoid serious side effects, detailed research into highly complex cell processes at the molecular level is of crucial importance. Therefore, the aim of this work was the synthesis and characterization of molecular tools which, in combination with several current microscopy and mass spectrometry methods, enable the visualization and investigation of the sphingolipid metabolism and other biological processes. In summary, a variety of sphingolipids and their bioorthogonally functionalized analogues were successfully synthesized in this work starting from the amino acid L-serine. In combination with mass spectrometry and fluorescence or electron microscopy, the presented compounds are suitable as molecular tools for the investigation of the complex sphingolipid metabolism as well as the incorporation and dynamics of sphingolipids in model and cell membranes. The azide-modified sphingolipids were visualized by click reactions in human and animal cells as well as in bacteria to gain a better understanding of bacterial and viral infection processes. The modular approach of click chemistry enables the use of different complementarily functionalized dyes that have different properties in terms of membrane permeability or absorption and emission wavelengths and can therefore be used in a targeted manner depending on the biological issue. All in all, the compounds synthesized in this work help to elucidate the role of sphingolipids in infection processes and disease progression at subcellular level. This makes a decisive contribution to the development of novel active substances against bacterial or viral pathogens as well as of innovative therapies against various human diseases.

Beyond the four canonical nucleosides as primary building blocks of RNA, posttranscriptional modifications give rise to the epitranscriptome as a second layer of genetic information. In eukaryotic mRNA, the most abundant posttranscriptional modification is N6-methyladenosine (m6A), which is involved in the regulation of cellular processes. Throughout this thesis, the concept of atomic mutagenesis was employed to gain novel mechanistic insights into the substrate recognition by human m6A reader proteins as well as in the oxidative m6A demethylation by human demethylase enzymes. Non-natural m6A atomic mutants featuring distinct steric and electronic properties were synthesized and incorporated into RNA oligonucleotides. Fluorescence anisotropy measurements using these modified oligonucleotides revealed the impact of the atomic mutagenesis on the molecular recognition by the human m6A readers YTHDF2, YTHDC1 and YTHDC2 and allowed to draw conclusions about structural prerequisites for substrate recognition. Furthermore, substrate recognition and demethylation mechanism of the human m6A demethylase enzymes FTO and ALKBH5 were analyzed by HPLC-MS and PAGE-based assays using the modified oligonucleotides synthesized in this work. Modified nucleosides not only expand the genetic alphabet, but are also extensively researched as drug candidates. In this thesis, the antiviral mechanism of the anti-SARS-CoV-2 drug remdesivir was investigated, which causes delayed stalling of the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). Novel remdesivir phosphoramidite building blocks were synthesized and used to construct defined RNA-RdRp complexes for subsequent studies by cryogenic electron microscopy (cryo-EM). It was found that the 1'-cyano substituent causes Rem to act as a steric barrier of RdRp translocation. Since this translocation barrier can eventually be overcome by the polymerase, novel derivatives of Rem with potentially improved antiviral properties were designed. / Über die vier kanonischen Nukleoside als primäre RNA-Bausteine hinausgehend bauen posttranskriptionelle Modifikationen eine zweite Informationsebene, das Epitranskriptom, auf. Die häufigste posttranskriptionelle Modifikation in eukaryotischer mRNA ist N6-Methyladenosin (m6A), welches in die Regulierung zellulärer Prozesse involviert ist. In dieser Arbeit wurde das Konzept der atomaren Mutagenese genutzt, um neue Einblicke in die Erkennung von m6A durch menschliche m6A-bindende Proteine sowie in die oxidative Demethylierung von m6A durch menschliche Demethylase-Enzyme zu gewinnen. Es wurden nicht natürlich vorkommende m6A Atommutanten mit unterschiedlichen elektronischen und sterischen Eigenschaften synthetisiert und in RNA-Oligonukleotide eingebaut. Durch Fluoreszenzanisotropie-Messungen mit diesen Oligonukleotiden wurde der Einfluss der Atommutagenese auf die molekulare Erkennung durch die menschlichen m6A-bindenden Proteine YTHDF2, YTHDC1 und YTHDC2 untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse ließen Rückschlüsse auf die strukturellen Voraussetzungen für die Erkennung eines Substrates zu. Weiterhin wurden die in dieser Arbeit synthetisierten modifizierten Oligonukleotide zur Untersuchung von Substraterkennung und Demethylierungs-Mechanismus der menschlichen m6A-Demethylasen FTO und ALKBH5 mittels HPLC-MS- und PAGE-basierter Analysen verwendet. Modifizierte Nukleoside dienen nicht nur zur Erweiterung des genetischen Alphabets, sondern werden auch als potentielle Wirkstoff-Kandidaten erforscht. In dieser Arbeit wurde der antivirale Wirkmechanismus des Anti-SARS-CoV-2-Wirkstoffes Remdesivir untersucht, der eine verzögerte Blockade der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) bewirkt. Neuartige Remdesivir Phosphoramidit-Bausteine wurden synthetisiert und genutzt, um RNA-RdRp-Komplexe mit definierter Struktur zu konstruieren, welche anschließend mittels Cryoelektronenmikroskopie (Cryo-EM) untersucht wurden. Es wurde herausgefunden, dass der 1'-Cyano-Substituent dazu führt, dass Rem als sterische Blockade der RdRp-Translokation agiert. Da diese Tranlokationsbarriere von der Polymerase überwunden werden kann, wurden neuartige Rem-Derivate mit potentiell verbesserten antiviralen Eigenschaften entworfen.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den Struktur-Eigenschafts-Beziehungen von sternförmigen Mesogenen mit kontrollierbaren Konformationen in den LC-Phasen. Zunächst sollte mithilfe verschiedener Moleküldesigns geklärt werden, wie eine Faltung der Arme verhindert werden kann, und somit, ob sternförmige Konformationen in den kolumnaren Packungen realisiert werden können. Hierzu wurde erfolgreich eine Bibliothek von dreiarmigen Amidsternen, semiflexiblen Oligoestersternen mit hexasubstituiertem Benzolkern und formtreuen hexasubstituierten Benzolen synthetisiert. Die besondere Herausforderung bei der Darstellung letzterer lag in der C3-Symmetrie der Verbindungen und konnte durch Optimierung der Synthesestrategie mittels aufeinander folgender Wittig-Horner- und Suzuki-Reaktionen in einem divergenten Ansatz gemeistert werden. Ein herausragendes Ergebnis ist die Flüssigkristallinität dieser formtreuen hexasubstituierten Strukturen, wenn sie mindestens neun bzw. zwölf periphere Ketten besitzen. Die detaillierte Auswertung der Kolumnendurchmesser mithilfe von äquatorialen Reflexen sowie der Dichte und der meridionalen Beugungsmuster zeigen, dass lediglich für die formtreuen hexasubstituierten Benzolderivate eine Faltung verhindert werden kann. Intrinsische Freiräume (Kävitäten) zwischen den Oligo(phenylenvinylen)-Armen werden durch außergewöhnliche Dimerenbildung und helikale Packung der Moleküle kompensiert. In die Kavitäten der Trispyridylverbindungen können Carbonsäure-funktionalisierte Gäste unter Ausbildung von Wasserstoffbrücken eingelagert werden. Mit zunehmender Gastkonzentration wird die helikale Dimerphase des Wirts kontinuierlich in eine neue kolumnare Phase von monomeren Supermesogenen ohne helikale Struktur umgewandelt. Da die Gäste in den Supermesogenen vollständig von den Oligo(phenylenvinylen)-Armen und den aliphatischen Ketten umschlossen sind, handelt es sich bei der Wirtverbindung erstmals um einen flüssigkristallinen Endorezeptor mit drei Bindungsstellen. Das Sternmesogen mit größeren intrinsischen Freiräumen ermöglicht die Einlagerung von funktionalen Bausteinen wie z.B. Anthracenchromophoren. Aus Untersuchungen mittels Festkörper-NMR- und Fluoreszenzspektroskopie geht hervor, dass sich die Mesophase mit drei Anthracengästen langsam in eine doppelt nanosegregierte Struktur umwandelt, in der intrakolumnar Oligo(phenylenvinylen)-Arme und Anthracene Seite an Seite segregiert stapeln und so segmentierte Kolumnen bilden. Diese Art von doppelter Nanosegregation offenbart das Potential des verwendeten Moleküldesigns im Bezug auf die Entwicklung mesomorpher Multikabelstrukturen. Im Vergleich zu den Supermesogenen weisen die analogen Sternverbindungen mit kovalent gebundenen Pseudogästen um über 100 °C höhere Klärpunkte auf, was unter Berücksichtigung der strukturellen Ähnlichkeit der kolumnaren Phasen und der ähnlichen Mischungsenthalpien in unterschiedlichen Werten der Mischungsentropie begründet liegen muss. Der Vergleich mit einer 1:3-Mischung ohne spezifische Wirt-Gast-Wechselwirkung bestätigt in diesem Zusammenhang den Einfluss der Bindungsart der Gäste auf die Mesophasenstabilität. Die Klärtemperaturen der Sternmesogene lassen sich folglich über die Art der Bindung der Gastmoleküle kontrollieren. Dies ist vor allem für die Orientierung kolumnarer Phasen in dünnen Filmen großer funktionaler Mesogene, die häufig erst bei sehr hohen Temperaturen unter Zersetzung in die isotrope Phase übergehen, interessant. / This dissertation examines the structure-property relationships of star-shaped mesogens with controllable conformations in the LC phases. First it should be clarified by means of different molecular designs, how a folding of the arms can be prevented, and thus, if reliable star-shaped conformations can be realized in the columnar stacks. For this reason, a library of three-armed amide stars, semi-flexible oligoester stars with a hexasubstituted benzene core and shape-persistent hexasubstituted benzenes was successfully synthesized. The particular challenge in the preparation of the latter was the C3-symmetry of the compounds and could be accomplished by optimizing the synthetic strategy using subsequently Wittig-Horner and Suzuki reactions in a divergent route. An outstanding result is the liquid crystallinity of these shape-persistent hexasubstituted structures, if they contain at least nine or twelve peripheral chains. The detailed evaluation of the column diameters, using equatorial reflections, as well as the density and the meridional scattering patterns shows that only the shape-persistent hexasubstituted benzene derivatives can be prevented from folding. Intrinsic free spaces (cavities) between the oligo(phenylenevinylene) arms are compensated by exceptional dimer formation and helical packing of the molecules. Carboxylic acid functionalized guests can be incorporated into the cavities of the trispyridyl compounds by forming hydrogen bonds. Upon increasing the guest concentration the helical dimer phase of the host is continuously converted into a new columnar phase of monomeric supermesogens without a helical structure. Since the guests of the supermesogens are entirely enclosed by the oligo(phenylenevinylene) arms and the aliphatic chains, the host compound is the first liquid crystalline endoreceptor with three binding sites. The star mesogen with larger intrinsic free spaces facilitates the incorporation of functional building blocks such as anthracene chromophores. Investigations by solid state NMR and fluorescence spectroscopy uncovered that the mesophase with three anthracene guests slowly converts into a double nanosegregated structure in which oligo(phenylenevinylene) arms und anthracenes stack side by side and thus form segmented columns. This type of double nanosegregation reveals the potential of the molecular design used with respect to the development of mesomorphic multi cable structures. In comparison to the supermesogens the analog star compounds with covalently bound pseudo guests exhibit more than 100 °C higher clearing points. Considering the structural similarity and the similar mixing enthalpy this must be due to different values of the mixing entropy. In this context, the comparison with a 1:3 mixture without any specific host-guest interaction confirms the influence of the binding mode of the guests on the mesophase stability. As a consequence, the clearing temperatures of the star mesogens can be controlled by the binding mode of the guest molecules. This is particularly interesting for the orientation of columnar phases in thin films of large functional mesogens which frequently transform into the isotropic phase at very high temperatures under decomposition.

Die vorliegende Arbeit hatte vorrangig zum Ziel, die enzymatische Synthese von prebiotischen Galactooligosacchariden (GOS) in Süß- und Sauermolke unter Nutzung verschiedener Enzymquellen zu evaluieren. Aufgrund des tendenziell weltweit steigenden Molkenaufkommens besteht großes Interesse, eine möglichst ganzheitliche Wertschöpfung dieses teilweise ungenutzten Rohstoffs zu generieren. Eine Möglichkeit, um dies zu realisieren, wäre die Herstellung einer GOS-haltigen Molke und eine entsprechende Weiterverarbeitung zu GOS-haltigen Lebensmitteln. Durch die generell hohe Temperatur- und pH-Toleranz von GOS sind vielfältige Applikationsmöglichkeiten gegeben. Neben den kommerziell verfügbaren β-Galactosidasen aus Aspergillus oryzae und Kluyveromyces lactis wurden Enzyme aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (kurz: L. bulgaricus) und Cryptococcus laurentii im Labormaßstab hergestellt und charakterisiert. Mit beiden Enzymen konnten höhere GOS-Ausbeuten in niedrig konzentrierten Lactoselösungen (Puffer als auch Molke) erhalten werden als mit den beiden kommerziellen Enzymen. Während die β-Galactosidase aus K. lactis stark vom umgebenden Medium beeinflusst wird, so zeigen alle anderen Enzyme eine gute Übertragbarkeit der Ergebnisse von Puffer auf das Substrat Süß- bzw. Sauermolke. Die höchste Transgalactosylierungsaktivität weist das Enzym aus C. laurentii mit Ausbeuten von ca. 50 % (inkl. GOS-Disaccharide) auf. Bei Verwendung der L. bulgaricus-Lactase können die Gesamtausbeute als auch die GOS-Zusammensetzung in Abhängigkeit von der gewählten Synthesetemperatur gezielt beeinflusst werden. Des Weiteren wurde der Einfluss einer parallel zur Synthese stattfindenden Glucose-Entfernung durch enzymatische Oxidation untersucht. Trotz tendenziell begünstigter Synthese von Tri- und höheren Oligosacchariden konnte die Ausbeute mit A. oryzae nicht signifikant gesteigert werden. Die Kopplung mit K. lactis führte zu einer signifikant verringerten Synthese von GOS-Disacchariden, wodurch die Ausbeute insgesamt sank. Der Einsatz von Glucose-Oxidase und Katalase ist demnach nur bei β-Galactosidasen empfehlenswert, welche vorrangig Tri- und kaum Disaccharide synthetisieren. Der Einsatz mehrerer β-Galactosidase-Enzyme stellte sich als vielversprechend heraus. In Abhängigkeit von den jeweils kombinierten Enzymen konnte die Ausbeute teilweise gesteigert werden. Positiv erwies sich eine sequentielle Kombination von A. oryzae und K. lactis im Sinne der Steigerung der Gesamtausbeute und der parallele Einsatz von A. oryzae und C. laurentii im Sinne der Erhöhung der Strukturdiversität der GOS-Mischung.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS XIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 STAND DES WISSENS 4 2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4 2.2 β-Galactosidasen 7 2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7 2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8 2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9 2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11 2.3 Galactooligosaccharide 12 2.3.1 Definition und Syntheseweg 12 2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14 2.3.2.1 Enzymquelle 14 2.3.2.2 Lactosekonzentration 16 2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17 2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21 2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22 2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26 2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26 2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27 2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27 2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28 2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30 2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32 3 MATERIAL UND METHODEN 40 3.1 Materialien 40 3.1.1 Verwendete Enzyme 40 3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40 3.1.3 Verwendete Molkeproben 40 3.1.4 Verwendete Geräte 40 3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40 3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41 3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41 3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41 3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42 3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42 3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43 3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43 3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43 3.4.1 β-Galactosidase 43 3.4.2 Glucose-Oxidase 44 3.4.3 Katalase 44 3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45 3.5 Enzymcharakterisierung 45 3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45 3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46 3.5.3 Enzymstabilität 46 3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47 3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47 3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47 3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47 3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48 3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48 3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49 3.8 Statistische Auswertung 50 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51 4.1 Zusammensetzung der Molken 51 4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52 4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52 4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55 4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57 4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61 4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61 4.3.1.1 Synthese in Puffer 61 4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64 4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66 4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67 4.3.2.1 Synthese in Puffer 67 4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69 4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70 4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73 4.3.3.1 Synthese in Puffer 73 4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76 4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78 4.3.4.1 Synthese in Puffer 78 4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80 4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83 4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90 4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95 4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95 4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95 4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100 4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105 4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106 4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106 4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111 5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114 6 LITERATURVERZEICHNIS 118 7 ANHANG 140 7.1 Anhang zu Kapitel 2 140 7.2 Anhang zu Kapitel 3 165 7.2.1 Verwendete Geräte 165 7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166 7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167 7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167 7.2.5 Katalaseaktivität 168 7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169 7.3 Anhang zu Kapitel 4 170 7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170 7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171 7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173 7.3.4 Katalase-Stabilität 182 7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183 7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184 7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188 7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190 7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191 7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192 7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193 7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194 / The prior aim of the present work was to study the synthesis of prebiotic galactooligosaccharides (GOS) in sweet and acid whey by using various enzyme origins. Worldwide, an increase in whey production can be observed, thus a complete usage of this partially wasted resource is preferable. This could be implemented by producing a GOS containing whey and its subsequent processing to GOS containing foods. Due to the high temperature stability over a wide pH range, manifold food applications are possible. Besides the commercial available β-galactosidases from Aspergillus oryzae and Kluyveromyces lactis, enzymes from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (short: L. bulgaricus) and Cryptococcus laurentii were produced on the laboratory scale and characterized accordingly. With both enzymes, higher GOS yields in low lactose solutions (buffer as well as whey) were achieved compared to the two commercial enzymes. While the β-galactosidase from K. lactis was strongly influenced by the surrounding environment, all other tested enzymes showed a good transferability of the results from buffer to sweet and acid whey, respectively. The enzyme from C. laurentii exhibited the highest affinity to transgalactosylation, the yield being about 50 % (including GOS disaccharides). When using the L. bulgaricus lactase, total GOS yield as well as GOS composition can be adjusted via the synthesis temperature. Furthermore, the effect of glucose depletion during GOS synthesis using enzymatic oxidation was examined. Although a tendency towards the synthesis of tri- and higher oligosaccharides was observed, GOS yield by A. oryzae was not significantly enhanced. The combination with the K. lactis enzyme led to a significantly reduced synthesis of GOS disaccharides, resulting in a decreased total GOS yield. Thus, the use of glucose oxidase and catalase is only beneficial for β-galactosidases, which have a preference for synthesizing trisaccharides, but less disaccharides. The use of more than one β-galactosidase has shown to be promising. Depending on the respective enzyme combinations, it was partially possible to enhance the GOS yield. Positive results in terms of increasing total GOS yield were obtained using a consecutive coupling of A. oryzae and K. lactis, while in terms of enhancing the structural diversity of the GOS mixture, a simultaneous combination of A. oryzae und C. laurentii led to the best results.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS XIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 STAND DES WISSENS 4 2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4 2.2 β-Galactosidasen 7 2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7 2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8 2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9 2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11 2.3 Galactooligosaccharide 12 2.3.1 Definition und Syntheseweg 12 2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14 2.3.2.1 Enzymquelle 14 2.3.2.2 Lactosekonzentration 16 2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17 2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21 2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22 2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26 2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26 2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27 2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27 2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28 2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30 2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32 3 MATERIAL UND METHODEN 40 3.1 Materialien 40 3.1.1 Verwendete Enzyme 40 3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40 3.1.3 Verwendete Molkeproben 40 3.1.4 Verwendete Geräte 40 3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40 3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41 3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41 3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41 3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42 3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42 3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43 3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43 3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43 3.4.1 β-Galactosidase 43 3.4.2 Glucose-Oxidase 44 3.4.3 Katalase 44 3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45 3.5 Enzymcharakterisierung 45 3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45 3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46 3.5.3 Enzymstabilität 46 3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47 3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47 3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47 3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47 3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48 3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48 3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49 3.8 Statistische Auswertung 50 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51 4.1 Zusammensetzung der Molken 51 4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52 4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52 4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55 4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57 4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61 4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61 4.3.1.1 Synthese in Puffer 61 4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64 4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66 4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67 4.3.2.1 Synthese in Puffer 67 4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69 4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70 4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73 4.3.3.1 Synthese in Puffer 73 4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76 4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78 4.3.4.1 Synthese in Puffer 78 4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80 4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83 4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90 4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95 4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95 4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95 4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100 4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105 4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106 4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106 4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111 5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114 6 LITERATURVERZEICHNIS 118 7 ANHANG 140 7.1 Anhang zu Kapitel 2 140 7.2 Anhang zu Kapitel 3 165 7.2.1 Verwendete Geräte 165 7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166 7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167 7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167 7.2.5 Katalaseaktivität 168 7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169 7.3 Anhang zu Kapitel 4 170 7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170 7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171 7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173 7.3.4 Katalase-Stabilität 182 7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183 7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184 7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188 7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190 7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191 7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192 7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193 7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194