Gene expression and transfer of the genetic information to the next generation forms the basis of cellular life. These processes crucially rely on DNA, thus the preservation, transcription and translation of DNA is of fundamental importance for any living being. The general transcription factor TFIIH is a ten subunit protein complex, which consists of two subcomplexes: XPB, p62, p52, p44, p34, and p8 constitute the TFIIH core, CDK7, CyclinH, and MAT1 constitute the CAK. These two subcomplexes are connected via XPD. TFIIH is a crucial factor involved in both, DNA repair and transcription. The central role of TFIIH is underlined by three severe disorders linked to failure of TFIIH in these processes: xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome, and trichothiodystrophy. Only limited structural and functional data of TFIIH are available so far. Here, the model organism Chaetomium thermophilum was utilized with the aim to structurally and functionally characterize TFIIH. By combining the expression and purification of single TFIIH subunits with the co-expression and co-purification of dual complexes, a unique and powerful modular system of the TFIIH core subunits could be established, encompassing all proteins in high quality and fully functional. This system permits the step-wise assembly of TFIIH core, thereby making it possible to assess the influence of the intricate interaction network within TFIIH core on the overall enzymatic activities of TFIIH, which has not been possible so far. Utilizing the single subunits and dual complexes, a detailed interaction network of TFIIH core was established, revealing the crucial role of the p34 subunit as a central scaffold of TFIIH by linking the two proteins p44 and p52. Our studies also suggest that p62 constitutes the central interface of TFIIH to the environment rather than acting as a scaffold. TFIIH core complexes were assembled and investigated via electron microscopy. Preliminary data indicate that TFIIH adopts different conformational states, which are important to fulfill its functions in transcription and DNA repair. Additionally, a shortened construct of p62 was used to develop an easy-to-use, low cost strategy to overcome the crystallographic phase problem via cesium derivatization. / Die Expression von Genen und die Weitergabe des Erbguts an die nächste Generation bilden die Grundlage jeden Lebens. Bei diesen Vorgängen spielt die DNA eine entscheidende Rolle. Deshalb sind der Erhalt, die Transkription und die Translation der DNA von fundamentaler Bedeutung für alle Lebewesen. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIH ist ein Multi-Proteinkomplex und umfasst insgesamt zehn Untereinheiten. TFIIH kann in zwei Teilkomplexe unterteilt werden: XPB, p62, p52, p44, p34 und p8 bilden den TFIIH Core Komplex, CDK7, CyclinH und MAT1 bilden den CAK Komplex. Diese beiden Teilkomplexe werden durch XPD verbunden. TFIIH spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der DNA Reparatur, als auch in der Transkription. Diese zentrale Rolle wird durch das Auftreten dreier schwerer Krankheiten deutlich, die mit dem Ausfall von TFIIH bei diesen Aufgaben in Verbindung stehen: Xeroderma pigmentosum, Cockayne-Syndrom und Trichothiodystrophie. Daten bezüglich der Struktur und Funktion von TFIIH stehen bisher nur in begrenztem Umfang zur Verfügung. In dieser Arbeit kam der Modellorganismus Chaetomium thermophilum zum Einsatz, mit dem Ziel die Struktur und Funktion von TFIIH näher zu beleuchten. Durch die Kombination der Expression und Aufreinigung einzelner TFIIH Untereinheiten mit der Koexpression und Koaufreinigung von dualen Komplexen konnte ein einmaliges und leistungsfähiges modulares System entwickelt werden, das die Darstellung aller Untereinheiten in hoher Qualität und voller Funktionalität erlaubt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die schrittweise modulare Zusammensetzung von TFIIH Core ermöglicht, was es nun erlaubt den Einfluss der komplexen Wechselwirkungen innerhalb von TFIIH Core auf die enzymatischen Aktivitäten im Ganzen zu untersuchen, was bisher nicht möglich war. Mit Hilfe der Einzelproteine und dualen Komplexe wurde ein detailliertes Netzwerk aus Wechselwirkungen innerhalb TFIIH Core etabliert, welches die entscheidende Rolle der p34 Untereinheit als zentrales Gerüst für TFIIH offenbarte, da sie die Verbindung zwischen p44 und p52 herstellt. Unsere Untersuchungen deuten zudem darauf hin, dass p62 die zentrale Schnittstelle zur Umgebung von TFIIH darstellt, anstatt als Gerüst zu fungieren. Des Weiteren gelang die Assemblierung von TFIIH Core Komplexen, die mittels Elektronenmikroskopie untersucht wurden. Die Strukturen, die daraus hervorgingen, legen das Vorhandensein verschiedener TFIIH Konformationen nahe, welche vermutlich bei den verschiedenen Aufgaben von TFIIH in der Transkription und DNA Reparatur zum Tragen kommen. Außerdem wurde mit Hilfe eines gekürzten p62 Konstrukts eine einfach zu handhabende, kostengünstige Strategie zur Lösung des kristallografischen Phasenproblems mittels Cäsiumderivatisierung entwickelt.

While the healthy brain works through balanced synaptic communication between glutamatergic and GABAergic neurons to coordinate excitation (E) and inhibition (I), disruption of E/I balance interferes with synaptic communication, information processing, and ultimately cognition. Multiple line of evidence indicates that E/I imbalance represents the pathophysiological basis of a wide spectrum of mental disorders. Genetic screening approaches have identified Cadherin-13 (CDH13). as a risk gene across neurodevelopmental and mental disorders. CDH13 regulates several cellular and synaptic processes in brain development and neuronal plasticity in adulthood. In addition to other functions, it is specifically localized at inhibitory synapses of parvalbumin- and somatostatin-expressing GABAergic neurons. In support of CDH13’s function in moderating E/I balance, electrophysiological recordings of hippocampal slices in a CDH13-deficient mouse model revealed an increase in basal inhibitory but not excitatory synaptic transmission. Moreover, the search for genetic variants impacting functional expression of the CDH13 gene identified SNP (single nucleotide polymorphism)) rs2199430 in intron 1 to be associated with differential mRNA concentrations in human post-mortem brain across the three genotypes CDH13G/G, CDH13A/G and CDH13A/A . This work therefore aimed to further validate these findings in a complementary human model by using induced pluripotent stem cells (iPSCs). The application of human iPSCs in research has replaced the use of embryonic cells, resolving the ethical conflict of destructive usage of human embryos. Investigating CDH13’s mode of action in inhibitory synapses was predicted to facilitate mechanistic insight into the effects of CDH13 gene variants on E/I network activity, which can then be targeted to reinstate balance. Genome-wide association studies have identified rare copy number variants (CNVs) resulting in a deletion (or duplication) of CDH13. To reduce genetic background variance, a set of isogenic iPSC lines with a gene dose-dependent deficiency of CDH13 (CDH13-/- and CDH13+/- ) was generated by using the Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system. These CRISPRed iPSCs carrying a single or two allele(s) with CDH13 inactivation facilitate investigation of CDH13 function in cellular processes, at inhibitory synapses and in neuronal network activity. In addition, iPSCs carrying allelic SNP rs2199430 variants were used to study the effects of common genetic variation of CDH13. These cell lines were differentiated into pure glutamatergic and GABAergic neurons and co-cultured to generate neuronal networks allowing its activity to be measured and correlated with electrophysiological signatures of differential CDH13 genotypes. The work towards assessment of neuronal network activity of the iPSC lines was subdivided into three major steps: first, generating rtTA/Ngn2 and rtTA/Ascl1-positive iPSCs via a lentivirus-mediated approach; second, differentiating pure glutamatergic and GABAergic neurons from the genetically transduced iPSCs and co-culturing of pure glutamatergic and GABAergic neurons in a pre-established ratio (65:35) by direct differentiation upon supplementation with doxycycline and forskolin on a microelectrode array (MEA) chip; and, finally, recording of neuronal network activity of iPSC lines after 49 days in vitro, followed by extraction and analyses of multiple MEA parameters. x Based on the MEA parameters, it was confirmed that complete CDH13 knockout as well as heterozygous deficiency influence E/I balance by increasing inhibition. It was further revealed that common SNP variation alters the signature of neuronal network activity. Specifically, CDH13 deficiency resulted in a significant reduction in network burst duration (NBD), reduced number of detected spikes within a network burst and reduction in network burst rate (NBR) compared to the control (CDH13G/G). CDH13A/G and CDH13A/A showed similarities with the CRISPRed CDH13-deficient networks by showing a significant reduction in the NBD and a reduced number of detected spikes within a network compared to CDH13G/G. Strikingly. there was a significant increase in the NBR of the CDH13A/G and CDH13A/A compared to CDH13G/G networks. CDH13A/G networks exhibited significant differences in both parameters. At the cellular level, this indicates that signalling pathways which determine the length and frequency of network bursts differ among allelic variants of SNP rs2199430, thus confirming functional relevance of this intronic SNP. In summary, CDH13-deficient isogenic iPSC lines were generated using CRISPR/Cas9, iPSCs were genetically transduced via a lentivirus approach, direct differentiation of glutamatergic/GABAergic neurons derived from transduced iPSCs were used to establish a scalable co-culture system, and network activity was recorded by MEA using pre-established parameters to extract and analyze activity information. The results indicate that iPSC-derived neuronal networks following CRISPR/Cas9-facilitated CDH13 inactivation, as well as networks with allelic SNP variants of CDH13, moderate E/I balance, thus advancing understanding of CDH13 function at inhibitory synapses and elucidating the effects of rare and common CDH13 gene variation. / Während das gesunde Gehirn auf der Basis einer ausgewogenen synaptischen Kommunikation zwischen glutamatergen und GABAergen Neuronen arbeitet, um Exzitation (E) und Inhibition (I) zu koordinieren, beeinträchtigt eine Störung des E/I-Gleichgewichts die synaptische Kommunikation, die Informationsverarbeitung und letztlich die Kognition. Zahlreiche Hinweise deuten darauf, dass ein eingeschränktes E/I-Gleichgewicht die pathophysiologische Grundlage eines breiten Spektrums psychischer Erkrankungen darstellt. Genetische Screening-Ansätze haben Cadherin-13 (CDH13) als Risikogen für neuropsychiatrische Erkrankungen identifiziert. CDH13 reguliert mehrere zelluläre und synaptische Prozesse bei der Gehirnentwicklung und der neuronalen Plastizität im Erwachsenenalter. Neben anderen Funktionen ist es spezifisch an hemmenden Synapsen von Parvalbumin- und Somatostatin-exprimierenden GABAergen Neuronen lokalisiert. Als Hinweis für die Funktion von CDH13 bei der Regulierung des E/I-Gleichgewichts ergaben elektrophysiologische Ableitungen von Hippocampusschnitten in einem CDH13-defizienten Mausmodell einen Anstieg der basalen inhibitorischen, nicht aber der exzitatorischen synaptischen Übertragung. Darüber hinaus wurde bei der Suche nach genetischen Varianten die sich auf die funktionelle Expression des CDH13-Gens auswirken, der SNP (single nucleotide polymorphism, Einzelbasenpolymorphismus) rs2199430 im Intron 1 identifiziert, der mit den mRNA-Konzentrationen im menschlichen post-mortem Gehirn in einer vom Genotyp CDH13G/G - CDH13A/G- und CDH13A/A-abhängigen Weise assoziiert ist. Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Ergebnisse in einem komplementären menschlichen Modell unter Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPSCs) zu bestätigen, und damit zu validieren. Die Anwendung menschlicher iPSCs in der Forschung hat embryonale Zellen ersetzt und den ethischen Konflikt aufgelöst, der im Zusammenhang mit der verbrauchenden Verwendung menschlicher Embryonen besteht. Die Untersuchung der Wirkungsweise von CDH13 in inhibitorischen Synapsen sollte einen mechanistischen Einblick in die Auswirkungen von CDH13-Genvarianten auf die Aktivität des E/I-Netzwerks ermöglichen, die dann gezielt zur Wiederherstellung des Gleichgewichts eingesetzt werden können. Genomweite Assoziationsstudien identifizierten seltene Kopienzahlvarianten (copy number variants, CNVs), die zu einer Deletion (oder Duplikation) des CDH13-Gens führen. Um die genetische Hintergrundsvarianz zu verringern, wurde mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9) eine Reihe isogener iPSC-Linien mit einem dosisabhängigen Mangel an CDH13-Gen (CDH13- /- und CDH13+/-) erzeugt. Die CRISPR-modifizierten iPSCs, bei denen CDH13 auf einem einzelnen oder zwei Allel(en) inaktiviert wurde, ermöglichen die Untersuchung der CDH13- Funktion in zellulären Prozessen, an hemmenden Synapsen und in der Aktivität neuronaler Netzwerke. Darüber hinaus wurden iPSCs, die die allelischen Varianten des SNP rs2199430 tragen, verwendet, um die Auswirkungen der häufigen genetischen Variation des CDH13- Gens zu untersuchen. Diese Zelllinien wurden zu reinen glutamatergen und GABAergen Neuronen differenziert und ko-kultiviert, um neuronale Netzwerke zu erzeugen, deren Aktivität gemessen und mit elektrophysiologischen Signaturen unterschiedlicher CDH13-Genotypen korreliert wurde. Die Arbeiten zur Bestimmung der neuronalen Netzwerkaktivität der iPSC� Linien wurden in drei Hauptschritte unterteilt: erstens die Erzeugung von rtTA/Ngn2- und xii rtTA/Ascl1-positiven iPSCs über einen Lentivirus-vermittelten Ansatz; zweitens die Differenzierung reiner glutamaterger und GABAerger Neuronen aus den genetisch transduzierten iPSCs und die Ko-Kultur reiner glutamaterger und GABAerger Neuronen in einem vorher festgelegtem Verhältnis (65: 35) durch direkte Differenzierung unter Zugabe von Doxycyclin und Forskolin auf einem Mikroelektroden-Array (MEA)-Chip; und schließlich die Aufzeichnung der neuronalen Netzwerkaktivität der iPSC-Linien nach 49 Tagen in vitro, gefolgt von der Extraktion und Analyse verschiedener MEA-Parameter. Anhand der MEA-Parameter wurde bestätigt, dass sowohl kompletter CDH13-Knockout als auch heterozygote Defizienz das E/I-Gleichgewicht durch verstärkte Inhibition beeinflussen. Darüber hinaus zeigte sich, dass häufige SNP-Variation die Signatur der neuronalen Netzwerkaktivität verändert. Insbesondere führte CDH13-Defizienz zu einer signifikanten Verringerung der Dauer der Netzwerk-Bursts (NBD), einer geringeren Anzahl von erkannten Spikes innerhalb eines Netzwerk-Bursts und einer signifikanten Verringerung der Netzwerk� Burst-Rate (NBR) im Vergleich zur Kontrolle (CDH13G/G). CDH13A/G und CDH13A/A wiesen Ähnlichkeiten mit den CRISPR-modifizierten CDH13-defizienten Netzwerken auf, indem sie im Vergleich zu CDH13G/G eine signifikante Verringerung der NBD und eine geringere Anzahl von erkannten Spikes innerhalb eines Netzwerks aufwiesen. Auffallend war eine signifikante Zunahme der NBR in den CDH13A/G- und CDH13A/A-Netzwerken im Vergleich zu den CDH13G/G-Netzwerken. CDH13A/G-Netzwerke wiesen bei beiden Parametern signifikante Unterschiede auf. Auf zellulärer Ebene deutet dies darauf hin, dass sich die Signalwege, die die Länge und Häufigkeit von Netzwerk-Bursts bestimmen, zwischen den allelischen Varianten des SNP rs2199430 unterscheiden, was die funktionelle Bedeutung dieses intronischen SNP bestätigt. Zusammenfassend wurden CDH13-defiziente isogene iPSC-Linien mit CRISPR/Cas9 erzeugt, iPSCs wurden mit Hilfe eines Lentivirus-Ansatzes genetisch transduziert, direkte Differenzierung von glutamatergen/ GABAergen Neuronen, die von transduzierten iPSCs abgeleitet wurden, wurden verwendet, um ein skalierbares Ko-Kultursystem zu etablieren. Die Netzwerkaktivität wurde mit MEA aufgezeichnet, wobei zuvor festgelegte Parameter verwendet wurden, um Aktivitätsinformationen zu extrahieren. Die Ergebnisse zeigen, dass iPSC-abgeleitete neuronale Netzwerke nach CRISPR/Cas9-vermittelten CDH13-Inaktivierung sowie Netzwerke mit allelischen SNP-Varianten von CDH13 das E/I-Gleichgewicht beeinflussen, was das Verständnis der CDH13-Funktion an hemmenden Synapsen fördert und die Auswirkungen seltener und häufiger CDH13-Genvariationen aufklärt.

Using viruses to treat cancer is a novel approach to an age-old disease. Oncolytic viruses are native or recombinant viruses that have the innate or enhanced capability to infect tumour cells, replicate within the tumour microenvironment and subsequently lyse those cells. One representative, the vaccinia virus (VACV), belongs to the orthopoxvirus genus of the Poxviridae family. GLV-1h68, a recombinant and attenuated vaccinia virus devel- oped by the Genelux Corporation, is a member of this family currently being tested in various phase I/II clinical trials under the name GL-ONC1. It has been shown to specif- ically replicate in tumour cells while sparing healthy tissue and to metabolise prodrug at or transport immunological payloads to the site of affliction. Since imaging modalities offer little insight into viral replication deep within the body, and because oncolytic virotherapy is dependent on replication within the target tissue, the need for a monitoring system is evident. Pharmacokinetic analysis of this oncolytic agent was to give insight into the dynamics present in tumours during treatment. This, in turn, would give clinicians the opportunity to monitor the efficacy as early as possible after the onset of treatment, to observe treatment progression and possibly to gauge prognosis, without resorting to invasive procedures, e.g. biopsies. A criteria for viable biomarkers was that it had to be directly dependent on viral replica- tion. Ideally, a marker for treatment efficacy would be specific to the treatment modality, not necessarily the treatment type. Such a marker would be highly detectable (high sen- sitivity), specific for the treatment (high specificity), and present in an easily obtained specimen (blood). Taking this into consideration, the biomarkers were chosen for their potential to be indicators of viral replication. Thus, the biomarkers analysed in this thesis are: the native proteins expressed by the viral genes A27L and B5R, the virally encoded recombinant proteins β-galactosidase, β-glucuronidase, green fluorescent protein (GFP), carboxypeptidase G2 (CPG2) and carcinoembryonic antigen (CEA). Each marker is under the control of one of five different promoters present. All recombinant viruses used in this thesis express A27L, B5R, GFP and β-glucuronidase and all are derived from the parental virus GLV-1h68. In addition to these markers, GLV-1h68 expresses β-galactosidase; GLV-1h181 expresses CPG2. [...] / Onkolytische Viren sind natu ̈rliche oder rekombinante Viren, die die angeborene oder erworbene F ̈ahigkeit besitzen, Tumorzellen zu infizieren, sich in ihnen zu replizieren und anschließend diese Zellen zu lysieren. Ein Vertreter dieser Viren, das Vaccinia-Virus (VACV) geho ̈rt zu der Gattung der Orthopoxviren der Familie der Poxviridae. GLV- 1h68 ist ein von der Fa. Genelux entwickelter, rekombinant attenuierter Vaccinia-Virus Stamm (rVACV). Er hat die nachgewiesene Fa ̈higkeit, ausschließlich in Tumorzellen zu replizieren und dabei gesundes Gewebe zu verschonen. Viren dieses Stamms k ̈onnen auch sogenannte Prodrugs lokal am Tumor metabolisieren und/oder immunologische Payloads in die Tumorzellen einschleusen. Die Effizienz von GLV-1h68 (auch bezeichnet als GL- ONC1) wird zurzeit in mehreren klinischen Studien der Phase I/II getestet. Da die derzeitigen bildgebenden Verfahren wenig Aufschluss u ̈ber die virale Replikation und damit den therapeutischen Effekt des Virus geben, ist es dringend notwendig, eine Methode zu entwickeln, die Virusreplikation anhand von Blutproben und nicht-invasiver Untersuchungsmethoden nachzuweisen. Eine pharmakokinetische Analyse des Virus sollte Informationen u ̈ber die Dynamik geben, die sich w ̈ahrend der Therapie im Tumorinneren manifestiert. Dies gibt wiederum den behandelnden A ̈rzten die Mo ̈glichkeit, sowohl den Fortschritt also auch den Erfolg der Therapie im Patienten zu verfolgen. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene biologische Merkmale des Virus auf ihr Potenzial als Indikator fu ̈r die Virusreplikation getestet. Ein biologisches Merkmal kann als ein sogenannter Biomarker der Virustherapie ange- sehen werden, wenn dessen Expression in direkter Abha ̈ngigkeit zur viralen Replikation steht. Zusammen mit der Voraussetzung, im Blut einfach und spezifisch nachweisbar zu sein, kommen folglich bei der onkolytischen Virotherapie nur Proteine in Frage, die viral kodiert sind. Die Biomarker, die im Rahmen der oben genannten Problematik in dieser Arbeit diskutiert wurden, sind das exprimierte Protein des A27L-Gens, das B5R- exprimierte Glykoprotein, β-Galaktosidase (β-Gal), β-Glukuronidase (β-Glc), das gru ̈n- fluoreszierende Protein (GFP), Carboxypeptidase G2 (CPG2) und das carcinoembryonale Antigen (CEA). [...]

GAS2L3 was identified recently as a target gene of the DREAM complex (Reichert et al., 2010; Wolter et al., 2012). It was shown that GAS2L3 is expressed in a cell cycle specific manner and that depletion of the protein leads to defects in cytokinesis and genomic instability (Wolter et al., 2012). Major aim of this thesis was, to further characterize the biochemical properties and physiological function of GAS2L3. By in vitro co-sedimentation and bundling assays, GAS2L3 was identified as a cytoskeleton associated protein which bundles, binds and crosslinks F-actin and MTs. GST pulldown assays and co-immunoprecipitation experiments revealed that GAS2L3 interacts in vitro and in vivo with the chromosomal passenger complex (CPC), a very important regulator of mitosis and cytokinesis, and that the interaction is mediated by the GAR domain of GAS2L3 and the C-terminal part of Borealin and the N-terminal part of Survivin. Kinase assays showed that GAS2L3 is not a substrate of the CPC but is strongly phosphorylated by CDK1 in vitro. Depletion of GAS2L3 by shRNA influenced protein stability and activity of the CPC. However pharmacological studies showed that the decreased CPC activity is not responsible for the observed cytokinesis defects upon GAS2L3 depletion. Immunofluorescence experiments revealed that GAS2L3 is localized to the constriction zone by the CPC in a GAR dependent manner and that the GAR domain is important for proper protein function. New interacting proteins of GAS2L3 were identified by stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) in combination with tandem affinity purification and subsequent mass spectrometrical analysis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the obtained mass spectrometrical data. To address the physiological function of GAS2L3 in vivo, a conditional and a non-conditional knockout mouse strain was established. The non-conditional mouse strain showed a highly increased mortality rate before weaning age probably due to heart failure. The physiological function of GAS2L3 in vivo as well as the exact reason for the observed heart phenotype is not known at the moment. / GAS2L3 wurde vor kurzem als Zielgen des DREAM Komplex identifiziert (Reichert et al., 2010; Wolter et al., 2012). Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von GAS2L3 Zellzyklus abhängig reguliert wird und dass Depletion des Proteins zu Fehlern in der Zytokinese und genomischer Instabilität führt (Wolter et al., 2012). Hauptziel dieser Doktorarbeit war es, GAS2L3 hinsichtlich seiner biochemischen Eigenschaften und physiologischer Funktion näher zu charakterisieren. Unter Verwendung verschiedener in vitro Experimente konnte gezeigt werden, dass GAS2L3 sowohl F-Aktin als auch Mikrotubuli binden, bündeln und quervernetzen kann. In vitro und in vivo Protein-Protein Interaktionsexperimente zeigten, dass GAS2L3 mit dem „chromosomal passenger complex“ (CPC), einem wichtigen Mitose- und Zytokineseregulator, interagiert und dass diese Interaktion durch die GAR Domäne von GAS2L3 und den C-Terminus von Borealin beziehungsweise den N-terminus von Survivin vermittelt wird. Phosphorylierungsexperimente zeigten deutlich, dass GAS2L3 kein Substrat des CPC ist, jedoch von CDK1 phosphoryliert wird. Zellbiologische Experimente belegten, dass Depletion von GAS2L3 mittels shRNA die Proteinstabilität und Aktivität des CPC beeinflusst. Experimente mit einem chemischen Aurora B Inhibitor dokumentierten, dass die verringerte CPC Aktivität nicht die Ursache der beobachteten Zytokinesefehler nach GAS2L3 Depletion ist. Immunfluoreszenzexperimente machten deutlich, dass GAS2L3 mit Hilfe des CPC an der Abschnürungszone lokalisiert wird und dass die Lokalisation abhängig von der GAR Domäne erfolgt. Mit Hilfe von SILAC in Kombination mit Tandem-Affinitätsaufreinigung und anschließender massenspektrometrischer Auswertung wurden neue Proteininteraktoren von GAS2L3 identifiziert. Protein-Protein Interaktionsexperimente bestätigten die massenspektrometrisch ermittelten Daten. Um die physiologische Funktion von GAS2L3 in vivo näher analysieren zu können, wurden verschiedene Knockout Mauslinien etabliert. Die nicht-konditionelle Mauslinie zeigte erhöhte Sterblichkeit vor dem Absetzalter wahrscheinlich verursacht durch Herzversagen. Die genaue physiologische Funktion von GAS2L3 und der Grund für den beobachteten Herzphänotyp sind momentan noch unbekannt.

Several important cellular processes, including transcription, nucleotide excision repair and cell cycle control are mediated by the multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these pathways. This becomes especially important in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in some of the TFIIH subunits. In an attempt to structurally characterize the TFIIH complex, we harnessed the qualities of the eukaryotic thermophile Chaetomium thermophilum, a remarkable fungus, which has only recently been recognized as a novel model organism. Homologues of TFIIH from C. thermophilum were expressed in E. coli, purified to homogeneity and subsequently utilized for crystallization trials and biochemical studies. The results of the present work include the first crystal structure of the p34 subunit of TFIIH, comprising the N-terminal domain of the protein. The structure revealed a von Willebrand Factor A (vWA) like fold, which is generally known to be involved in a multitude of protein-protein interactions. Structural comparison allowed to delineate similarities as well as differences to already known vWA domains, providing insight into the role of p34 within TFIIH. These results indicate that p34 assumes the role of a structural scaffold for other TFIIH subunits via its vWA domain, while likely serving additional functions, which are mediated through its C-terminal zinc binding domain and are so far unknown. Within TFIIH p34 interacts strongly with the p44 subunit, a positive regulator of the XPD helicase, which is required for regulation of RNA Polymerase II mediated transcription and essential for eukaryotic nucleotide excision repair. Based on the p34 vWA structure putative protein-protein interfaces were analyzed and binding sites for the p34 p44 interaction suggested. Continuous crystallization efforts then led to the first structure of a p34 p44 minimal complex, comprising the N-terminal vWA domain of p34 and the C-terminal C4C4 RING domain of p44. The structure of the p34 p44 minimal complex verified the previous hypothesis regarding the involved binding sites. In addition, careful analysis of the complex interface allowed to identify critical residues, which were subsequently mutated and analyzed with respect to their significance in mediating the p34 p44 interaction, by analytical size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The structure of the p34 p44 complex also revealed a binding mode of the p44 C4C4 RING domain, which differed from that of other known RING domains in several aspects, supporting the hypothesis that p44 contains a novel variation of this domain. / Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Transkription, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die Kontrolle des Zellzyklus sind abhängig vom vielschichtigen Zusammenspiel der zehn Protein-Untereinheiten des allgemeinen Transkriptionsfaktors II H (TFIIH). Zur Aufklärung der genauen Funktion dieses Komplexes ist ein besseres Verständnis seiner molekularen Struktur essentiell. Besondere Bedeutung erhält der TFIIH dabei im Hinblick auf verschiedene schwerwiegende Krankheiten, wie z.B. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Trichothiodystrophie (TTD), die als Folge von einzelnen Punkt-Mutationen in bestimmten Untereinheiten des Komplexes entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden zur strukturellen Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 die homologen Proteine aus Chaetomium thermophilum verwendet. Hierbei handelt es sich um einen eukaryotischen und thermophilen Pilz, der erst kürzlich als neuer und vielversprechender Modellorganismus an Bedeutung gewann. Die TFIIH Homologe aus C. thermophilum wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und anschließend für Kristallisations-Versuche eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Proteine mittels verschiedener biochemischer Verfahren analysiert. Die erzielten Resultate beinhalten unter anderem die erste Kristall-Struktur der p34 Untereinheit des TFIIH und zeigen eine von Willebrand Faktor A (vWA) ähnliche Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins. Vergleiche mit bereits bekannten vWA Proteinen liefern Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede und erlauben erste Einblicke in die Funktion der p34 Untereinheit innerhalb des TFIIH Komplexes. Die gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass p34 über seine vWA Domäne anderen TFIIH Untereinheiten als strukturelles Gerüst dient, während die C-terminale Zinkfinger-Domäne des Proteins sehr wahrscheinlich zusätzliche Aufgaben übernimmt, die bisher noch nicht genau bekannt sind. Innerhalb des TFIIH Komplexes ist p34 eng mit der p44 Untereinheit assoziiert. Letztere ist als positiver Regulator der XPD Helikase bekannt, die im Rahmen der RNA Polymerase II vermittelten Transkription und der eukaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatur eine entscheidende Rolle spielt. Basierend auf der erzielten p34ct vWA Struktur wurden verschiedene Interaktions-Flächen zwischen p34 und p44 analysiert und mögliche Bindestellen für die beiden Proteine ermittelt. Weitere Kristallisations-Experimente ermöglichten schließlich die Aufklärung der Struktur eines p34 p44 Minimal-Komplexes, bestehend aus der N-terminalen vWA Domäne von p34 und der C-terminalen C4C4 RING Domäne von p44. Die gewonnenen Struktur-Daten bestätigten die zuvor ermittelte Bindestelle der beiden Proteine. Eine genauere Untersuchung der Kontakt-Fläche zwischen p34 und p44 lieferte darüber hinaus entscheidende Hinweise auf besonders wichtige Interaktions-Bereiche und Aminosäuren, die im Folgenden mutiert wurden, um deren Bedeutung für die Komplexbildung zu ermitteln. Mit Hilfe der analytischen Größenausschluss-Chromatographie, elektro-phoretischer Mobilitäts-Verlagerungs-Assays und isothermaler Titrations-Kalorimetrie konnten hierbei verschiedene Aminosäuren identifiziert werden, die für eine stabile p34 p44 Interaktion erforderlich sind. Ferner zeigte die Struktur des p34 p44 Minimal-Komplexes eine Bindungsweise der p44 C4C4 RING Domäne, die sich von der anderer, bereits bekannter RING Domänen in verschiedenen Punkten unterschied. Diese Erkenntnis bestätigt die zuvor aufgestellte Hypothese, dass es sich im Falle von p44 um eine neue Variante der bereits gut charakterisierten RING Domäne handelt.

The propagation of the genetic information into proteins is mediated by messenger- RNA (mRNA) intermediates. In eukaryotes mRNAs are synthesized by RNA- Polymerase II and subjected to translation after various processing steps. Earlier it was suspected that the regulation of gene expression occurs primarily on the level of transcription. In the meantime it became evident that the contribution of post- transcriptional events is at least equally important. Apart from non-coding RNAs and metabolites, this process is in particular controlled by RNA-binding proteins, which assemble on mRNAs in various combinations to establish the so-called “mRNP- code”. In this thesis a so far unknown component of the mRNP-code was identified and characterized. It constitutes a hetero-trimeric complex composed of the Tudor domain-containing protein 3 (TDRD3), the fragile X mental retardation protein (FMRP) and the Topoisomerase III beta (TOP3β) and was termed TTF (TOP3β-TDRD3-FMRP) -complex according to its composition. The presented results also demonstrate that all components of the TTF-complex shuttle between the nucleus and the cytoplasm, but are predominantly located in the latter compartment under steady state conditions. Apart from that, an association of the TTF-complex with fully processed mRNAs, not yet engaged in productive translation, was detected. Hence, the TTF-complex is a component of „early“ mRNPs. The defined recruitment of the TTF-complex to these mRNPs is not based on binding to distinct mRNA sequence-elements in cis, but rather on an interaction with the so-called exon junction complex (EJC), which is loaded onto the mRNA during the process of pre-mRNA splicing. In this context TDRD3 functions as an adapter, linking EJC, FMRP and TOP3β on the mRNP. Moreover, preliminary results suggest that epigenetic marks within gene promoter regions predetermine the transfer of the TTF-complex onto its target mRNAs. Besides, the observation that TOP3β is able to catalytically convert RNA-substrates disclosed potential activities of the TTF-complex in mRNA metabolism. In combination with the already known functions of FMRP, this finding primarily suggests that the TTF-complex controls the translation of bound mRNAs. In addition to its role in mRNA metabolism, the TTF-complex is interesting from a human genetics perspective as well. It was demonstrated in collaboration with researchers from Finland and the US that apart from FMRP, which was previously linked to neurocognitive diseases, also TOP3β is associated with neurodevelopmental disorders. Understanding the function of the TTF-complex in mRNA metabolism might hence provide important insight into the etiology of these diseases. / Die Umwandlung der genetischen Information in Proteine erfolgt über Boten-RNA (mRNA) -Intermediate. Diese werden in Eukaryonten durch die RNA-Polymerase II gebildet und nach diversen Prozessierungs-Schritten der Translationsmaschinerie zugänglich gemacht. Während man früher davon ausging, dass die Genexpression primär auf der Ebene der Transkription reguliert wird, ist heute klar, dass post- transkriptionelle Prozesse einen ebenso wichtigen Beitrag hierzu leisten. Neben nicht-kodierenden RNAs und Metaboliten tragen insbesondere RNA- Bindungsproteine zur Kontrolle dieses Vorgangs bei. Diese finden sich in unterschiedlichen Kombinationen auf den mRNAs zusammen und bilden dadurch den sog. „mRNP-Code“ aus. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine bislang unbekannte Komponente des mRNP-Codes identifiziert und charakterisiert. Es handelt es sich dabei um einen hetero-trimeren Komplex, welcher aus dem Tudor Domänen Protein 3 (TDRD3) dem Fragilen X Mentalen Retardations-Protein (FMRP) sowie der Topoisomerase III beta (TOP3β) besteht. Aufgrund seiner Zusammensetzung wurde dieser TTF (TOP3β-TDRD3-FMRP) -Komplex genannt. In der vorliegenden Arbeit konnte der Nachweis geführt werden, dass sämtliche Komponenten des TTF-Komplexes zwischen Zellkern und Cytoplasma pendeln, unter Normalbedingungen jedoch vornehmlich im Cytoplasma lokalisiert sind. Des Weiteren ließ sich eine Assoziation des TTF-Komplexes mit mRNAs nachweisen, die zwar vollständig prozessiert, jedoch noch nicht Teil der produktiven Phase der Translation sind. Der TTF-Komplex ist somit eine Komponente „früher“ mRNPs. Die Rekrutierung des TTF-Komplexes an definierte mRNPs wird nicht durch Bindung an spezifische mRNA-Sequenzelemente bedingt, sondern basiert auf einer Interaktion mit dem sog. Exon Junction Complex (EJC), welcher im Kontext des pre-mRNA Spleißens auf die mRNA geladen wird. Hierbei spielt TDRD3 als Adapter zwischen dem EJC, FMRP und TOP3β die entscheidende Rolle. Präliminäre Experimente legen darüber hinaus den Schluss nahe, dass epigenetische Markierungen im Promotor-Bereich distinkter Gene von entscheidender Bedeutung für den Transfer des TTF-Komplexes auf dessen Ziel-mRNAs sind. Einen wichtigen ersten Hinweis auf die potentielle Funktion des TTF-Komplexes im Kontext des mRNA Metabolismus erbrachte die Beobachtung, dass TOP3β in der Lage ist RNA katalytisch umzusetzen. Dieser Befund lässt in Verbindung mit den bereits beschriebenen Aktivitäten von FMRP vermuten, dass der TTF-Komplex die Translation gebundener mRNAs kontrolliert. Zusätzlich zu seiner Rolle im mRNA Metabolismus ist der TTF-Komplex auch aus humangenetischer Sicht hoch interessant. So konnte in Zusammenarbeit mit finnischen und US-amerikanischen Forschern gezeigt werden, dass neben FMRP, einem bekannten Krankheitsfaktor neurokognitiver Syndrome, auch TOP3β mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert ist. Das Verständnis der Funktion des TTF-Komplexes im mRNA Metabolismus könnte daher wichtige Einblicke in die Etiologie dieser Krankheiten liefern.

In mammals, KSR1 functions as an essential scaffold that coordinates the assembly of RAF/MEK/ERK complexes and regulates intracellular signal transduction upon extracellular stimulation. Aberrant activation of the equivalent MAPK signaling pathway has been implicated in multiple human cancers and some developmental disorders. The mechanism of KSR1 regulation is highly complex and involves several phosphorylation/dephosphorylation steps. In the present study, a number of novel in vivo phosphorylation sites were detected in mKSR1 by use of mass spectrometry analysis. Among others, Tyr728 was identified as a unique regulatory residue phosphorylated by LCK, a Src kinase family member. To understand how phosphorylation of Tyr728 may regulate the function of KSR1 in signal transduction and cellular processes, structural modeling and biochemical studies were integrated in this work. Computational modeling of the mKSR1(KD) protein structure revealed strong hydrogen bonding between phospho-Tyr728 and the residues surrounding Arg649. Remarkably, this pattern was altered when Tyr728 was non-phosphorylated or substituted. As confirmed by biochemical analysis, Arg649 may serve as a major anchor point for phospho-Tyr728 in order to stabilize internal structures of KSR1. In line with the protein modeling results, mutational studies revealed that substitution of Tyr728 by phenylalanine leads to a less compact interaction between KSR1 and MEK, a facilitated KSR1/B-RAF binding and an increased phosphorylation of MEK in complex with KSR1. From these findings it can be concluded that phospho-Tyr728 is involved in tightening the KSR1/MEK interaction interface and in regulating the phosphorylation of KSR1-bound MEK by either RAF or KSR1 kinases. Beside the Tyr728, Ser722 was identified as a novel regulatory phosphorylation site. Amino acid exchanges at the relevant position demonstrated that Ser722 regulates KSR1-bound MEK phosphorylation without affecting KSR1/MEK binding per se. Due to its localization, Ser722 might consequently control the catalytic activity of KSR1 by interfering with the access of substrate (possibly MEK) to the active site of KSR1 kinase. Together with Ser722, phosphorylated Tyr728 may further positively affect the kinase activity of KSR1 as a consequence of its vicinity to the activation and catalytic loop in the KSR1(KD). As revealed by structural modeling, phospho-Tyr728 builds a hydrogen bond with the highly conserved Lys685. Consequently, phospho-Tyr728 has a stabilizing effect on internal structures involved in the catalytic reaction and possibly enhances the phosphate transfer within the catalytic cleft in KSR1. Considering these facts, it seems very likely that the LCK-dependent phosphorylation of Tyr728 plays a crucial role in the regulation of KSR1 catalytic activity. Results of fractionation and morphology analyses revealed that KSR1 recruits LCK to cytoskeleton for its phosphorylation at Tyr728 suggesting that this residue may regulate cytoskeleton dynamics and, consequently, cell motility. Beside that, phosphorylation of Tyr728 is involved in the regulation of cell proliferation, as shown by a significantly reduced population doubling time of KSR1-Y728F cells compared to cells expressing wild type KSR1. Taken together, tyrosine phosphorylation in KSR1 uncovers a new link between Src family kinases and MAPK signaling. Tyr728, the novel regulatory phosphorylation site in murine KSR1, may coordinate the transition between the scaffolding and the catalytic function of KSR1 serving as a control point used to fine-tune cellular responses. / KSR1 fungiert bei Säugetieren als zentrales Gerüstprotein, welches die Anordnung von RAF/MEK/ERK-Komplexen koordiniert und die intrazelluläre Signalweiterleitung nach extrazellulärer Stimulation reguliert. Eine abweichende Aktivierung des entsprechenden MAPK-Signalwegs wurde mit vielen humanen Krebsformen und einigen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht. Der Mechanismus der KSR1-Regulierung ist hochgradig komplex und involviert mehrfach Schritte der Phosphorylierung/Dephosphorylierung. In der vorliegenden Studie wurden etliche neue in-vivo-Phosphorylierungsstellen in mKSR1 mittels massenspektrometrischer Analyse entdeckt. Neben anderen wurde Tyr728 als besonderer regulatorischer Rest identifiziert, welcher durch LCK, einem Mitglied der Src-Kinase-Familie, phosphoryliert wird. Um zu verstehen wie die Phosphorylierung von Tyr728 die Funktion von KSR1 innerhalb der Signalweiterleitung und zellulärer Prozesse regulieren könnte, wurden strukturelle Modellierungen und biochemische Untersuchungen in diese Arbeit integriert. Die Computermodellierung der mKSR1(KD)-Proteinstruktur zeigte starke Wasserstoff- brückenbindungen zwischen Phospho-Tyr728 und den Resten in der Umgebung von Arg649 auf. Dieses Muster war auffällig verändert, wenn Tyr728 nicht phosphoryliert oder substituiert war. Wie anhand biochemischer Analyse untermauert wurde, könnte Arg649 für phospho-Tyr728 als Hauptankerpunkt dienen, um interne Strukturen in KSR1 zu stabilisieren. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Proteinmodellierung enthüllten die Mutationsstudien, dass die Substitution von Tyr728 mit Phenylalanin zu einer weniger kompakten Interaktion zwischen KSR1 und MEK, einer erleichterten KSR1/B-RAF-Bindung und einer ansteigenden Phosphorylierung von MEK im Komplex mit KSR1 führt. Anhand dieser Erkenntnisse kann man rückschließen, dass Phospho-Tyr728 in die Verstärkung der Interaktionen innerhalb der KSR1/MEK-Grenzfläche und in die Regulierung der Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK durch entweder RAF- oder KSR1-Kinasen involviert ist. Neben Tyr728 wurde Ser722 als eine neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle identifiziert. Aminosäureaustausche an der betreffenden Position demonstrierten, dass Ser722 die Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK reguliert ohne die KSR1/MEK-Bindung selbst zu beeinträchtigen. Bedingt durch seine Lokalisierung könnte Ser722 folglich die katalytische Aktivität von KSR1 kontrollieren, indem es den Zugang des Substrates (möglicherweise MEK) zur aktiven Seite der KSR1-Kinase behindert. Zusammen mit Ser722 könnte phosphoryliertes Tyr728 ferner die Kinaseaktivität von KSR1 positiv beeinflussen, infolge von dessen Nähe zur Aktivierungs- und katalytischen Schleife in der KSR1(KD). Wie mittels Strukturmodellierung offengelegt wurde, bildet Phospho-Tyr728 eine Wasserstoffbrücke mit dem hochgradig konservierten Lys685 aus. Folglich hat Phospho-Tyr728 einen stabilisierenden Effekt auf interne Strukturen, welche in die katalytische Reaktion involviert sind, und erleichtert möglicherweise den Phosphattransfer innerhalb der katalytischen Spalte in KSR1. In Anbetracht dieser Fakten scheint es sehr wahrscheinlich, dass die LCK-abhängige Phosphorylierung von Tyr728 eine äußerst wichtige Rolle in der Regulierung der katalytischen Aktivität von KSR1 spielt. Die Ergebnisse der Fraktionierungs- und Morphologieanalysen enthüllten, dass KSR1 für die Phosphorylierung an Tyr728 LCK zum Zytoskelett rekrutiert, was darauf hindeutet, dass dieser Rest die Dynamik des Zytoskeletts und folglich Zellmotilität regulieren könnte. Darüber hinaus ist die Phosphorylierung von Tyr728 in die Regulierung der Zellproliferation involviert, wie anhand einer bedeutend reduzierten Populationsverdopplungszeit von KSR1-Y728F-Zellen im Vergleich zu Zellen, welche wildtypisches KSR1 exprimieren, gezeigt wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Tyrosin-Phosphorylierung in KSR1 eine neue Verknüpfung zwischen Kinasen der Src-Familie und der MAPK-Signalwirkung enthüllt. Tyr728, die neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle in Maus-KSR1, könnte den Übergang zwischen der Gerüst- und der katalytischen Funktion von KSR1 koordinieren und damit als Kontrollpunkt dienen, um zelluläre Reaktionen fein abzustimmen.

Durch die Spleißreaktion werden nicht-kodierende Sequenzelemente (Introns) aus eukaryotischen Vorläufer-mRNAs entfernt und die kodierenden Sequenzelemente (Exons) miteinander zu einem offenen Leserahmen verbunden. Dieser zentrale Prozessierungsschritt während der eukaryotischen Genexpression wird durch das Spleißosom katalysiert, das aus den vier kleinen nukleären Ribonucleoproteinpartikeln (snRNPs) U1, U2, U4/U6 und U5, sowie einer Vielzahl weiterer Proteinfaktoren gebildet wird. Alle snRNPs besitzen eine gemeinsame ringförmige Kernstruktur, die aus sieben gemeinsamen Sm-Proteinen (SmB/B‘-D1-D2-D3-E-F-G) besteht, die ein einzelsträngiges Sequenzmotiv auf der snRNAs binden. Während sich diese, als Sm-Core-Domäne bezeichnete Struktur in vitro spontan ausbilden kann, erfolgt die Zusammenlagerung in vivo in einem assistierten und hochregulierten Prozess. Dieser ist abhängig von insgesamt mindestens 12 trans-agierenden Faktoren, die in den PRMT5- und SMN-Komplexen organisiert sind. Der PRMT5-Komplex agiert in der frühen Phase der Zusammenlagerung, indem er die Sm-Proteine durch die Untereinheit pICln rekrutiert und die symmetrische Methylierung von Argininresten in den C terminalen Schwänzen von SmB/B‘, SmD1 und SmD3 katalysiert. Als Resultat dieser frühen Phase befinden sich die Sm-Proteine SmD1-D2-E-F-G und SmB/B‘-D3 in zwei getrennten und durch pICln organisierten Komplexen. Während SmB/B‘-D3-pICln am PRMT5-Komplex gebunden bleibt, existiert der zweite Komplex als freies Intermediat mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S. Diese Intermediate können nicht mit RNA assoziieren, sodass für die Fortsetzung des Zusammenlagerungsprozesses die Interaktion der Sm-Proteine mit pICln aufgelöst werden muss. Dies geschieht in der späten Phase der Sm-Core-Zusammenlagerung, in der die Sm-Proteine vom SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) übernommen werden und pICln dissoziiert wird. Dadurch werden die Sm-Proteine für ihre Interaktion mit der snRNA aktiviert und können auf die Sm-Bindestelle transferiert werden, wodurch die Formierung des Sm-Core abgeschlossen wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe einer Kombination röntgenkristallographischer und elektronenmikroskopischer Methoden zwei wichtige Intermediate dieses Zusammenlagerungs-prozesses strukturbiologisch charakterisiert werden. Bei diesen Intermediaten handelt es sich um den 6S-Komplex, sowie um ein Sm-Protein-Transferintermediat mit einem Sedimentations-koeffizienten von 8S. In diesem ist der 6S-Komplex an zwei zentrale Untereinheiten des SMN-Komplexes (SMN und Gemin2) gebunden, während pICln den Komplex noch nicht verlassen hat. Der 8S-Komplex stellt daher ein „gefangenes“ Intermediat zwischen der frühen und späten Phase der Zusammenlagerung dar. Zunächst gelang es eine erste Kristallform des rekombinant hergestellten 8S-Komplexes zu erhalten, die jedoch keine Strukturlösung erlaubte. Durch eine kombinierte Optimierung der Kristallisationsbedingung und der verwendeten Proteine wurde eine weitere ähnliche Kristallform erhalten, mit der die Kristallstruktur des 8S-Komplexes gelöst werden konnte. Die Kristallisation des 6S-Komplexes gelang im Anschluss auf Basis der Hypothese, dass Kristalle beider Komplexe aufgrund der kompositionellen Verwandtschaft zwischen 6S und 8S auch Ähnlichkeiten in der Architektur ihrer Kristallgitter aufweisen könnten. Daher wurden innerhalb von pICln gezielt Aminosäuren substituiert, die sich innerhalb von Kristallkontakten der 8S-Kristalle befanden und konformationell eingeschränkt waren. Mit entsprechend rekonstituierten 6S-Präparationen konnten dann zwei Kristallformen erzeugt werden, die eine Strukturlösung des 6S-Komplexes ermöglichten. Durch die Kristallstruktur des 6S-Komplexes konnte für pICln eine strukturelle Mimikry der Sm-Proteine identifiziert werden. Diese ermöglicht eine Bindung der Sm-Proteine und eine frühzeitige topologische Organisation des Sm-Pentamers D1-D2-F-E-G in einer geschlossenen hexameren Ringstruktur. Die Kristallstruktur des 8S-Komplexes zeigt, wie der SMN-Komplex über Gemin2 an das Sm-Pentamer bindet. In Kombination mit einer EM-Struktur des 8S-Komplexes gelang es weiterhin, einen plausiblen Mechanismus für die Elimination von pICln und die Aktivierung der Sm-Proteine für die snRNA-Bindung zu formulieren. Somit konnten diese Arbeiten zu einem besseren Verständnis der Funktionen von trans-agierenden Faktoren bei Zusammenlagerung von RNA-Protein-Komplexen in vivo beitragen. / Splicing is the process in which non-coding sequence elements (introns) are removed from eukaryotic pre-mRNAs and coding sequence elements (exons) are linked to an open reading frame. This central step in eukaryotic gene expression is catalyzed by the spliceosome, which is composed of the four small nuclear Ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4/U6, U5 and a large number of additional protein factors. The snRNPs possess a common ring-shaped core structure that is formed by the seven Sm proteins (SmB/B’-D1-D2-D3-E-F-G) around a single-stranded sequence (Sm site) of the snRNAs. While this so-called Sm core domain forms spontaneously in vitro, its assembly is a highly regulated and assisted process in vivo. It is dependent on the action of at least 12 trans-acting factors which are organized in the PRMT5 and SMN complexes. The PRMT5 is active in the early phase of assembly and recruits the Sm proteins via its pICln subunit and catalyzes the symmetrical di methylation of arginine residues in the C-terminal tails of SmB/B’, SmD1 and SmD3. As a result of the early phase the Sm proteins SmD1-D2-E-F-G and SmB/B’-D3 are organized by pICln in two distinct complexes. While SmB/B’-D3 remains bound to the PRMT5 complex, the second complex exists as a free intermediate with a sedimentation coefficient of 6S. These intermediates cannot associate with RNA and the interaction of the Sm proteins with pICln has to be resolved for the assembly process to be continued. This happens in the late phase of Sm core assembly in which the Sm proteins are taken over by the SMN complex and pICln is dissociated. Afterwards the Sm proteins can be transferred onto the Sm site of the snRNA and the Sm core is formed. As part of this thesis two key intermediates of this assembly process could structurally be characterized by a combination of crystallographic and electron microscopic methods. These intermediates comprise the 6S complex and an Sm protein transfer-intermediate with a sedimentation coefficient of 8S. In this 8S complex the 6S complex is bound to two central subunits of the SMN complex (SMN and Gemin2) while pICln is still associated with the Sm proteins. Hence, this complex represents a trapped intermediate between the early and late phase of assembly. In the beginning a first crystal form of a recombinantly prepared 8S complex was obtained that did not allow the solution of the structure. By a combined optimization of the crystallization condition and the proteins a further similar crystal form was obtained that allowed for the solution of the 8S crystal structure. The crystallization of the 6S complex could successfully be accomplished based on the hypothesis that the lattices of crystals of both complexes might show an architectural similarity because of the similar composition of the complexes. Hence, amino acids of pICln that were conformationally restricted within crystal contacts of the 8S crystals were targeted for substitution to alanine. 6S preparations reconstituted with these proteins yielded two new crystal forms that allowed for the structure solution of the 6S complex. Based on the crystal structure of the 6S complex a structural mimicry of Sm proteins by pICln was revealed. This enables binding of the Sm proteins by pICln which is the basis for an early topological organisation of the Sm Pentamer D1-D2-F-E-G within a closed hexameric ring structure. The crystal structure of the 8S complex revealed how the SMN complex binds to the Sm Pentamer via its Gemin2 subunit. In combination with an EM structure of the 8S complex both structures revealed a plausible mechanism for the elimination of pICln and the activation of the Sm proteins for snRNA binding. The solution of both structures helps to better understand the function of trans-acting factors during the in vivo assembly of RNA-protein complexes.

G-quadruplex structures are highly stable alternative DNA structures that can, when not properly regulated, impede replication fork progression and cause genome instability (Castillo Bosch et al, 2014; Crabbe et al, 2004; Koole et al, 2014; Kruisselbrink et al, 2008; London et al, 2008; Lopes et al, 2011; Paeschke et al, 2013; Paeschke et al, 2011; Piazza et al, 2015; Piazza et al, 2010; Piazza et al, 2012; Ribeyre et al, 2009; Sabouri et al, 2014; Sarkies et al, 2012; Sarkies et al, 2010; Schiavone et al, 2014; Wu & Spies, 2016; Zimmer et al, 2016). The aim of this thesis was to identify novel G-quadruplex interacting proteins in Saccharomyces cerevisiae and to unravel their regulatory function at these structures to maintain genome integrity. Mms1 and Rtt101 were identified as G-quadruplex binding proteins in vitro via a pull-down experiment with subsequent mass spectrometry analysis. Rtt101, Mms1 and Mms22, which are all components of an ubiquitin ligase (Rtt101Mms1/Mms22), are important for the progression of the replication fork following fork stalling (Luke et al, 2006; Vaisica et al, 2011; Zaidi et al, 2008). The in vivo binding of endogenously tagged Mms1 to its target regions was analyzed genome-wide using chromatin-immunoprecipitation followed by deep-sequencing. Interestingly, Mms1 bound independently of Mms22 and Rtt101 to G-rich regions that have the potential to form G-quadruplex structures. In vitro, formation of G-quadruplex structures could be shown for the G-rich regions Mms1 bound to. This binding was observed throughout the cell cycle. Furthermore, the deletion of MMS1 caused replication fork stalling as evidenced by increased association of DNA Polymerase 2 at Mms1 dependent sites. A gross chromosomal rearrangement assay revealed that deletion of MMS1 results in a significantly increased genome instability at G-quadruplex motifs compared to G-rich or non-G-rich regions. Additionally, binding of the helicase Pif1, which unwinds G4 structures in vitro (Paeschke et al, 2013; Ribeyre et al, 2009; Sanders, 2010; Wallgren et al, 2016), to Mms1 binding sites was reduced in mms1 cells. The data presented in this thesis, together with published data, suggests a novel mechanistic model in which Mms1 binds to G-quadruplex structures and enables Pif1 association. This allows for replication fork progression and genome integrity. / Bei G-quadruplex Strukturen handelt es sich um stabile Sekundärstrukturen der DNA, welche das Fortschreiten der Replikationsgabel behindern und Genominstabilität verursachen können, falls sie nicht konsequent reguliert werden (Castillo Bosch et al, 2014; Crabbe et al, 2004; Koole et al, 2014; Kruisselbrink et al, 2008; London et al, 2008; Lopes et al, 2011; Paeschke et al, 2013; Paeschke et al, 2011; Piazza et al, 2015; Piazza et al, 2010; Piazza et al, 2012; Ribeyre et al, 2009; Sabouri et al, 2014; Sarkies et al, 2012; Sarkies et al, 2010; Schiavone et al, 2014; Wu & Spies, 2016; Zimmer et al, 2016). Ziel dieser Doktorarbeit war es, neue Proteininteraktionspartner dieser Strukturen in Saccharomyces cerevisiae zu identifizieren und zu untersuchen, wie diese Proteine die Strukturen regulieren um Genomstabilität zu gewährleisten. Mit Hilfe eines Pulldown Assays und anschließender massenspektrometrischer Analyse wurden Mms1 und Rtt101 in vitro als Interaktionspartner von G-quadruplex Strukturen identifiziert. Rtt101, Mms1 und Mms22, Komponenten der Ubiquitinligase Rtt101Mms1/Mms22, spielen eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Replikationsgabel, falls dieses durch Agenzien gehemmt wurde (Luke et al, 2006; Vaisica et al, 2011; Zaidi et al, 2008). Durch Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung wurden die Bindestellen von Mms1 identifiziert. Interessanterweise hat Mms1 genomweit an G-reiche Sequenzen gebunden. Diese G-reichen Sequenzen bildeten G-quadruplex Strukturen in vitro aus. Die Bindung von Mms1 erfolgte unabhängig von Rtt101 und Mms22 sowie während des gesamten Zellzyklus. Außerdem kam es zu einer Verlangsamung der Replikationsgabel in mms1 Zellen, was durch eine verstärkte Bindung der DNA Polymerase 2 nachgewiesen wurde. Ein gross chromsomal rearrangement assay zeigte, dass die Genominstabilität in mms1 Zellen signifikant erhöht ist, wenn G-quadruplex Motive, im Vergleich zu nicht-G-reichen oder G-reichen Kontrollregionen, vorhanden sind. Zudem war die Bindung der Helikase Pif1, welche G-quadruplex Strukturen in vitro entwindet (Paeschke et al, 2013; Ribeyre et al, 2009; Sanders, 2010; Wallgren et al, 2016), stark reduziert, wenn Mms1 fehlte. Mit Hilfe der in dieser Doktorarbeit gewonnenen Ergebnisse, sowie mit Hilfe publizierter Daten, lässt sich ein Model postulieren, in welchem Mms1 an G-quadruplexe bindet und somit die Bindung von Pif1 ermöglicht. Dadurch werden das Fortschreiten der Replikationsgabel und die Genomstabilität gewährleistet.

A continuous arms race between the development of novel antibiotics and the evolution of corresponding resistance mechanisms in bacteria has been observed, since antibiotic agents like arsphenamines (e.g. Salvarsan, developed by Paul Ehrlich [1]), sulphonamides (e.g. Prontosil, Gerhard Domagk [2]) and penicillin (Alexander Fleming [3]) were first applied to effectively cure bacterial infections in the early 20th century. The rapid emergence of resistances in contrast to the currently lagging discovery of antibiotics displays a severe threat to human health. Some serious infectious diseases, such as tuberculosis or melioidosis, which were either thought to be an issue only in Third-World countries in case of tuberculosis, or regionally restricted with respect to melioidosis, are now on the rise to expand to other areas. In contrast, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is already present in clinical setups all over the world and causes severe infections in immunocompromised patients. Thus, there is an urgent need for new and effective antimicrobial agents, which impair vital functions of the pathogen’s metabolism. One central metabolic pathway is represented by the bacterial fatty-acid synthesis pathway (FAS II), which is essential for the synthesis of long and branched-chain fatty acids, as well as mycolic acids. These substances play a major role as modulating components of the properties of the most important protective barrier – the cell envelope. The integrity of the bacterial cell wall and the associated membrane(s) is crucial for cell growth and for protection against physical strain, intrusion of antibiotic agents and regulation of uptake of ions and other small molecules. Thus, this central pathway represents a promising target for antibiotic action against pathogens to combat infectious diseases. The last and rate-limiting step is catalysed by the trans-2-enoyl-ACP reductase (ENR) FabI or InhA (in mycobacteria), which has been demonstrated to be a valuable target for drug design and can be addressed, amongst others, by diphenyl ether (DPE) compounds, derived from triclosan (TCL) – the first one of this class which was discovered to bind to ENR enzymes [4, 5]. Based on this scaffold, inhibitors containing different combinations of substituents at crucial positions, as well as a novel type of substituent at position five were investigated regarding their binding behaviour towards the Burkholderia pseudomallei and Mycobacterium tuberculosis ENR enzymes bpFabI and InhA, respectively, by structural, kinetic and in-vivo experiments. Generally, substitution patterns modulate the association and dissociation velocities of the different ENR inhibitors in the context of the two-step slow-onset binding mechanism, which is observed for both enzymes. These alterations in the rapidity of complex formation and decomposition have a crucial impact on the residence time of a compound and hence, on the pharmacokinetic properties of potential drug candidates. For example, the substituents at the 2’-position of the DPE scaffold influence the ground- and transition state stability during the binding process to bpFabI, whereas 4’-substituents primarily alter the transition state [6]. The novel triazole group attached to the 5-position of the scaffold, targeting the hydrophobic part of the substrate-binding pocket in InhA, significantly enhances the energy barrier of the transition state of inhibitor binding [7] and decelerates the association- as well as the dissociation processes. Combinations with different substituents at the 2’-position can enhance or diminish this effect, e.g. by ground-state stabilisation, which will result in an increased residence time of the respective inhibitor on InhA. Further structural investigations carried out in this work, confirm the proposed binding mode of a customised saFabI inhibitor [8], carrying a pyridone moiety on the DPE scaffold to expand interactions with the protein environment. Structural and preliminary kinetic data confirm the binding of the same inhibitor to InhA in a related fashion. Comparisons with structures of the ENR inhibitor AFN-1252 [9] bound to ENR enzymes from other organisms, addressing a similar region as the pyridone-moiety of the DPE inhibitor, suggest that also the DPE inhibitor bears the potential to display binding to homologues of saFabI and InhA and may be optimised accordingly. Both of the newly investigated substituents, the pyridone moiety at the 4’-position as well as the 5-triazole substituent, provide a good starting point to modify the DPE scaffold also towards improved kinetic properties against ENR enzymes other than the herein studied and combining both groups on the DPE scaffold may have beneficial effects. The understanding of the underlying binding mechanism is a crucial factor to promote the dedicated design of inhibitors with superior pharmacokinetic characteristics. A second target for a structure-based drug-design approach is the interaction surface between ENR enzymes and the acyl-carrier protein (ACP), which delivers the growing acyl chain to each distinct enzyme of the dissociated FAS-II system and presumably recognises its respective interaction partner via electrostatic contacts. The interface between saACP and saFabI was investigated using different approaches including crosslinking experiments and the design of fusion constructs connecting the ACP and the FabI subunits via a flexible linker region of varying lengths and compositions. The crosslinking studies confirmed a set of residues to be part of the contact interface of a previously proposed complex model [10] and displayed high crosslinking efficiency of saACP to saFabI when mutated to cysteine residues. However, crystals of the complex obtained from either the single components, or of the fusion constructs usually displayed weak diffraction, which supports the assumption that complex formation is highly transient. To obtain ordered crystals for structural characterisation of the complex it is necessary to trap the complex in a fixed state, e.g. by a high-affinity substrate attached to ACP [11], which abolishes rapid complex dissociation. For this purpose, acyl-coupled long-residence time inhibitors might be a valuable tool to elucidate the detailed architecture of the ACP-FabI interface. This may provide a novel basis for the development of inhibitors that specifically target the FAS-II biosynthesis pathway. / Seit Beginn der Anwendung antibiotischer Substanzen wie Arsphenaminen, z.B. Salvarsan, entwickelt von Paul Ehrlich [1], Sulfonamiden, z.B. Prontosil, dessen antibakterielle Wirksamkeit durch Gerhard Domagk nachgewiesen wurde [2], oder des von Alexander Fleming entdeckten Penicillins [3] zur effektiven Bekämpfung von Infektionskrankheiten Anfang des 20. Jahrhunderts findet ein kontinuierliches Wettrüsten zwischen der Entstehung von Antibiotikaresistenzen in Bakterien und der Entwicklung neuer Antibiotika statt. Vor allem die zügige Entstehung von Resistenzen im Gegensatz zum eher stockenden Fortschritt der Entdeckung neuer Antibiotika stellt ein ernstzunehmendes Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Einige stark lebensbedrohliche Infektionskrankheiten, darunter Tuberkulose und Melioidose, erfahren dadurch eine erhöhte Verbreitung. Ein Anstieg der Zahl der Tuberkuloseerkrankungen in Gebieten, in denen die Krankheit bereits als ausgerottet galt, beispielsweise in Europa; oder im Falle der Melioidose, eine Verbreitung in Gebiete, in denen die Krankheitserreger natürlicherweise nicht vorkommen; sind u.a. die Folgen fehlender Wirkstoffe zur Bekämpfung resistenter Stämme. Methicillinresistente Staphylococcus-aureus- (MRSA-) Stämme sind hingegen bereits fast weltweit in Krankenhäusern verbreitet und gelten dort als Quelle schwerer Infektionen, die vor allem für Patienten mit geschwächtem Immunsystem eine ernsthafte Bedrohung darstellen. Die mannigfaltigen Vorkommen resistenter Erreger und die eingeschränkten Behandlungsmöglichkeiten dadurch verursachter Infektionen machen die Entwicklung neuer, wirksamer Antibiotika dringend notwendig. Ein zentraler Stoffwechselweg der Bakterien ist die Fettsäurebiosynthese II, die im Hinblick auf die Herstellung lang- und verzweigtkettiger Fettsäuren sowie von Mykolsäuren essentiell ist. Die Zusammensetzung der Fettsäuren trägt maßgeblich zur Funktionsfähigkeit der unentbehrlichen Schutzbarriere der Zelle – nämlich der Zellhülle – bei. Eine intakte Zellwand und deren assoziierte Membranen schützen die Zelle vor physikalischem Stress, vor dem Eindringen antibiotischer Substanzen und regulieren die Aufnahme anderer Kleinmoleküle und Ionen. Genau aus diesem Grunde stellt die Fettsäurebiosynthese ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Antibiotika dar. Die Enoyl-ACP-Reduktase (ENR), welche den letzten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Synthesezyklus katalysiert, wurde als hervorragendes Zielmolekül identifiziert und wird unter anderem von Diphenylethern gehemmt. Diese Verbindungen sind von Triclosan abgeleitet, dessen Bindung an ENR-Enzyme als erstem Vertreter dieser Stoffklasse nachgewiesen werden konnte [4, 5]. Basierend auf dem Diphenylethergrundgerüst von Triclosan wurden Inhibitoren mit unterschiedlichen Substitutionsmustern bezüglich ihrer Bindungseigenschaften an die ENR-Enzyme von Burkholderia pseudomallei (bpFabI) und Mycobacterium tuberculosis (InhA) untersucht. Kritische Positionen dieses Grundgerüstes wurden mit verschiedenen, chemischen Gruppen versehen und die Bindung an diese beiden Enzyme anschließend strukturell, kinetisch und am lebenden Organismus charakterisiert. In beiden Fällen üben die Substitutionsmuster einen beträchtlichen Einfluss auf die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten der verschiedenen Inhibitoren im Rahmen des verlangsamten Zweischrittassoziationsmechanismus aus, welche wiederum die Verweildauer des Inhibitors am Enzym und dessen pharmakokinetische Eigenschaften bestimmen. Die Beschaffenheit der 2‘-Substituenten beeinflusst beispielsweise die Stabilität des Grund- sowie des Übergangszustandes im Bindungsgeschehen an bpFabI, wohingegen 4‘-Substituenten hauptsächlich zu Stabilitätsänderungen im Übergangszustand beitragen [6]. Die Einführung des Triazolsubstituenten an der 5-Position des Diphenylethergerüsts führt zu einer signifikanten Erhöhung der Energiebarriere des Übergangszustandes im Bindungsprozess an InhA [7], was im Rückschluss zu einer ebenfalls verlangsamten Dissoziation des Enzym-Inhibitor-Komplexes führt. Zusätzlich wird dieser Effekt durch die Beschaffenheit des entsprechenden Substituenten an der 2‘-Position noch verstärkt oder abgeschwächt. Dies erfolgt beispielsweise durch eine Stabilisierung des Grundzustandes und eine daraus resultierende, verlängerte Verweildauer des Inhibitors am Enzym. Weitere, strukturelle Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten den vorgeschlagenen Bindungsmodus [8] des neuartigen, speziell auf das ENR-Enzym von Staphylococcus aureus (saFabI) zugeschnittenen Inhibitors „55JS“ (auch „SKTS1“) bestätigen. Dieser Diphenyletherinhibitor besitzt an der 4‘-Position einen Pyridonring, welcher die Wechselwirkungen mit dem Enzym verstärken soll. Aus den strukturellen und vorläufigen, kinetischen Daten geht hervor, dass dieser Inhibitor ebenfalls und in ähnlicher Weise an InhA bindet. Außerdem legt ein Vergleich mit Komplexstrukturen verschiedener ENRs in Verbindung mit AFN-1252 [9] die Vermutung nahe, dass auch 55JS an weitere ENR-Homologe binden könnte; denn jener Teil des AFN-1252-Inhibitors, der sich räumlich mit dem Pyridonring von 55JS überlagert, geht mit derselben Region im Protein ähnliche Wechselwirkungen ein. Es ist daher möglich, dass dieser Inhibitor das Potential birgt, durch entsprechende Optimierung als Wirkstoff gegen andere Pathogene zum Einsatz zu gelangen. Beide dieser neuartigen, funktionellen Gruppen, die Triazol- und die Pyridongruppe, stellen einen guten Ansatzpunkt für die Weiterentwicklung von Diphenylethern bezüglich verbesserter kinetischer Eigenschaften gegenüber ENR-Enzymen dar. Ein weiterer, interessanter Ansatz für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung ist durch die Interaktionsfläche zwischen ENR-Enzymen und dem Acyl-Carrier-Protein (ACP) gegeben. ACP transportiert die naszierende Acylkette von einem zum nächsten Enzym des dissoziierten Fettsäurebiosynthesezyklus, welche es wahrscheinlich anhand elektrostatischer Interaktionen erkennt. Die Kontaktfläche zwischen saACP und saFabI wurde hier mittels verschiedener Ansätze untersucht, die sowohl Crosslinking-Experimente als auch die Generierung von Fusionsproteinen umfassten. In den verschiedenen Fusionskonstrukten wurden das ACP- und das ENR-Protein durch eine flexible Aminosäurekette unterschiedlicher Längen und Zusammensetzungen miteinander verbunden. Durch die Crosslinking-Experimente konnten Aminosäuren identifiziert werden, welche einen Teil einer vorgeschlagenen Interaktionsfläche [10] ausmachen und tatsächlich eine hohe Vernetzungseffizienz aufwiesen. Proteinkristalle des Komplexes, die entweder beide Einzelkomponenten oder das Fusionsprotein enthielten, zeigten jedoch nur schwache Beugungsmuster. Diese Beobachtung deckt sich mit der Annahme, dass die Komplexbildung äußerst kurzlebig ist. Die intrinsische Flexibilität beider Proteine erhöht zusätzlich die Schwierigkeit, wohlgeordnete Kristalle zu erhalten. Es wird deshalb notwendig sein, den Komplex in einem fixierten Zustand einzufangen. Die Verwendung eines hochaffinen Substrates, welches die Dissoziation des Komplexes unterbindet, beispielsweise ein acylgekoppelter Inhibitor [11] mit langer Verweildauer am Enzym, könnte hier von großem Nutzen sein und es damit erlauben eine detaillierte Kenntnis der ACP-FabI-Interaktionsfläche zu erhalten, die neue Perspektiven für eine gezielte Entwicklung von Inhibitoren der Fettsäurebiosynthese II eröffnen könnten.